一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用。

背景技术

8-氧代鸟嘌呤是一种常见的由于活性氧引起的DNA氧化损伤，该损伤易引起基因突变，可使生命体的健康受到严重影响。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNAglycosylase,OGG)是DNA修复过程中的关键酶。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶既有N-端糖基化酶活性，也有AP(apurinic/apyrimidinic)-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下双链DNA上受损的嘌呤碱基，产生一个AP位点。AP-裂解酶活性可以切割AP位点的3′或5′端，产生一个具有3′和5′磷酸的碱基缺口。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶可识别并切除8-氧代鸟嘌呤，对机体DNA氧化损伤的修复有着重大的意义。近期研究还表明，8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶是多种疾病的重要生物标志物，如膀胱癌、胆囊癌、肺癌等。因此，快速准确地分析8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性具有重要意义。

传统的DNA糖基化酶检测方法有酶联免疫吸附法、凝胶电泳、放射性标记和色谱法等。这些方法由于具有放射性危害、复杂耗时等固有缺陷，难以满足目前的分析需求。而荧光法由于具有简单、安全、灵敏度高等独特优势，目前已广泛应用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性分析。然而，现有的荧光方法有一个难题，即方法的灵敏度总是与检测体系的复杂性成正比。具有高灵敏度的荧光检测方法往往需要使用到多种昂贵材料，导致检测成本高昂，操作流程复杂。如使用量子点的应用可使检测限(limit of detection,LOD)低至1.8×10

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明提供的该方法利用Lambda核酸外切酶(λexo)对底物结构的选择性以及8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶对8-氧代鸟嘌呤的识别切割作用，结合背景信号抑制探针对λexo副活性的抑制作用，构建了一种新的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶荧光测定方法来高灵敏度、简单、快速、低成本地检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的活性。

本发明是这样实现的，一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法，其特征在于，包括：

将λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的报告探针序列、含有8-氧代鸟嘌呤的背景信号抑制探针序列混合；背景信号抑制探针在8-氧代鸟嘌呤位点处被切割后，与报告探针在5’-荧光基团末端形成2-nt突出结构；

将混合液加热后逐渐冷却，之后，加入待测样品孵育；

孵育结束后加入λexo，进行酶切反应，之后进行荧光检测。在进行未知样品检测前，先利用已知浓度样品的荧光变化率建立标准曲线。

进一步地，所述含有荧光基团及猝灭基团的报告探针序列为：荧光基团-CCTCCACAGACACATAC-猝灭基团。

进一步地，所述荧光基团为FAM荧光基团、HEX荧光基团或VIC荧光基团中的任一种。荧光基团的5’-FAM末端可与被OGG切割后的背景信号抑制探针序列在5’-FAM末端形成2-nt的突出结构。

进一步地，所述猝灭基团为BHQ-1猝灭基团、BHQ-2猝灭基团和BHQ-3猝灭基团中的任一种。本发明中仅以FAM荧光基团和BHQ-1猝灭基团为例进行详细说明。

进一步地，所述含有8-氧代鸟嘌呤的背景信号抑制探针序列为TTATGGAGTATGTGTCTGTGGAoxoGGGTCGAGGTTTTTTTTTTCCTCGACCCTCCACAGACA，oxoG为8-氧代鸟嘌呤。所述背景信号抑制探针序列可形成用于抑制背景信号的茎环结构。

进一步地，将混合液加热至85℃，然后逐渐冷却至37℃，加入待测样品；在37℃下孵育；孵育时间为30min。

本发明还披露了如述的一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法在8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定中的应用。

本发明还披露了一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定试剂盒，包括：λexo缓冲液，含有荧光基团及猝灭基团的报告探针序列、含有8-氧代鸟嘌呤的背景信号抑制探针序列，λexo酶。

本发明还披露了如述的一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定试剂盒在8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定中的应用。该试剂盒的检测方法如上述。

由于检测限与检测信号与背景信号的差值呈正相关，抑制背景信号也可以实现更好的检测限。与优化信号放大效率相比，抑制背景信号可仅通过对探针结构进行设计来实现，无需构建复杂的体系，具有兼顾低成本与高灵敏度的优点，目前尚未有荧光检测方法将抑制背景信号应用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的快速检测。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明设计了一种基于背景信号抑制探针的荧光检测体系来检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的活性。这是第一个从降低背景信号的角度来设计的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶荧光检测体系。该检测方法灵敏度高(4.8×10

在现有设计中，荧光检测方法高灵敏度的实现依赖于优化信号放大效率。然而高信号放大效率的实现需要使用多种酶以及带有昂贵标记的核苷酸链，从而导致检测体系的高复程度，进而使得检测过程操作复杂、检测成本较高。一般认为，λexo仅切割具有5’-PO4的底物。本申请的发明人研究发现，λexo切割突出2个末端的5’-FAM结构具有更高的效率，且对于突出的2个碱基类型没有限制。本发明基于该发现设计了一种通过降低λexo所导致的背景信号来实现OGG高灵敏度检测的检测体系。检测体系由报告探针及背景信号抑制探针组成。报告探针为带有5’-FAM和3’-BHQ-1的单链脱氧核糖核酸。背景信号抑制探针为带有8-氧代鸟嘌呤标记的单链脱氧核糖核酸，其可形成茎环结构，且部分序列与报告探针互补，被OGG切割后可与报告探针在5’-FAM末端形成2-nt突出结构。

本发明所构建的检测体系中，报告探针中的5’-FAM被3’-BHQ-1猝灭，初始荧光信号较低。报告探针可与背景信号抑制探针形成双链脱氧核糖核酸，同时背景信号抑制探针自身可形成茎环结构，所形成空间效应和竞争性结合效应抑制了λexo的活性，使得背景信号保持在较低的水平。当样品中没有OGG时，茎环结构将不会被破坏，导致低荧光信号。当样品中有OGG时，背景信号抑制探针在8-氧代鸟嘌呤位点处被切割，茎环结构被破坏，同时与报告探针在5’-FAM末端形成2-nt突出结构。λexo可高亲和性结合这一结构并快速切割报告探针，从而使FAM和BHQ-1分开并使得荧光信号上升。由于报告探针过量，这一个切割过程可循环进行，从而导致强荧光信号。随着体系中OGG活性的增加，被切割的背景信号抑制探针将更多，从而使更多的报告探针被切割，产生更强的荧光信号。因此，荧光增加的速率与OGG的活性有关且与OGG浓度之间呈良好的线性关系。

附图说明

图1是本发明的设计原理示意图；

图2是本发明的方法检测不同浓度OGG的荧光响应及测定OGG的线性关系图

图3是本发明的方法检测OGG的选择性，OGG浓度为1U/mL，其余干扰物的浓度为10U/mL，牛血清白蛋白(BSA)为0.4mg/mL；

图4是本发明的方法检测实际样(子宫内膜癌细胞裂解液)中的OGG活性，细胞数分别为0、20、50、150、200、300、500。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用，本发明设计了背景信号抑制探针序列，其序列为SEQ ID NO.1所示TTATGGAGTATGTGTCTGTGGAoxoGGGTCGAGGTTTTTTTTTTCCTCGACCCTCCACAGACA，oxoG为8-氧代鸟嘌呤，该序列可形成用于抑制背景信号的茎环结构。荧光报告探针序列为FAM-CCTCCACAGACACATAC-BHQ，荧光探针的5’-FAM末端可与被OGG切割后的背景信号抑制探针序列在5’-FAM末端形成2-nt的突出结构。

原理示意图见图1所示：当样品中没有OGG时，报告探针可与背景信号抑制探针形成双链脱氧核糖核酸，同时背景信号抑制探针自身可形成茎环结构，所形成空间效应和竞争性结合效应抑制了λexo的活性，报告探针中的5’-FAM被3’-BHQ-1猝灭，导致低荧光信号。当样品中有OGG时，背景信号抑制探针在8-氧代鸟嘌呤位点处被切割，茎环结构被破坏，同时与报告探针在5’-FAM末端形成2-nt突出结构。λexo可高亲和性结合这一结构并快速切割报告探针，从而使FAM和BHQ-1分开并使得荧光信号上升。详细技术方案如下实施例所示。

实施例

1、灵敏度

将DNA干粉(即报告探针和背景信号抑制探针)溶于100μL的TE缓冲液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0)中，在NanoDrop 2000UV–vis分光光度计(ThermoFisherScientific)测定浓度，用水将DNA溶液稀释到2.5μmol/L，储存在4℃下。

在200μL Eppendorf管中分别加入2μL×2.5μM报告探针，2μL×0.125μM背景信号抑制探针，5μL 10×λexo缓冲液(市购λexo缓冲液成分为：67mM Glycine-KOH,2.5mMMgCl2,50μg/ml BSA,pH 9.4，25℃)，用去离子水将总体积调至30μL后混合均匀。将溶液加热至85℃，然后逐渐冷却至37℃。后同时分别挂壁加入2μL OGG(0U/mL、0.025U/mL、0.05U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL)，用去离子水将总体积调至48μL，然后混合均匀。把溶液置于37℃下孵育30min。孵育后，挂壁加入2μl×250U/mL的λexo酶，混合均匀，然后将Eppendorf管放入FQD-16A实时荧光PCR，在37℃下进行荧光测量，每10s一个周期，记录荧光强度150次，增益为12，发射波长为582nm，激发波长为485nm。曲线的斜率即为荧光上升速率。

结果如图2所示，基于图2中的结果，使用线性回归，线性范围为0.001至0.1U/mL，检测限LOD为4.8×10

2、选择性

在200μL Eppendorf管中分别加入2μL×2.5μM报告探针，2μL×0.125μM背景信号抑制探针，5μL 10×λexo缓冲液，用去离子水将总体积调至30μL后混合均匀。将溶液加热至85℃，然后逐渐冷却至37℃。后同时分别挂壁加入2μL OGG、T7 exo、DNase I、UDG、APE I、BSA，用去离子水将总体积提高到48μL，然后混合均匀。把溶液置于37℃下孵育30min。孵育后，挂壁加入2μl×250U/mL的λexo酶，混合均匀，然后用上述检测条件进行荧光检测。

结果如图3所示，OGG浓度为1U/mL，其余干扰物的浓度为10U/mL，牛血清白蛋白(BSA)为0.4mg/ml。该实验结果证明本发明的方法受其他种类蛋白的干扰程度低，前面的干扰物有内切酶，外切酶和不相关的酶，BSA为非特异性蛋白。

3、应用于实际样本(子宫内膜癌细胞裂解液)

在200μL Eppendorf管中分别加入2μL×2.5μM报告探针，2μL×0.125μM背景信号抑制探针，5μL 10×λexo缓冲液，用去离子水将总体积调至30μL后混合均匀。将溶液加热至85℃，然后逐渐冷却至37℃。后同时分别挂壁加入2μL不同细胞数的细胞裂解液(0、20、50、150、200、300、500)，用去离子水将总体积提高到48μL，然后混合均匀。把溶液置于37℃下孵育30min。孵育后，加入2μl×250U/mL的λexo酶，混合均匀，然后用上述检测条件进行荧光检测。

结果如图4所示，结果说明：OGG的活性在0-500的细胞数范围内表现出良好的线性。本方法可检测低至4个细胞(3σ/K)的OGG活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttatggagta tgtgtctgtg gagggtcgag gttttttttt tcctcgaccc tccacagaca 60

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctccacaga cacatac 17