用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法。

背景技术

靶向肿瘤相关抗原的治疗性抗体可以通过不同的途径来杀伤肿瘤细胞，主要的机制包括：(1)抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)；(2)补体依赖的细胞毒作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC)；(3)抗体依赖性细胞吞噬作用(Antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP)；(4)抗体直接诱导细胞凋亡。其中，ADCC的作用机制是抗体的Fab(Fragmentantigen-binding region)段结合肿瘤细胞的抗原表位，其Fc(Fragment crystallizableregion)段与杀伤细胞如NK细胞、巨噬细胞等表面的Fc受体(Fc receptor，FcR)结合，介导杀伤肿瘤细胞，活化的NK细胞能够释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质，直接杀伤肿瘤靶细胞；CDC的作用机制是抗体的Fab段结合肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与补体蛋白C1q结合，激活C2-C9补体系统，在肿瘤细胞表面形成攻膜复合物，导致肿瘤细胞的裂解；ADCP的作用机制是基于一种具有吞噬潜能的效应细胞(如：巨噬细胞、单核细胞)内吞靶细胞(如：肿瘤细胞)的过程，抗体通过与其抗原识别结合到靶细胞上，随后将吞噬细胞与其Fc段结合到靶细胞上，一旦与吞噬细胞的FcR结合，目标细胞即被吞噬，吞噬体与溶酶体融合并降解，这个过程还导致效应细胞产生可溶性因子，帮助启动和驱动免疫反应。

ADCC、CDC和ADCP效应是抗体药物发挥杀伤肿瘤作用的重要机制，基于这一作用机制，研发者们已经研制出识别不同分子靶点的单克隆抗体药物，从而诱导细胞毒性免疫效应细胞用于清除肿瘤细胞或病毒感染的细胞。治疗性抗体药物的临床疗效通常取决于Fab和Fc介导的生物学功能的组合，在抗体药物开发的过程中，必须要表征候选抗体药物的关键质量属性(CQA)，包括候选抗体药物与靶标结合的强度以及与患者免疫系统结合程度，以引起ADCC/CDC/ADCP作用，进而降低药物在使用过程中的风险。因此，检测抗体药物是否具有ADCC/CDC/ADCP作用生物学活性，并进一步分析抗体药物的ADCC/CDC/ADCP作用生物学活性的强弱已经成为抗体药物研发及其质量控制过程中至关重要的一步，目前，已建立了多种抗体药物ADCC、CDC生物学活性测定方法，如基于外周血单个核细胞(PBMC)的检测方法、基于细胞报告基因的生物检测方法等，但是对抗体药物ADCP生物学活性测定的研究仍然比较局限，目前抗体药物ADCP生物学活性测定主要依赖于原代免疫细胞分离，体外分化，进而测定靶细胞的杀伤或吞噬效应，这种传统的测定方法高度依赖供体原代细胞，方法复杂，费时费力，价格昂贵，且可重复性较差，因此，亟需开发出一种快速、灵敏的检测抗体药物ADCP生物学活性的方法。

鉴于此，为了解决目前本领域面临的上述问题，本发明建立了一种新型的用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法，本发明首先构建了一种含有CD32a(FcγRIIa)胞外结构域和FcεRIγ胞内结构域的融合蛋白，在此基础上，构建了稳定表达CD32a-FcεRIγ融合蛋白受体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶的效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ，将Raji细胞用作靶细胞，用于抗体药物ADCP生物学活性的测定，该方法无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，操作简单，试验周期短，检测结果稳定可靠，专属性强，准确度高，可用于单克隆抗体产品的批次放行、稳定性检测和生物类似药的比较中。

发明内容

为解决现有技术存在的缺少有效的抗体药物ADCP生物学活性测定方法这一问题，本发明提供了一种用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法，该方法相对于目前本领域常用的传统方法而言，具有无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，操作简单，试验周期短，检测结果稳定可靠，专属性强，准确度高等优点，且可用于单克隆抗体产品的批次放行、稳定性检测和生物类似药的比较中。

本发明所述的抗体药物ADCP生物学活性的测定方法的原理：构建了稳定表达CD32a-FcεRIγ融合蛋白受体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶的效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ，将Raji细胞用作靶细胞，抗体的Fab段识别靶细胞上的靶抗原表位(CD20)，同时，抗体的Fc段与效应细胞上的CD32a结合，导致ADCP作用机制通路的激活，转录因子NFAT启动荧光素酶报告基因的表达，加入荧光底物后产生化学发光，根据荧光素酶的表达量与抗体的浓度拟合剂量效应曲线，得到半数有效浓度EC50值，进而得到抗体药物的ADCP生物学活性。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)构建pGL4[NFAT/puro]质粒和pcDNA3.1(+)[CD32a-FcεRIγ/G418]质粒；

(2)将步骤(1)中所述的质粒转染到Jurkat细胞中；

(3)使用嘌呤霉素和G418进行筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；

(4)通过预实验以及流式细胞仪筛选得到阳性克隆细胞株；

优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电穿孔转染法；

优选地，步骤(3)中所述的嘌呤霉素和G418的浓度分别为1μg/mL、400μg/mL。

进一步，所述CD32a-FcεRIγ为本发明构建的一种融合蛋白。

进一步，所述CD32a-FcεRIγ为含有CD32a(FcγRIIa)胞外结构域和FcεRIγ胞内结构域的融合蛋白。

本发明的第二方面提供了一种稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞。

进一步，所述细胞由本发明第一方面所述的构建方法构建得到的。

本发明的第三方面提供了一种融合蛋白受体。

进一步，所述融合蛋白受体为CD32a-FcεRIγ；

优选地，所述融合蛋白受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

更优选地，所述融合蛋白受体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步，所述CD32a-FcεRIγ为含有CD32a(FcγRIIa)胞外结构域和FcεRIγ胞内结构域的融合蛋白。

本发明的第四方面提供了一种抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的测定方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)构建稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞；

(2)将抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品预稀释到一定的初始工作浓度，再进行等比例稀释；

(3)将步骤(2)中稀释后的抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品加入到一定比例的靶细胞和效应细胞中，进行孵育；

(4)加入荧光底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗体药物的ADCP生物学活性；

优选地，步骤(4)中所述的四参数曲线是在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，通过数据处理拟合得到的四参数曲线；

更优选地，通过比较参比品与样品四参数曲线的半数有效浓度EC50值，得出样品的相对生物学效价。

进一步，以所述参比品或样品浓度的对数值(Log[M])为横坐标，以诱导倍数(FI＝RLU[反应均值-背景均值]/RLU[阴性对照均值-背景均值])为纵坐标，对剂量效应曲线进行四参数拟合，计算样品的半数有效浓度EC50值。

进一步，根据各样品的半数有效浓度EC50值，以100％样品作为参比品，按照以下公式：相对生物学效价(％)＝参比品EC50/样品EC50×100％计算样品的相对生物学效价。

进一步，所述步骤(1)中稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞采用本发明第一方面所述的构建方法构建得到的；

优选地，所述步骤(2)中抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品的初始工作浓度为5×10

进一步，所述步骤(3)中的靶细胞为表达CD20的细胞；

优选地，所述靶细胞包括Raji细胞、WIL2-S细胞、SU-DHL-10细胞、DOHH2细胞、BJAB细胞、A20细胞、SU-DHL-4细胞、P30/OHK细胞、P116细胞、MUTZ-3细胞、SUPB15细胞、SNK6细胞、SK-MEL-28细胞、C8161细胞、RPMI-7951细胞；

更优选地，所述靶细胞为Raji细胞；

优选地，所述步骤(3)中的靶细胞和效应细胞的比例为1:1-10；

更优选地，所述步骤(3)中的靶细胞和效应细胞的比例为1:8；

最优选地，每孔靶细胞数量为1×10

进一步，所述步骤(3)中孵育的时间为3-20h；

优选地，所述步骤(3)中孵育的时间为6h；

优选地，所述步骤(3)中孵育的条件为37℃、5％CO

本发明的第五方面提供了一种抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的评价体系。

进一步，所述评价体系包括如下组分：抗CD20单克隆抗体药物样品、参比品、稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞、靶细胞、荧光底物、稀释缓冲液；

优选地，所述稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞是采用本发明第一方面所述的构建方法构建得到的；

优选地，所述CD32a-FcεRIγ为本发明第三方面所述的融合蛋白受体；

优选地，所述靶细胞为表达CD20的细胞；

更优选地，所述靶细胞包括Raji细胞、WIL2-S细胞、SU-DHL-10细胞、DOHH2细胞、BJAB细胞、A20细胞、SU-DHL-4细胞、P30/OHK细胞、P116细胞、MUTZ-3细胞、SUPB15细胞、SNK6细胞、SK-MEL-28细胞、C8161细胞、RPMI-7951细胞；

最优选地，所述靶细胞为Raji细胞；

优选地，所述评价体系包括如下步骤：

(1)将抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品预稀释到一定的初始工作浓度，再进行等比例稀释；

(2)将步骤(1)中稀释后的抗CD20单克隆抗体药物样品及参比品加入到一定比例的靶细胞和效应细胞中，进行孵育；

(3)加入荧光底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线，通过比较参比品与样品四参数曲线的半数有效浓度EC50值，得出样品的相对生物学效价；

优选地，所述评价体系的评价指标包括抗体药物的相对生物学效价；

更优选地，若得到的抗体药物相对生物学效价的数值为70％-130％，则表明所述抗体药物的ADCP生物学活性良好。

进一步，所述步骤(1)中抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品的初始工作浓度为5×10

进一步，所述步骤(2)中的靶细胞和效应细胞的比例为1:1-10；

更优选地，所述步骤(2)中的靶细胞和效应细胞的比例为1:8；

最优选地，每孔靶细胞数量为1×10

进一步，所述步骤(2)中孵育的时间为3-20h；

优选地，所述步骤(2)中孵育的时间为6h；

优选地，所述步骤(2)中孵育的条件为37℃、5％CO

本发明的第六方面提供了一种用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞、靶细胞、荧光底物、稀释缓冲液、参比品；

优选地，所述稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞是采用本发明第一方面所述的构建方法构建得到的；

优选地，所述靶细胞为表达CD20的细胞；

更优选地，所述靶细胞包括Raji细胞、WIL2-S细胞、SU-DHL-10细胞、DOHH2细胞、BJAB细胞、A20细胞、SU-DHL-4细胞、P30/OHK细胞、P116细胞、MUTZ-3细胞、SUPB15细胞、SNK6细胞、SK-MEL-28细胞、C8161细胞、RPMI-7951细胞；

最优选地，所述靶细胞为Raji细胞。

本发明的第七方面提供了如下任一方面的应用：

(1)本发明第一方面所述的构建方法在制备稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞中的应用；

(2)本发明第二方面所述的稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞在制备测定针对不同靶点的单克隆抗体药物ADCP生物学活性的产品中的应用；

(3)本发明第三方面所述的融合蛋白受体在抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性检测中的应用；

(4)本发明第三方面所述的融合蛋白受体在制备用于检测抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的效应细胞中的应用；

优选地，所述效应细胞为本发明第二方面所述的细胞；

(5)本发明第四方面所述的测定方法在抗CD20单克隆抗体药物的质量控制中的应用；

(6)本发明第五方面所述的评价体系在抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性评价中的应用；

(7)本发明第六方面所述的试剂盒在抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性测定中的应用；

优选地，应用(2)中所述的靶点包括CD20、PD-1、HER2、CD3、CD19、CD123、CD138、CD38、CD33、CD30、CD28、CD27、CD22、IL13Rα2、CTLA4、CEA、CS1、NY-ESO-1、MAGE A3、ROR1、BCMA、GD2；

更优选地，应用(2)中所述的靶点为CD20。

本发明构建的稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞不仅能够用于抗CD20单克隆抗体产品或类似药物的放行和稳定性检测中，而且可用于评估针对其他靶点的单克隆抗体的ADCP生物学活性，所述的其他靶点包括PD-1、HER2、CD3、CD19、CD123、CD138、CD38、CD33、CD30、CD28、CD27、CD22、IL13Rα2、CTLA4、CEA、CS1、NY-ESO-1、MAGEA3、ROR1、BCMA、GD2，因此，稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞在测定针对其他靶点的单克隆抗体ADCP生物学活性中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明的优点和有益效果：

(1)传统的抗体药物ADCP生物学活性测定主要依赖于原代免疫细胞分离，体外分化，进而测定靶细胞的杀伤或吞噬效应，这种传统的测定方法高度依赖供体原代细胞，方法复杂，费时费力，价格昂贵，且可重复性较差；

本发明建立的一种新型的用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，操作简单，试验周期短，且检测结果稳定可靠，专属性强，准确度高。

(2)本发明建立的方法可用于测定抗CD20单克隆抗体产品的ADCP生物学活性，用于抗CD20单克隆抗体产品的批次放行、稳定性检测和生物类似药的比较中，具有很好的应用前景。

(3)本发明构建的稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞(Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ)不仅可用于测定抗CD20单克隆抗体产品的ADCP生物学活性，用于抗CD20单克隆抗体产品的批次放行、稳定性检测和生物类似药的比较中，而且能够应用于针对其他靶点的单克隆抗体药物ADCP生物学活性的评估中。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示流式分析Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ效应细胞表达情况的结果图；

图2显示抗CD20单抗ADCP生物学活性测定中工作浓度范围和稀释比例优化的结果图；

图3显示抗CD20单抗ADCP生物学活性测定中靶细胞密度、效靶比和诱导时间优化的结果图；

图4显示抗CD20单抗ADCP生物学活性测定得到的剂量效应曲线结果图；

图5显示抗CD20单抗ADCP生物学活性测定方法的专属性验证的结果图；

图6显示相对效价理论值和相对效价测定值拟合得到的回归直线结果图；

图7显示Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ效应细胞代次稳定性验证的结果图；

图8显示不同的抗CD20单抗的ADCP生物学活性测定得到的剂量效应曲线结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1构建稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ

1、实验材料

Raji细胞和Jurkat细胞购自于ATCC，所有细胞均在含有90％(v/v)RPMI1640和10％(v/v)胎牛血清(FBS)的培养基中培养；Bright-Glo

2、质粒构建

质粒pGL4[NFAT/puro]的构建：将三个重复的NFAT结合位点核酸序列全基因合成后，利用KPNI+XhoI双酶切合成核酸序列和载体进行连接，构建的质粒pGL4[NFAT/puro]的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

质粒pcDNA3.1(+)[CD32a-FcεRIγ/G418]的构建：全基因合成后，利用HindIII+XhaI双酶切基因和载体，然后将二者连接起来，构建的质粒pcDNA3.1(+)[CD32a-FcεRIγ/G418]的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3、Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ效应细胞的构建

采用电穿孔法(NEON

4、实验结果

实验结果显示，通过流式细胞分析证明了本发明构建的Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ高表达CD32a-FcεRIγ(见图1)，表明了所述效应细胞的成功构建。

实施例2抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性测定方法的优化

本实施例分别考察了测定方法中利妥昔单抗的工作浓度范围和不同的稀释比例、不同靶细胞(Raji)密度、不同效靶比(E:T)、不同诱导时间对测定结果的影响，进行了以下优化实验。

1、工作浓度范围和稀释比例的优化

将利妥昔单抗预稀释至10μg/mL(初始工作浓度为5000ng/mL)，然后按1:2、1:3、1:4、1:5的稀释比例依次稀释10次，进行实验，根据化学发光值拟合的剂量效应曲线，以选取最优的利妥昔单抗的工作浓度范围和最优的稀释比例。

结果显示，1:4的稀释比例下，0.076-5000ng/mL的工作浓度范围内，得到的剂量效应曲线较好(见图2)，因此，选择1:4作为最优的稀释比例，选择0.076-5000ng/mL作为最优的工作浓度范围。

2、靶细胞密度、效靶比和诱导时间的优化

将上述优化后得到的最优工作浓度范围和最优稀释比例引入到细胞密度、效靶比和诱导时间的优化方法中，采用正交设计方法设置了32组试验(2×4×4正交)，其中，靶细胞密度、效靶比、诱导时间分别为2、4、4。将靶细胞Raji以每孔5000和10000个的细胞密度接种于细胞培养板上，加入稀释缓冲液，然后，以每孔15000/30000、25000/50000、40000/80000和50000/100000的细胞密度接种效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ，以分别得到3:1、5:1、8:1和10:1的效靶比，分别培养3h、6h、8h、20h后进行读板。上述32组试验的信噪比(S/N)通过SPSS Statistics 24.0.0进行分析。

结果显示，在靶细胞的密度为1×10

实施例3抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性测定方法的建立

1、实验方法

(1)样品制备

抗CD20单抗(利妥昔单抗)以稀释液稀释至10μg/mL，再按照1:4倍系列稀释，设置10个浓度梯度，每个浓度2～3个复孔，50μL/孔加入到96孔白板中；

(2)制备靶细胞Raji悬液

收集生长状态良好的Raji细胞，离心弃上清，用稀释液重悬细胞后计数，将细胞密度调整为4×10

(3)制备效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ悬液

收集生长状态良好的Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ细胞，离心弃上清，用稀释液重悬细胞后计数，将细胞密度调整为3.2×10

(4)细胞铺板

将步骤(2)和步骤(3)中经稀释后的靶细胞和效应细胞按1:1的比例混合均匀，50μL/孔加入到96孔白板中；

(5)细胞孵育

37℃、5％CO

(6)读板

细胞板取出置于室温条件下平衡，加入荧光底物100μL/孔，室温5min后，采用多功能酶标仪测定各孔的荧光强度，以抗体浓度为横坐标，以FI值为纵坐标，拟合四参数S形曲线，其中，FI值的计算公式为：FI(诱导倍数)＝RLU(反应均值-背景均值)/RLU(阴性对照均值-背景均值)，阴性对照为以稀释液替代抗体(其余操作相同)的加样孔，背景为完全稀释液孔；

用以下公式：相对生物学效价(％)＝参比品EC50/样品EC50×100％计算样品的相对生物学效价。

2、实验结果

结果显示，所得的抗CD20单克隆抗体的剂量效应曲线见图4，所得数据在半对数坐标纸上呈典型的S型曲线。

实施例4方法学验证

本实施例根据ICH Q2(R1)指南对本发明所述的方法进行了专属性、准确度、线性、精密度、耐用性和代次稳定性分别进行了验证。

1、专属性

实验方法：在该实施例中，分别对效应细胞、靶细胞和抗体的专属性进行了验证(见表1)；

表1专属性验证

(1)靶细胞的专属性：以CD20(-)的BT474细胞及稀释缓冲液代替靶细胞Raji进行检测；

(2)效应细胞的专属性：以只转染NFAT-Luc不表达FcεR的Jurkat-NFAT细胞及稀释缓冲液代替效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ进行检测；

(3)抗体专属性：以抗PD-1的纳武利尤单抗(Nivolumab)、抗HER2的曲妥珠单抗(Trastuzumab)、变性的抗CD20的利妥昔单抗(Rituximab)、稀释缓冲液代替抗CD20的利妥昔单抗进行检测。

实验结果：实验结果显示，将靶细胞替换为不表达CD20的细胞或稀释缓冲液时，均未见任何剂量效应曲线，将效应细胞替换为只转染NFAT-Luc不表达FcεR的Jurkat-NFAT细胞或稀释缓冲液时，也没有任何剂量效应曲线，当用针对其他靶点的单抗或变性的抗CD20的利妥昔单抗或稀释缓冲液时，也不会显示出剂量效应曲线(见图5)，表明了本发明构建的抗体ADCP生物学活性测定方法对靶细胞、效应细胞和单抗均具有特异性，证明了本发明所构建的测定方法的专属性较好。

2、准确度

实验方法：将抗CD20的利妥昔单抗稀释至多个初始工作浓度，制备得到5个不同效价水平的样品，相对效价理论值分别为50％、75％、100％、125％和150％，以上样品均重复检测3次，以100％水平的样品作为计算相对效价的参比品，按照公式：回收率(％)＝相对效价测定值/相对效价理论值×100％，计算回收率以验证本发明所构建的方法的准确度。

实验结果：实验结果见表2，回收率在95.11％-108.98％内，RSD均在9％以下，表明了本发明所构建的抗体ADCP生物学活性测定方法具有较好的准确度。

表2准确度验证

3、线性

实验方法：根据本实施例准确度验证中得到的结果，以相对效价理论值为横坐标，以相对效价测定值为纵坐标，进行线性拟合，以验证本发明所构建的方法的线性。

实验结果：实验结果显示，相对效价理论值和相对效价测定值之间呈现良好的线性关系，相对效价理论值和相对效价测定值拟合得到的回归直线方程为Y＝1.126X-10.23，R

4、精密度

实验方法：以重复性和中间精密度作为验证精密度的参数，分别对本发明所构建的方法的重复性和中间精密度进行了验证，由2名实验操作人员在3天不同的时间内分别对100％效价水平的样品进行3次检测，以评估重复性、中间精度，进而验证本发明所构建的方法的精密度。

实验结果：实验结果显示，18次重复实验的RSD均在10％以下，表明了本发明构建的方法具有良好的重复性，板间、日间、实验操作人员间的RSD均在11％以下(见表3)，表明了本发明所述的方法具有较好的中间精密度，以上结果证明了本发明构建的抗体ADCP生物学活性测定方法具有较好的精密度。

表3精密度验证

5、耐用性

实验方法：为了评估耐用性，本发明进行了一系列实验，在固定其中一个实验参数的同时略微改变其中一个实验参数，对样品进行测试，并将相对效价与中间精度平均值的平均效价进行比较，以计算绝对偏差。

实验结果：结果显示，当靶细胞或效应细胞的接种密度在细胞数±15％或诱导时间±1h内时，绝对偏差均小于7％(见表4)，表明了本发明构建的抗体ADCP生物学活性测定方法具有较好的耐用性。

表4耐用性验证

6、代次稳定性

实验方法：连续培养Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ效应细胞，收集不同代次的效应细胞进行验证。

实验结果：实验结果显示，效应细胞分别为23代、33代、43代时，S/N相对稳定(见图7)，表明了本发明构建的效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ具有较好的代次稳定性。

实施例5抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性测定方法的实际应用1、实验方法

使用实施例1中所构建的Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ细胞作为效应细胞，使用Raji细胞作为靶细胞，采用优化并验证后的抗体ADCP生物学活性测定方法检测抗CD20单抗的ADCP生物学活性，所述抗CD20单抗包括利妥昔单抗(Rituximab)、利妥昔单抗的生物类似药(SBP of Rituximab)、奥法妥木单抗(Ofatumumab)、奥妥珠单抗(Obinutuzumab)。

2、实验结果

实验结果显示，用本发明构建的Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ细胞作为效应细胞，Raji细胞作为靶细胞，对不同的抗CD20单抗的ADCP生物学活性进行检测，均得到完整的S型剂量效应曲线(见图8)，且该方法还能够用于类似药物的ADCP生物学活性检测，表明了本发明建立的抗CD20单抗ADCP生物学活性测定方法具有较好的应用效果。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国食品药品检定研究院

<120> 用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法

<141> 2021-04-28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp

20 25 30

Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro

35 40 45

Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly

50 55 60

Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn

65 70 75 80

Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn

85 90 95

Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser

100 105 110

Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr

115 120 125

Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His

130 135 140

Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln

165 170 175

Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly

180 185 190

Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro

195 200 205

Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Glu Phe Pro Gln Leu Cys Tyr

210 215 220

Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu

225 230 235 240

Tyr Cys Arg Leu Lys Val Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser

245 250 255

Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln

260 265 270

Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln

275 280 285

<210> 2

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactatgg agacccaaat gtctcagaat gtatgtccca gaaacctgtg gctgcttcaa 60

ccattgacag ttttgctgct gctggcttct gcagacagtc aagctgcagc tcccccaaag 120

gctgtgctga aacttgagcc cccgtggatc aacgtgctcc aggaggactc tgtgactctg 180

acatgccagg gggctcgcag ccctgagagc gactccattc agtggttcca caatgggaat 240

ctcattccca cccacacgca gcccagctac aggttcaagg ccaacaacaa tgacagcggg 300

gagtacacgt gccagactgg ccagaccagc ctcagcgacc ctgtgcatct gactgtgctt 360

tccgaatggc tggtgctcca gacccctcac ctggagttcc aggagggaga aaccatcatg 420

ctgaggtgcc acagctggaa ggacaagcct ctggtcaagg tcacattctt ccagaatgga 480

aaatcccaga aattctccca tttggatccc accttctcca tcccacaagc aaaccacagt 540

cacagtggtg attaccactg cacaggaaac ataggctaca cgctgttctc atccaagcct 600

gtgaccatca ctgtccaagt gcccagcatg ggcagctctt caccaatggg ggaattccct 660

cagctctgct atatcctgga tgccatcctg tttctgtatg gaattgtcct caccctcctc 720

tactgtcgac tgaaggtaat ccaagtgcga aaggcagcta taaccagcta tgagaaatca 780

gatggtgttt acacgggcct gagcaccagg aaccaggaga cttacgagac tctgaagcat 840

gagaaaccac cacagtag 858

<210> 3

<211> 5640

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcctaactg gccggtaccg gaggaaaaac tgtttcatac agaaggcgtg gaggaaaaac 60

tgtttcatac agaaggcgtg gaggaaaaac tgtttcatac agaaggcgta gagggtatat 120

aatggaagct cgaattccag ctcgaggata tcaagatctg gcctcggcgg ccaagcttgg 180

caatccggta ctgttggtaa agccaccatg gaagatgcca aaaacattaa gaagggccca 240

gcgccattct acccactcga agacgggacc gccggcgagc agctgcacaa agccatgaag 300

cgctacgccc tggtgcccgg caccatcgcc tttaccgacg cacatatcga ggtggacatt 360

acctacgccg agtacttcga gatgagcgtt cggctggcag aagctatgaa gcgctatggg 420

ctgaatacaa accatcggat cgtggtgtgc agcgagaata gcttgcagtt cttcatgccc 480

gtgttgggtg ccctgttcat cggtgtggct gtggccccag ctaacgacat ctacaacgag 540

cgcgagctgc tgaacagcat gggcatcagc cagcccaccg tcgtattcgt gagcaagaaa 600

gggctgcaaa agatcctcaa cgtgcaaaag aagctaccga tcatacaaaa gatcatcatc 660

atggatagca agaccgacta ccagggcttc caaagcatgt acaccttcgt gacttcccat 720

ttgccacccg gcttcaacga gtacgacttc gtgcccgaga gcttcgaccg ggacaaaacc 780

atcgccctga tcatgaacag tagtggcagt accggattgc ccaagggcgt agccctaccg 840

caccgcaccg cttgtgtccg attcagtcat gcccgcgacc ccatcttcgg caaccagatc 900

atccccgaca ccgctatcct cagcgtggtg ccatttcacc acggcttcgg catgttcacc 960

acgctgggct acttgatctg cggctttcgg gtcgtgctca tgtaccgctt cgaggaggag 1020

ctattcttgc gcagcttgca agactataag attcaatctg ccctgctggt gcccacacta 1080

tttagcttct tcgctaagag cactctcatc gacaagtacg acctaagcaa cttgcacgag 1140

atcgccagcg gcggggcgcc gctcagcaag gaggtaggtg aggccgtggc caaacgcttc 1200

cacctaccag gcatccgcca gggctacggc ctgacagaaa caaccagcgc cattctgatc 1260

acccccgaag gggacgacaa gcctggcgca gtaggcaagg tggtgccctt cttcgaggct 1320

aaggtggtgg acttggacac cggtaagaca ctgggtgtga accagcgcgg cgagctgtgc 1380

gtccgtggcc ccatgatcat gagcggctac gttaacaacc ccgaggctac aaacgctctc 1440

atcgacaagg acggctggct gcacagcggc gacatcgcct actgggacga ggacgagcac 1500

ttcttcatcg tggaccggct gaagagcctg atcaaataca agggctacca ggtagcccca 1560

gccgaactgg agagcatcct gctgcaacac cccaacatct tcgacgccgg ggtcgccggc 1620

ctgcccgacg acgatgccgg cgagctgccc gccgcagtcg tcgtgctgga acacggtaaa 1680

accatgaccg agaaggagat cgtggactat gtggccagcc aggttacaac cgccaagaag 1740

ctgcgcggtg gtgttgtgtt cgtggacgag gtgcctaaag gactgaccgg caagttggac 1800

gcccgcaaga tccgcgagat tctcattaag gccaagaagg gcggcaagat cgccgtgaat 1860

tctcacggct tccctcccga ggtggaggag caggccgccg gcaccctgcc catgagctgc 1920

gcccaggaga gcggcatgga tagacaccct gctgcttgcg ccagcgccag gatcaacgtc 1980

taaggccgcg actctagagt cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca 2040

ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa 2100

tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca 2160

acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca 2220

agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcg ataaggatcc gtttgcgtat tgggcgctct 2280

tccgctgatc tgcgcagcac catggcctga aataacctct gaaagaggaa cttggttagc 2340

taccttctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 2400

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 2460

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 2520

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 2580

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 2640

ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 2700

caaaaagctc gattcttctg acactagcgc caccatgacc gagtacaagc ctaccgtgcg 2760

cctggccact cgcgatgatg tgccccgcgc cgtccgcact ctggccgccg ctttcgccga 2820

ctaccccgct acccggcaca ccgtggaccc cgaccggcac atcgagcgtg tgacagagtt 2880

gcaggagctg ttcctgaccc gcgtcgggct ggacatcggc aaggtgtggg tagccgacga 2940

cggcgcggcc gtggccgtgt ggactacccc cgagagcgtt gaggccggcg ccgtgttcgc 3000

cgagatcggc ccccgaatgg ccgagctgag cggcagccgc ctggccgccc agcagcaaat 3060

ggagggcctg cttgcccccc atcgtcccaa ggagcctgcc tggtttctgg ccactgtagg 3120

agtgagcccc gaccaccagg gcaagggctt gggcagcgcc gtcgtgttgc ccggcgtaga 3180

ggccgccgaa cgcgccggtg tgcccgcctt tctcgaaaca agcgcaccaa gaaaccttcc 3240

attctacgag cgcctgggct tcaccgtgac cgccgatgtc gaggtgcccg agggacctag 3300

gacctggtgt atgacacgaa aacctggcgc ctaatgatct agaaccggtc atggccgcaa 3360

taaaatatct ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgttc gaactagatg 3420

ctgtcgaccg atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg 3480

catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt 3540

gccggcagcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3600

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3660

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3720

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3780

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3840

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3900

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3960

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 4020

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 4080

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 4140

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 4200

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 4260

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4320

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 4380

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 4440

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agcggccgca 4500

aatgctaaac cactgcagtg gttaccagtg cttgatcagt gaggcaccga tctcagcgat 4560

ctgcctattt cgttcgtcca tagtggcctg actccccgtc gtgtagatca ctacgattcg 4620

tgagggctta ccatcaggcc ccagcgcagc aatgatgccg cgagagccgc gttcaccggc 4680

ccccgatttg tcagcaatga accagccagc agggagggcc gagcgaagaa gtggtcctgc 4740

tactttgtcc gcctccatcc agtctatgag ctgctgtcgt gatgctagag taagaagttc 4800

gccagtgagt agtttccgaa gagttgtggc cattgctact ggcatcgtgg tatcacgctc 4860

gtcgttcggt atggcttcgt tcaactctgg ttcccagcgg tcaagccggg tcacatgatc 4920

acccatatta tgaagaaatg cagtcagctc cttagggcct ccgatcgttg tcagaagtaa 4980

gttggccgcg gtgttgtcgc tcatggtaat ggcagcacta cacaattctc ttaccgtcat 5040

gccatccgta agatgctttt ccgtgaccgg cgagtactca accaagtcgt tttgtgagta 5100

gtgtatacgg cgaccaagct gctcttgccc ggcgtctata cgggacaaca ccgcgccaca 5160

tagcagtact ttgaaagtgc tcatcatcgg gaatcgttct tcggggcgga aagactcaag 5220

gatcttgccg ctattgagat ccagttcgat atagcccact cttgcaccca gttgatcttc 5280

agcatctttt actttcacca gcgtttcggg gtgtgcaaaa acaggcaagc aaaatgccgc 5340

aaagaaggga atgagtgcga cacgaaaatg ttggatgctc atactcgtcc tttttcaata 5400

ttattgaagc atttatcagg gttactagta cgtctctcaa ggataagtaa gtaatattaa 5460

ggtacgggag gtattggaca ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg 5520

ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac 5580

aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct 5640

<210> 4

<211> 6221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttgcca ccaccatgac tatggagacc caaatgtctc agaatgtatg 960

tcccagaaac ctgtggctgc ttcaaccatt gacagttttg ctgctgctgg cttctgcaga 1020

cagtcaagct gcagctcccc caaaggctgt gctgaaactt gagcccccgt ggatcaacgt 1080

gctccaggag gactctgtga ctctgacatg ccagggggct cgcagccctg agagcgactc 1140

cattcagtgg ttccacaatg ggaatctcat tcccacccac acgcagccca gctacaggtt 1200

caaggccaac aacaatgaca gcggggagta cacgtgccag actggccaga ccagcctcag 1260

cgaccctgtg catctgactg tgctttccga atggctggtg ctccagaccc ctcacctgga 1320

gttccaggag ggagaaacca tcatgctgag gtgccacagc tggaaggaca agcctctggt 1380

caaggtcaca ttcttccaga atggaaaatc ccagaaattc tcccatttgg atcccacctt 1440

ctccatccca caagcaaacc acagtcacag tggtgattac cactgcacag gaaacatagg 1500

ctacacgctg ttctcatcca agcctgtgac catcactgtc caagtgccca gcatgggcag 1560

ctcttcacca atgggggaat tccctcagct ctgctatatc ctggatgcca tcctgtttct 1620

gtatggaatt gtcctcaccc tcctctactg tcgactgaag gtaatccaag tgcgaaaggc 1680

agctataacc agctatgaga aatcagatgg tgtttacacg ggcctgagca ccaggaacca 1740

ggagacttac gagactctga agcatgagaa accaccacag tagtctagag ggcccgttta 1800

aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 1860

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 1920

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 1980

ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 2040

tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg 2100

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 2160

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 2220

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 2280

gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 2340

atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 2400

ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 2460

gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta 2520

attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 2580

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 2640

ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 2700

ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 2760

tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag 2820

aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt 2880

atatccattt tcggatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 2940

gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 3000

gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 3060

ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 3120

gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 3180

actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 3240

tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 3300

acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 3360

cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 3420

ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 3480

gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 3540

ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 3600

acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 3660

ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 3720

tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 3780

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 3840

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact 3900

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 3960

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 4020

atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 4080

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 4140

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 4200

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 4260

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 4320

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 4380

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 4440

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 4500

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 4560

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 4620

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 4680

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 4740

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 4800

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 4860

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 4920

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 4980

gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 5040

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 5100

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 5160

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 5220

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 5280

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 5340

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 5400

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 5460

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 5520

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 5580

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 5640

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 5700

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 5760

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 5820

gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 5880

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 5940

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 6000

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 6060

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 6120

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 6180

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 6221