一种利用田菁固氮根瘤菌促进茎瘤芥根系结瘤固氮的方法

技术领域

本发明涉及一种作物栽培领域，具体而言，涉及一种茎瘤芥的栽培方法，更具体一种利用田菁固氮根瘤菌促进茎瘤芥根系结瘤固氮的方法。

背景技术

茎瘤芥(Brassicajunceavar.tumida Tsenet Lee)属于十字花科植物，为双子叶植物纲、芸薹属。中国种植芥菜的起源地为北方阴冷地区，后由北方地区迁移至四川地区种植。四川领域种植芥菜的历史已有100余年，俗称“青菜头”。我国重庆市农业科学研究所专家杨以耕等人展开芥菜系统化分类归纳工作。将“茎用芥菜”归为一类芥菜，将“青菜头”更名为“茎瘤芥”(汪子昆.四川沱江茎瘤芥产区的生态地球化学评价[D]；成都理工大学,2012.)。目前在茎瘤芥的栽培过程中，根肿病和病毒病已经严重制约茎瘤芥的生产，其中根肿病发病最为严重，导致茎瘤芥产量和品质的严重下降，发病严重的地块将不再适宜茎瘤芥栽培，严重威胁榨菜产业可持续发展(王殿东,田雪亮,潘丽梅.榨菜根肿病不同发病程度田根际土壤真菌群落多样性研究[J].北方园艺,2016,13):115.)。

周娜等人在种植萝卜中选用石灰氮作底肥，微生物菌肥作追肥。土壤中施入动物粪肥和秸，喷水使其湿润并盖膜保湿(周娜,陶伟林,陆景伟,等.萝卜根肿病症状及综合防治[J].长江蔬菜,2021,03):53.)。在该培养基条件下种植萝卜，有效缓解了病基数，同时石灰氮与微生物菌肥配合作用下，缓解土壤环境，改善酸化问题，优化土壤结构，同时提高肥效。

根瘤菌(Rhizobium)属于革兰氏阴性杆菌,可侵入豆科植物体内并在根部形成根瘤。根瘤菌与豆科植物建立共生固氮体系，可在不危害植物生长周边环境的情况下促进植物生长，提高植物产量。1888年，德国科学家拜尔首次在非豆科植物草山萝根部发现了根瘤；帕甘等人经实验证明，根瘤菌可在人工培养基上独自生活及固氮，这一研究打破了根瘤菌只能在依赖宿主植物情况下才能完成固氮的观念(黄群策,陈启锋,李志真.生物固氮研究的前景[J].科技导报,17(9901))。

目前诱导非豆科植物结瘤基础性实验虽取得一定进展但研究仍然处于基础性的阶段，离系统化完善施用在实际的农业生产中还需在这方面进行更多的时间精力投入研究。

发明内容

本发明根据根瘤菌对植物生长具有一定促生作用的特点，通过室内限菌实验筛选根瘤菌对茎瘤芥(尤其是涪杂2号)生长具有明显促生作用及优化根瘤菌菌液浓度等措施优化根瘤菌侵染茎瘤芥体系，引根瘤菌侵入茎瘤芥根部并定殖,使用植物生长素诱导茎瘤芥根部形成固氮结构根瘤，同时探究了根瘤菌对根肿病的影响作用，利用根瘤的固氮能力减少在栽培中化学氮肥的使用量，并一定程度上缓解因根肿病造成的减产问题，从而缓解农业过程中对化学氮肥依赖，提高农作物产量，减少环境污染。

本发明首先提供一种利用田菁固氮根瘤菌促进茎瘤芥根系结瘤固氮的方法，其在茎瘤芥的培养或栽培过程中，在其培养基或土壤中施用田菁固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)，或者茎瘤芥根部浸泡田菁固氮根瘤菌。

优选地，施用田菁固氮根瘤菌的时机是在茎瘤芥的苗期阶段，或者在茎瘤芥幼苗的根部浸泡田菁固氮根瘤菌。

在更优选地实施方式中，在施用田菁固氮根瘤菌时同时施用2,4-D、氯黄隆或豆科威中的一种或二种或三种诱导剂。其中特别优选地是豆科威，或2,4-D。在具体实施方式中，所述诱导剂的浓度0.5mg/l至2.5mg/l，最优选为1mg/l。

在另外的优选实施方式中，施用的田菁固氮根瘤菌是培养至对数生长期的田菁固氮根瘤菌,施用的浓度为1.0×10

在具体实施方式中，所述茎瘤芥是涪杂2号、永安传奇、永安小叶、高山青、早青2号、成都郫县榨菜。特别是是涪杂2号。

本发明还提供上述的方法在茎瘤芥栽培中的应用，其用于促进茎瘤芥根系结瘤固氮。

本发明的方法可以使根瘤菌侵入茎瘤芥根部并定殖,进一步使用植物生长素诱导茎瘤芥根部形成固氮结构根瘤，因而可以利用根瘤的固氮能力减少在栽培中化学氮肥的使用量，从而缓解农业过程中对化学氮肥依赖，提高农作物产量，减少环境污染。本发明具有较大的应用价值。

附图说明

图1六种不同品种茎瘤芥根部组织中根瘤菌分布图。其中，A-涪杂2号；B-永安小叶；C-永安传奇；D-旱青2号；E-高山青；F-成都郫县榨菜。

图2六种不同品种茎瘤芥生理指标测定图。其中，1-永安传奇；2-永安小叶；3-涪杂2号；4-旱青2号；5-高山青；6-成都郫县榨菜。不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。

图3同时间GFP标记A.caulinodans在涪杂2号幼苗根内定殖荧光显微镜。

图4不同浓度诱导剂处理后生理指标差异图。其中，1-2.4-D-0.5mg/l；2-2.4-D-1mg/l；3-2.4-D-2.5mg/l；4-豆科威-0.5mg/l；5-豆科威-1mg/l；6-豆科威-2.5mg/l；7-氯磺隆-0.5mg/l；8-氯磺隆-1mg/l；9-氯磺隆-2.5mg/l。

图5 30d不同诱导剂不同接菌量处理结瘤差异图。其中，A-1ml 2.4-D；B-1m豆科威；C-1ml氯磺隆；D-5ml2.4-D；E-5m豆科威；F-5ml氯磺隆。

图6 60d不同诱导剂处理结瘤差异图。其中，A-2.5mg/l 2，4-D；B-2.5mg/l氯磺隆；C-2.5mg/l豆科威；D-2.5mg/l 2，4-D；E-2.5mg/l氯磺隆；F-2.5mg/l豆科威。

图7 60d不同诱导剂处理结瘤株数差异图。

图8 60d不同诱导剂处理生理指标差异图。

图9荧光显微镜下类根瘤细胞间隙的根瘤菌。

图10茎瘤芥根部和土壤固氮酶活性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不构成对本发明的限制。

其中，实施例中用到的试剂如下：

供试菌种:田菁茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS571(A.caulinodans)，由湖南农业科学院植物保护研究所提供(陈永超,齐怀廷,王小晶,等.田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦叶组织的促生作用研究[J].西北植物学报,2016,36(7):1383-1390.)

种子材料：涪杂2号、永安传奇、永安小叶、高山青、早青2号、成都郫县榨菜。其中涪杂2号、永安传奇、永安小叶、在涪陵种子公司购买，成都郫县榨菜种子在网上购买，高山青、早青2号为长江师范学院榨菜育种团队选育新品种目前正在进行品种审定。

TY液体培养基:胰蛋白胨5g/L,酵母粉3g/L,CaCl

灭菌琼脂—水固体培养基:琼脂粉5g,蒸馏水1000mL。

PBS缓冲液:KH

实施例中的数据处理：通过Execl2010对实验数据进行整理，用spss进行数据统计分析。对根瘤菌侵染不同品种、不同浓度根瘤菌处理、不同诱导剂处理茎瘤芥根长和株高进行正态性检验，通过单因素方差分析比较对照组和处理组之间的差异性，并用最小显著法(LSD)进行多重比较,利用Execl进行柱形图和误差线的绘制

实施例中具体操作步骤如无具体详细说明，其均是常规方法。

实施例一：根瘤菌对茎瘤芥促生作用研究

1、种子处理及菌液配置

选取均匀饱满颗粒大小大致一样的茎瘤芥种子分别放置2ml离心管，离心管放置超净工作台中，用50％的NaClO浸泡种子10min,浸泡时震荡离心管确保所有种子浸泡，倒出清洗液后选用移液枪吸取无菌水冲洗，进行表面消毒。冲洗液用移液枪进行更换，枪头为1ml灭菌枪头。将表面消毒的种子置于组培瓶中，组培瓶中倒入高温灭菌的琼脂–水固体培养基(以下简称培养基)表面，进行限菌培养。置于常规培养架上培养。

根瘤菌活化与扩培：小玻璃瓶中加TY培养基,无菌条件下向TY培养基加入根瘤菌,封口膜密封玻璃瓶并放置摇床。设置温度28℃，200r/min恒温培养48h使其活化。1ml移液枪吸取4ml活化A.caulinodans菌液至200ml的TY培养基中，摇床培养至对数生长期(OD

2、根瘤菌对不同品种茎瘤芥侵染实验

选取6个茎瘤芥品种种子，种子表面消毒方法同上。种子放置在装有灭菌琼脂组培瓶中，每个品种每瓶10粒，设5个重复，种子萌发2d后幼苗用于根瘤菌接种实验。挑选生长状态大致相同的幼苗，吸取稀释根瘤菌数至1.0×10

3、实验结果

田菁茎瘤固氮根瘤菌在茎瘤芥幼苗根部组织的分布如图1所示。接菌9d后通过荧光显微镜检测到根瘤菌在各茎瘤芥品种根部均有定殖。根瘤菌在不同品种茎瘤芥根部的定殖部位大致相同，多定殖于幼苗根部表皮细胞和细胞间隙，但具体的分布数量则有所不同。其中检测到根瘤菌在涪杂2号根部组织定殖量最多，其次为永安传奇和永安小叶，根瘤菌定殖量最少的为旱青2号。涪杂2号根部组织观察到明亮的GFP荧光(图1中A)，检测到的GFP标记明显多于其他茎瘤芥品种。根瘤菌在茎瘤芥根部定殖呈点状分布且分布较零散。实验证明，根瘤菌同样可以存在于非豆科植物茎瘤芥的茎瘤内部组织。

实施例二 不同浓度根瘤菌对侵染茎瘤芥侵染实验

涪杂2号种子表面消毒,消毒方式同上，置于琼脂—水固体培养基上限菌培养，待种子萌发至两叶一心期时，镊子剔除未萌发种子，留有生长状态大致相同幼苗。将对数生长期的根瘤菌菌液放置50ml的离心管中，4500r/m离心10min收集菌体,用PBS缓冲液分别稀释为1.0×10

生理指标的检测结果表明，A.Caulinodans对不同的茎瘤芥品种根长和株高产生不同影响，经LSD检验，涪杂2号接菌幼苗根长和株高较对照均有差异(图2)，涪杂2号和旱青2号根长株高处理组均显著高于对照组(P<0.05)，永安小叶根长处理组和对照组差异不显著(P>0.05)，但株高差异显著(P<0.05),永安传奇根长较未接菌组差异显著(P<0.05)，株高差异不显著(P>0.05)，高山青和成都郫县榨菜根长差异显著(P<0.05)，株高差异均不显著(P>0.05)。

永安小叶根长较对照组提高了4.5％,株高提高了3％，永安传奇根长较对照组提高了4.1％，株高较对照提高了4.8％，旱青2号根长较对照提高了3.2％，株高较对照组提高了2.5％，成都郫县榨菜根长较对照提高了8.6％，株高较对照提高了11％，涪杂2号根长处理组相对于对照组提高了11.55％，株高处理组相对于对照组提高了12.06％，高山青根长较对照组提高了5.5％,株高较对照组提高了6.8％。其中涪杂2号根长和株高经根瘤菌侵染后促生作用最为明显，涪杂2号根长和株高增加是高山青的2倍。

综上所述，适宜浓度根瘤菌对不同品种茎瘤芥生长均具有促生作用，其中涪杂2号接菌幼苗根长和株高较对照组差异均显著，且涪杂2号作为茎瘤芥栽培常用品种生长状态良好，故选用茎瘤芥涪杂2号品种用于深入研究A.caulinodans与茎瘤芥相互作用的分子机制。

实施例三 根瘤菌在茎瘤芥根系定殖情况观察

室内条件下,选用涪杂2号饱满种子表面消毒，消毒方式同上。置于琼脂—水固体培养基上限菌培养，萌发至两叶一心期，每个组培瓶吸取1mL1.0×10

挑取各时间段处理下有代表性的茎瘤芥幼苗，配制3-4％的琼脂糖水溶液放入100ml的三角瓶中，在微波炉中档加热琼脂糖融化，融化的琼脂糖倒入直径为2cm的离心管中，同时将需要切片材料包埋在琼脂糖中，至于冰上使其凝固。刀片用75％的酒精进行表面消毒后，利用刀片徒手将检测幼苗根部切成薄片状，放于载玻片并吸取适量灭菌50％甘油放置载玻片上。刀片每次使用前用75％酒精擦拭，刀片用酒精灯烧灼灭菌，避免交叉污染。

制作完成的切片置于切片架上固定，在白光视野下选用低倍镜观察找到观察组织部位，再调整粗细准焦旋钮至合适的观察倍数，将白光源切换成绿色荧光下，观察组织表面的绿色荧光信号。确定荧光定殖组织部位后，绿色荧光光源下拍照，并返回白色光源下拍照，两种光源下的照片印入合成图像，使其荧光分布呈现在白色光源下样品组织上，最后输出图像保存。

荧光检测结果表明(图3)，根瘤菌在侵染茎瘤芥3d时定殖于幼苗根部组织，随时间推移根瘤菌的定殖量而递增，在接菌15d时,根瘤菌的定殖量已在幼苗根部大量繁殖，并在局部发展为一定范围的群体密度(population density)。A.caulinodans不仅可侵染非豆科植物，还可定殖于植物根的表皮、皮层的细胞间隙和细胞内，形成生态小境(ecologicalniche)。经荧光显微镜检测，根瘤菌侵染非豆科植物茎瘤芥根部的定殖规律与根瘤菌侵入豆科植物体内大致相似，侵入植物根部组织定殖的方式都为“裂隙进入”的方式，并随着时间推移根瘤菌可在茎瘤芥根部形成一定范围的群体密度。

实施例四 根瘤菌结瘤诱导剂诱导茎瘤芥结瘤研究

1、不同浓度根瘤菌结瘤诱导剂对茎瘤芥根系结瘤的影响

将2,4-D、氯黄隆和的豆科威三种诱导剂配制成为高浓度的母液放置4度冰箱备用。三个浓度梯度稀释依次为0.5mg/l、1mg/l、2.5mg/l，同时将对数生长期的A.caulinodans用PBS缓冲液稀释浓度至1.0×10

种子表面消毒方式同上，滤纸放置培养皿中高温灭菌，无菌水将滤纸浸泡使其保持湿度，表面消毒的茎瘤芥涪杂2号种子放置滤纸上催芽，封口膜贴封培养皿进行限菌培养。三种诱导剂的每个处理10粒，设5个重复，萌发至两叶一心期，每个处理加入不同浓度诱导剂后再同时加入等量的1mL的1.0×10

不同浓度诱导剂处理茎瘤芥30d后，对每组处理下的30株幼苗进行调查，分析不同诱导剂同A.caulinodans组合使用对茎瘤芥生长生理学的影响。结果表明，茎瘤芥的根长、株高、叶长、根叶鲜重都有了明显的差异(图4)。其中1mg/l浓度下豆科威对茎瘤芥的生理生长影响最大。0.5mg/l浓度下的2,4-D叶长均值为15.35cm，根长均值为10.48cm，株高均值为18.95cm，叶重均值为2.668g，根重均值为0.174cm，1mg/l浓度下的2,4-D叶长均值为16.74cm，根长为11.52cm，株高均值为21.14cm，叶重均值为1.32g，根重均值为0.37g，2.5mg/l浓度下2,4-D叶长均值为15.49cm，根长均值为11.8cm，株高均值为22.51cm，叶重均值为1.227g,根重均值为0.189g,0.5mg/l浓度下的豆科威叶长均值为14.5cm，根长均值为9.23cm，株高均值为24.3cm,叶重均值为3.01g，根重为0.46g,

1mg/l浓度处理下的豆科威株高均值为25.4cm，叶长均值为16.57cm，根长均值为12.34cm，根重均值为0.53g，2.5mg/l浓度下豆科威叶长均值为14cm,根长均值为8.75cm，株高均值为21.65cm,叶重均值为3.401g，根重均值为0.44g，0.5mg/l浓度下氯磺隆叶长均值为14.45cm，根长均值为8.86cm，株高均值为21.65cm，叶重均值为0.44g,根重均值为0.44g，1mg/l浓度下氯磺隆叶长均值为11.75cm，根长均值为15.44cm,株高均值为22.35cm,叶重均值为0.504g，根重均值为0.455g，2.5mg/l浓度下氯磺隆叶长均值为14.94cm，根长均值为12.13cm，株高均值为25.92cm，叶重均值为7.23g，根重均值为0.63g。

综上所述，1mg/l浓度下的豆科威株高均值高于2,4-D三个浓度和氯磺隆0.5mg/l、1mg/l两个浓度处理下幼苗株高，低于氯磺隆2.5mg/l处理下的株高。1mg/l浓度处理下豆科威叶长为16.57cm，均值高于2,4-D和氯磺隆三个浓度下的叶长。1mg/l浓度的豆科威根重均值为0.53g，与2.5mg/l浓度的氯磺隆根重差异不大，但均高于其他处理下的根重。综上所述，使用结瘤诱导剂三个浓度诱导茎瘤芥，1mg/l浓度的豆科威对茎瘤芥生理生长没有表现出明显的抑制作用，在1mg/l浓度下豆科威处理下，涪杂2号幼苗的生长状态最良好。

2、不同剂量根瘤菌结瘤诱导剂对茎瘤芥根系结瘤的影响

种子消毒方式同上，限菌培养。选用稀释浓度为2.5mg/l的三种诱导剂和稀释为1.0×10

接菌30d后调查茎瘤芥在不同剂量根瘤菌结瘤诱导剂处理下结瘤情况(图5)。调查结果表明，三种诱导剂使用浓度为2.5mg/l和1ml剂量处理下均未诱导茎瘤芥形成根瘤，但2.5mg/l浓度处理下使用剂量为5ml的三种诱导剂均诱导茎瘤芥根部形成根瘤。这一现象说明诱导剂使用量是影响茎瘤芥结瘤的重要原因。5ml的2,4-D和根瘤菌同时使用下，茎瘤芥结瘤效果最明显且形成的类根瘤最多，其次为豆科威和氯磺隆。2,4-D和氯磺隆加菌形成的类根瘤形态大致相同，均呈现半圆球状，而豆科威加菌形成的类根瘤呈现半圆球状和短棒状。同样培养条件下，未加入诱导剂仅使用根瘤菌培养的对照组茎瘤芥，虽有根瘤菌定殖在根部组织，但也未诱导茎瘤芥在根部形成根瘤。

处理60d后调查茎瘤芥形成类根瘤形态如图6所示。实验使用最终浓度为2.5mg/l及5ml剂量的三个诱导剂，在茎瘤芥萌发至两叶一心期接5ml的诱导剂和1.0×10

综上所述，氯磺隆诱导茎瘤芥结瘤效果低于2,4-D和豆科威，2,4-D诱导茎瘤芥结瘤效果最好，可用作诱导茎瘤芥结瘤生产中的诱导剂。

其中，结瘤率＝(结瘤株数/调查株数)×100％

3、不同剂量诱导剂处理茎瘤芥生理指标差异分析

调查不同剂量诱导剂处理60d后的30株茎瘤芥生理指标影响的差异情况(图8)。2.5mg/l浓度及5ml剂量的2,4-D和根瘤菌菌液等量处理茎瘤芥，根鲜重最大，均值高达1.47g,其根重较豆科威和氯磺隆处理下差异明显，低于对照组5％，高于氯磺隆和豆科威处理下均为12％和11％。经最小显著差异法检验，2,4-D较对照组差异不显著(P>0.05)，较氯磺隆及豆科威差异显著(P<0.05)。综上所述，三种诱导剂加菌使用较对照茎瘤芥生长均有一定影响，其中2,4-D较对照根重差异不显著，表明2,4-D茎瘤芥生长没有明显的抑制作用，而氯磺隆和豆科威处理下对茎瘤芥根重有明显的抑制作用，故选用结瘤效果最佳且对茎瘤芥生长影响较小的2，4-D为后期实验诱导剂。

4、根部根瘤荧光显微镜观察

将根部形成根瘤茎瘤芥幼苗土壤中取出，自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗，彻底清除根部杂质，吸水纸吸取水分或自然风干。选取形成根瘤的代表性茎瘤芥根部制片用于荧光显微镜观察。

在茎瘤芥根部形成根瘤后，取2,4-D浓度为2.5mg/l和剂量为5ml处理下形成根瘤的茎瘤芥幼苗，用于检测根瘤中A.caulinodans的定殖情况。茎瘤芥幼苗根部在2,4-D和根瘤菌侵染下培养30d，在茎瘤芥根部形成根瘤，通过荧光显微镜观察，根瘤菌不仅可在茎瘤芥根系自然开口和根系细胞间隙定殖，还可进入根瘤细胞间隙并在根瘤组织中大量增殖(如图9)。

实施例五 结瘤幼苗根部及土壤固氮酶活性测定

种子表面消毒方法同上，种子生长至两叶一心期时，在幼苗根部接5ml稀释至2.5mg/l浓度2，4-D和1.0×10

选用乙炔还原法测定结瘤根部和培养土壤的固氮酶活性。冲洗茎瘤芥根系，用吸水纸吸取水分后放入100ml血清瓶中，用胶塞封口，玻璃导管和胶皮导管连接打孔胶塞并封闭，使血清瓶内形成一个密封空间，注射器抽出空气，储气袋中抽取乙炔气体打入广口瓶中反应1小时，反应完成的多种混合气体转入空瓶，利用气相色谱分析仪以外标法测定茎瘤芥根部的固氮酶活性。

取培养茎瘤芥花盆中培养土壤10g放置100ml血清瓶中，并加入0.1mol/l葡萄糖2ml,摇均匀，盖上胶塞和铝盖密封，使血清瓶内形成封闭空间。注射器从瓶中抽出乙炔气体，280℃培养48h。培养结束后，用1ml注射器从瓶中吸取气样，测定方法同上，测定培养土壤固氮酶活性。

由图10可知，茎瘤芥接菌处理组和对照组固氮酶活性差异显著(p<0.05)，形成根瘤的根部固氮酶活性为30.21IU/g,对照组为28.57IU/g；对培养茎瘤芥土壤也进行检测，对照组和处理组差异明显(p<0.05),其处理组固氮酶活性为31.73IU/g，对照组为29.7IU/g。综上所述，处理组的固氮酶活性虽高于对照组，但对照组未接根瘤菌和处理组一样均表现出一定的固氮酶活性，这可能是因为在接菌过程中，空气中携带根瘤菌迁移于对照组，使其也受到一定影响。

其中，单位根瘤重量固氮酶活性SNA＝(还原的乙烯量/根瘤干重)×时间。