用于大分子递送和基因组修饰的可编程设计因子治疗性促融合分泌性g型核外颗粒体囊泡

本国际PCT申请要求于2018年8月1日提交的美国临时申请第62/713,289号的权益和优先权。上文引用的申请的整个说明书和附图以全文引用的方式并入本文中。

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号GM113141和AR068254在政府支持下进行的。政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本发明的技术涉及用于通过分泌性促融合囊泡将靶分子包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。

背景技术

将基因组编辑酶、治疗性RNA、蛋白质或小分子瞬时有效地递送到细胞中对于基础研究和治疗性开发至关重要。例如，在开发用于基因修饰和干扰mRNA表达的方法中已经取得了巨大进展。类似地，已经针对将使用反义寡核苷酸、RNA干扰或最近开发的用于在短期内敲低基因表达的Cas13来灭活mRNA作为目标的方法付出了许多努力。所有这些方法都依赖于将核酸或蛋白质-核酸复合物递送到受体细胞。研究哺乳动物细胞或动物中的基因功能的那些方法已经常规地使用病毒或脂质介导的转染将DNA或RNA修饰机制引入到细胞中。尽管这些方法被普遍采用并且经常有效，但是所述方法在治疗性应用中具有显著的局限性。例如，据报道，部分地由于Cas9的持续表达，基于病毒的递送系统增加了患者的癌症风险和人免疫力。基于脂质的纳米颗粒受到从核内体释放货物的效率低下、体内靶向/融合效率低下、细胞或器官特异性不良以及毒性相对较高的限制。因此，高度寻求用于药理学上递送改变细胞功能的生物制剂的替代性方法。

一种有前景的发展是使用胞外囊泡(EV)在体外和体内将包封的货物或包含蛋白质、核酸和小分子的靶分子递送到受体细胞。EV是由所有细胞类型不断释放的纳米大小的异质膜囊泡。最近的研究已将EV鉴别为用于细胞间通讯的重要机制。基于其大小和生物起源，EV已被分类为外泌体或微囊泡，也被称为核外颗粒体。微囊泡是通过从细胞质膜上萌芽而形成并释放的并且通常直径为150-1,000nm。外泌体是直径通常为40-150nm的较小囊泡并且源于被称为多囊泡体的核内体区室。这两种类型的囊泡之间的区别由于以下事实而变得复杂：所述两种类型的囊泡高度异质，同时大小范围重叠并且组成可变。直到最近，由于缺乏用于有效分离两种类型的囊泡的纯化方法，因此经常对所述两种类型的囊泡的混合物进行研究。使所述两种类型的囊泡的区分复杂性增加的是在介质或体液中存在大小类似的其它纳米颗粒，如凋亡小体、含有抑制蛋白结构域的蛋白1介导的微囊泡和核小体。因此，这两种类型的囊泡的功能性能力仍然知之甚少。例如，已知EV包封各种生物活性分子，包含蛋白质、核酸和脂质。可用证据表明，微囊泡的蛋白质组和货物似乎与外泌体不同。这并不是完全出乎意料的，因为外泌体是通过在多囊泡核内体成熟期间吞噬胞质蛋白和RNA的同时使核内体膜内向萌芽而形成的腔内囊泡。在多囊泡核内体与细胞膜融合时，发生外泌体内容物的释放。相比之下，微囊泡是由质膜处的向外萌芽产生的。然而，仍不清楚这些囊泡如何选择性地吞没胞质蛋白或核酸。对包封在任一种类型的囊泡中的货物的控制的缺乏加上其固有的异质性阻碍了其功能分析和对管理货物装载的基本规则的划定。

值得注意的是，外泌体和微囊泡已经成为用于在体外和体内将包封的货物或包含蛋白质、核酸和小分子在内的靶分子递送到受体细胞的新方式。重要的是，可以通过对某些病毒蛋白如水泡性口炎病毒(VSV-G)的过表达来增强核外颗粒体的形成。尽管如此，使用核外颗粒体作为用于将靶分子递送到真核细胞的媒剂是有限的。例如，Mangeoti等人(美国专利申请第13/505,506号)建议在体外系统中使用微囊泡作为所关注蛋白的递送媒剂。然而，这种系统缺乏对微囊泡进行编程以在选择和运输精确的诊断性和治疗性应用所需的蛋白质时提供必要特异性的能力。此外，微囊泡的这种非特异性应用可能导致不希望的细胞RNA污染。为了使核外颗粒体成为有效的生物制剂递送工具，必须要有一种方式来控制核外颗粒体可以包封的货物的类型，而不会损害其生产和促融合活性。

发明内容

本发明技术的一个方面总体上包含用于改进系统以通过如分泌性促融合核外颗粒体囊泡等EV将靶分子包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含可编程或工程化分泌性促融合核外颗粒体囊泡，所述可编程或工程化分泌性融合核外颗粒体囊泡可以优选地为g型核外颗粒体(gectosome，G蛋白核外颗粒体)，所述g型核外颗粒体被配置成以预定的方式将特定蛋白、核酸和小分子选择性地包封并递送到受体细胞。本发明的实施例还可以包含可编程或工程化g型核外颗粒体囊泡，所述可编程或工程化g型核外颗粒体囊泡被配置成通过使用分裂补体系统如分裂蛋白质系统和/或蛋白质-蛋白质基序以预定的方式将特定蛋白、核酸和小分子(通常被称为靶分子)选择性地包封并递送到受体细胞。例如，在一个优选的实施例中，选自由以下组成的组的分裂蛋白质系统：分裂GFP系统、NanoBiT(普洛麦格公司(Promega))分裂泛素系统、分裂β-gal系统、分裂荧光素酶系统、分裂mCherry系统等。

本发明技术的另一个方面总体上包含用于改进系统以通过分泌性g型核外颗粒体将靶基因组编辑分子包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含一种可编程g型核外颗粒体，其被配置成以预定的方式将特异性基因组编辑蛋白选择性地包封并递送到受体细胞。实例可以包含但不限于：

本发明的另一个方面包含用于主动装载和纯化高度特异性核外颗粒体囊泡或g型核外颗粒体的可概括方法，所述核外颗粒体囊泡或g型核外颗粒体能够在体外和体内有效地将基因组修饰工具递送到多种细胞。在一个优选的实施例中，这种g型核外颗粒体被设计成通过分裂蛋白互补如分裂GFP补体系统将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)与生物活性蛋白、核酸修饰酶如Cas9或13共包封。由于减少了细胞蛋白的非特异性掺入，这些荧光g型核外颗粒体可以被纯化以免污染胞外囊泡并显示出更高的比活性，从而克服通常与胞外囊泡相关的异质性的主要障碍。在其它实施例中，可以将包封各种治疗相关蛋白如Cre、Ago2、SaCas9和LwaCas13的g型核外颗粒体工程化，所述各种治疗相关蛋白可以在体外细胞系和体内体细胞组织中执行内源性基因的经过设计的修饰，从而允许以靶向的g型核外颗粒体介导的方式递送用于各种人类疾病的治疗剂。

另外的方面可以进一步包含用于生成可以例如通过表达防止免疫系统清除的表面生物标志物来抵抗免疫系统的清除的高效持久g型核外颗粒体的系统和方法。在一个优选的实施例中，可以通过在g型核外颗粒体的表面上过表达和呈递CD47蛋白来抵抗巨噬细胞的清除的这种高效持久g型核外颗粒体。在替代性方面，本发明可以在一个实施例中包含抗体的过表达或在优选的实施例中包含可以促进EV或g型核外颗粒体从循环中耗尽的纳米抗体，如抗CD47纳米抗体。在此实施例中，这种EV或g型核外颗粒体可以被巨噬细胞或树突状细胞快速摄取并且可以更快速地和/或有效地递送肿瘤抗原肽以引发免疫应答。

本发明技术的一个方面包含用于制备可编程的高度促融合g型核外颗粒体的系统、方法和组合物，所述可编程的高度促融合g型核外颗粒体可以用作用于在体外和体内以剂量控制方式递送特异性药理学药剂的媒剂。本发明技术的另一个方面可以包含水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)用于刺激促融合囊泡的产生并介导细胞间蛋白转移的新颖用途。在某个优选的实施例中，VSV-G促进的囊泡可以通过简单的互补过程包封预定的蛋白质和核酸。在此优选的实施例中，VSV-G蛋白的C端可以与蛋白序列元件偶联，所述蛋白序列元件驱动期望的相互作用配偶体装载到VSV-G囊泡中。

在本发明的另一个方面，可以将分裂GFP系统用作VSV-G与期望的货物蛋白之间的驱动器，因为这种荧光g型核外颗粒体可以在脱落到胞外空间期间高效地形成。在另一个方面，可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)纯化具有期望的货物的g型核外颗粒体，以获得几乎均质的颗粒群体。在另外的方面，本发明可以包含用于在体内和体外的各种细胞系和原代细胞中对g型核外颗粒体进行细胞摄取并在与所述g型核外颗粒体进行细胞接触后释放货物的系统、方法和组合物。在这种优选的实施例中，本发明可以允许例如在体外和体内系统中与设计的g型核外颗粒体进行同源重组、RNA干扰、基因编辑和RNA消融。本发明的另外的方面可以包含通过瞬时递送基因组编辑分子如Cas9/sgRNA和其它靶核酸酶以及其它治疗性组合物实现对靶基因元件的体内编辑来临床应用g型核外颗粒体以进行治疗。

本发明技术的又另一个方面总体上包含用于改进系统以通过分泌性促融合核外颗粒体囊泡将靶核糖核酸或治疗性RNA分子包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含可编程的促融合核外颗粒体囊泡如g型核外颗粒体可以被配置成以预定和/或剂量依赖性方式选择性地包封和递送被配置成在受体细胞中引发或增强RNA介导的干扰的特异性RNA和RNA干扰介导蛋白。

在又另一个方面，本发明技术总体上包含用于改进系统以通过分泌性促融合核外颗粒体囊泡将靶多肽或治疗性蛋白分子如生物制剂包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含一种可编程的促融合核外颗粒体囊泡，如g型核外颗粒体，所述可编程的促融合核外颗粒体囊泡被配置成以预定或剂量依赖性方式将特定蛋白，优选地治疗性蛋白选择性地包封并递送到受体细胞。在一个优选的实施例中，这种蛋白质或蛋白质片段可以被受体细胞识别为抗原并且诱导免疫应答。如此，本发明可以包含用于接种或预防性地治疗受体宿主的系统、方法和组合物。

本发明技术的另外的方面总体上包含用于改进系统以通过分泌性促融合核外颗粒体囊泡将靶抗体包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含一种可编程的促融合核外颗粒体囊泡，如g型核外颗粒体，所述可编程的促融合核外颗粒体囊泡被配置成以预定或剂量依赖性方式将特异性抗体选择性地包封并递送到受体细胞。

本发明技术的另外的方面总体上包含用于改进系统以通过分泌性促融合核外颗粒体囊泡将靶小分子或化合物包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含一种可编程的促融合核外颗粒体囊泡，其被配置成以预定或剂量依赖性方式将特异性小分子和/或化合物选择性地包封并递送到受体细胞。

本发明的一个方面可以包含用于表达各种病毒糖蛋白的系统、方法和组合物，所述病毒糖蛋白可以用于在细胞之间转移可编程的货物。

本发明技术的另一个方面可以包含用于可编程的促融合核外颗粒体囊泡如g型核外颗粒体的系统、方法和组合物，所述可编程的促融合核外颗粒体囊泡可以被配置成将一个或多个靶分子递送到特异性细胞和/或组织和/或生物体类型。在优选的实施例中，这可以通过表达一种或多种表现出不同宿主和/或细胞范围的病毒糖蛋白来完成。

本发明的又另一个方面总体上可以包含用于通过人Gag样蛋白形成和/或检测核外颗粒体形成的系统、方法和组合物。

本发明的另一个方面可以包含可编程的促融合核外颗粒体囊泡的用途，所述可编程的促融合核外颗粒体囊泡被配置成递送一个或多个靶分子以治疗疾病病状，优选地在人类中。

本发明的仍另外一个方面可以包含用于对受试者的免疫系统应答进行信号扩增的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，可以转染供体细胞以异源性地表达融合缺陷型促融合蛋白，所述融合缺陷型促融合蛋白与分裂补体系统的第一组分以及分裂补体系统的与抗体肽或肿瘤特异性抗原肽融合的第二组分偶联。通过重构所述分裂补体系统，可以将抗体肽或肿瘤特异性抗原肽锚定至能够形成EV的膜，所述分裂补体系统可以进一步将抗体肽或肿瘤特异性抗原肽包封在EV中。在此优选的实施例中，抗体肽或肿瘤特异性抗原肽的一个或多个表位可以存在于EV的表面上。如在其它地方所指出的，重构分裂补体系统或其它标签可以被检测并且用于帮助分离主题EV。然后可以向有需要的受试者施用治疗有效量的所述分离的EV，其中存在于所述分离的EV的表面上的抗体肽或肿瘤特异性抗原肽可以引发受试者的免疫应答。

本发明的另外方面可以包含以下实施例中的一个或多个实施例：

1.一种将靶分子选择性地递送到受体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

-转染供体细胞以异源性地表达双组分递送系统，所述双组分递送系统包括：

-能够掺入到胞外囊泡(EV)的膜中的蛋白质，所述蛋白质与分裂补体系统的第一组分偶联；

-所述分裂补体系统的第二组分，所述第二组分被配置成与分子偶联；

-通过重构所述分裂补体系统将所述靶分子锚定至能够形成EV的膜；以及

-将所述靶分子和所述重构分裂补体系统包封在由所述供体细胞形成的EV中。

2.根据实施例1所述的方法，其进一步包括将由所述供体细胞形成的所述EV与受体细胞融合的步骤。

3.根据实施例2所述的方法，其进一步包括将所述靶分子从由所述供体细胞形成的所述EV释放到所述受体细胞中的步骤。

4.根据实施例3所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述靶分子的步骤。

5.根据实施例1所述的方法，其中所述能够掺入到EV的膜中的蛋白质包括能够掺入到EV的膜中的促融合蛋白。

6.根据实施例5所述的方法，其中所述EV包括核外颗粒体。

7.根据实施例5所述的方法，其中所述能够掺入到EV的膜中的促融合蛋白包括水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒融合蛋白。

8.根据实施例7所述的方法，其中所述EV包括g型核外颗粒体。

9.根据实施例7所述的方法，其中所述VSV-G蛋白包括具有另外的结合基序的VSV-G蛋白，所述另外的结合基序选自由以下组成的组：DNA结合基序；RNA结合基序；蛋白质结合基序；以及配体结合基序。

10.根据实施例9所述的方法，其中所述具有另外的结合基序的VSV-G蛋白包括与标签偶联的VSV-G蛋白。

11.根据实施例7所述的方法，其中所述VSV-G蛋白包括融合缺陷型VSV-G突变蛋白。

12.根据实施例1所述的方法，其中所述分裂补体系统的所述第一组分包括GFP11肽，并且所述分裂补体系统的所述第二组分包括GFP1-10肽，所述GFP11肽和所述GFP1-10肽在重构时形成活性绿色荧光蛋白(GFP)。

13.根据实施例1所述的方法，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

14.根据实施例1所述的方法，其中所述靶分子包括选自由以下组成的组的靶分子：蛋白质；蛋白质片段；治疗性蛋白；细胞重编程蛋白；标记的蛋白质；肽适体；抗体；抗体片段；肿瘤特异性抗原肽；基因组编辑酶；抗原；寡核苷酸；大范围核酸酶；核酸；DNA分子；RNA分子；RNAi分子；RNA诱导沉默复合物(RISC)中涉及的蛋白质；治疗性化合物；纳米颗粒；配体；以及前药。

15.根据实施例14所述的方法，其中所述基因组编辑酶包括选自由以下组成的组的基因组编辑酶：核酸酶；Cas9；dCas9；SaCas9；dSaCas9；LwaCas13；Cas13；C2c1；C2C3；C2c2；Cfp1；CasX；CRISPRi；CRISPRa；CRISPRX；CRISPR-STOP；TALEN核酸酶；以及锌指核酸酶；通过dCas9与胞苷脱氨酶蛋白和CRE重组酶融合构建的碱基编辑器。

16.根据实施例15所述的方法，其进一步包括将针对靶基因的sgRNA引入到供体细胞或转染所述供体细胞以异源性地表达针对靶基因的sgRNA的步骤。

17.根据实施例16所述的方法，其中针对靶基因的所述sgRNA与至少基因组编辑酶结合并且被包封在所述EV中。

18.根据实施例17和9所述的方法，其中针对靶基因的所述sgRNA与具有RNA结合基序的VSV-G蛋白偶联。

19.根据实施例14所述的方法，其中所述RISC中涉及的所述蛋白质包括AGO2。

20.根据实施例19所述的方法，其进一步包括将被配置成下调靶基因的表达的RNAi分子引入到供体细胞或转染所述供体细胞以异源性地共表达被配置成下调靶基因的表达的RNAi分子的步骤。

21.根据实施例20所述的方法，其中所述被配置成下调靶基因的表达的RNAi分子与所述RISC中涉及的蛋白质结合并且被包封在所述EV中。

22.根据实施例21所述的方法，其中所述RNAi分子包括选自由以下组成的组的RNAi分子：dsRNA分子；siRNA分子；miRNA分子；lincRNA分子；以及shRNA分子。

23.根据实施例1所述的方法，其中所述重构分裂补体系统发出可检测信号。

24.根据实施例23所述的方法，其进一步包括基于由所述重构分裂补体系统生成的所述可检测信号来分离一个或多个EV的步骤。

25.根据实施例1所述的方法，其进一步包括转染所述供体细胞以过表达破坏巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质或替代性地转染所述供体细胞以过表达促进巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质的步骤。

26.根据实施例25所述的方法，其中转染所述供体细胞以过表达破坏所述EV的巨噬细胞清除的一种或多种蛋白质的所述步骤包括转染所述供体细胞以过表达CD47的步骤，或替代性地转染所述供体细胞以过表达促进巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质包括转染所述供体细胞以过表达抗CD47纳米抗体的步骤。

27.根据实施例1所述的方法，其进一步包括转染所述供体细胞以包含包封在所述EV中的一种或多种核酸的步骤。

28.根据实施例1中的实施例所述的方法，其在体外、离体地或在体内执行。

29.一种将靶配体选择性地递送到受体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

-转染供体细胞以异源性地表达双组分递送系统，所述双组分递送系统包括：

-能够掺入到胞外囊泡(EV)的膜中的蛋白质，所述蛋白质与分裂补体系统的第一组分偶联并且任选地被配置成与至少一种靶配体偶联；

-所述分裂补体系统的第二组分，所述第二组分被配置成与至少一种靶配体偶联；

-通过重构所述分裂补体系统将所述至少一种靶配体锚定至能够形成EV的膜；以及

-将所述靶配体和所述重构分裂补体系统包封在由所述供体细胞形成的EV中。

30.根据实施例29所述的方法，其中所述膜结合蛋白包括水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒融合蛋白。

31.根据实施例29所述的方法，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

32.根据实施例29所述的方法，其中所述靶配体包括选自由以下组成的组的靶分子：蛋白质；蛋白质片段；治疗性蛋白；细胞重编程蛋白；标记的蛋白质；肽适体；抗体；抗体片段；肿瘤特异性抗原肽；基因组编辑酶；抗原；寡核苷酸；大范围核酸酶；核酸；DNA分子；RNA分子；RNAi分子；RNA诱导沉默复合物(RISC)中涉及的蛋白质；治疗性化合物；纳米颗粒；配体；以及前药。

33.根据实施例32所述的方法，并且进一步包括核苷酸，所述核苷酸被配置成与所述靶配体或所述膜结合蛋白或所述分裂补体系统的所述第二组分偶联。

34.根据实施例33所述的方法，其中核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸：sgRNA；RNAi分子；以及DNA分子。

35.一种通过可编程胞外囊泡瞬时或稳定地转染受体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

-转染供体细胞以异源性地表达双组分递送系统，所述双组分递送系统包括：

-掺入到胞外囊泡(EV)的膜中的来自水泡性口炎病毒(VSV-G)的病毒融合蛋白G，所述病毒融合蛋白G与GFP分裂补体系统的第一组分偶联并且任选地被配置成与至少一种靶配体偶联；

-所述GFP分裂补体系统的第二组分，所述第二组分被配置成与至少一种靶配体偶联；

-通过重构所述分裂补体系统将所述至少一种靶配体锚定至能够形成EV的膜；以及

-由所述供体细胞形成包封所述至少一种靶配体和所述重构分裂补体系统的一个或多个EV。

36.根据实施例35所述的方法，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

37.根据实施例35所述的方法，其中所述靶配体包括选自由以下组成的组的靶分子：蛋白质；蛋白质片段；治疗性蛋白；细胞重编程蛋白；标记的蛋白质；肽适体；抗体；抗体片段；肿瘤特异性抗原肽；基因组编辑酶；抗原；寡核苷酸；大范围核酸酶；核酸；DNA分子；RNA分子；RNAi分子；RNA诱导沉默复合物(RISC)中涉及的蛋白质；治疗性化合物；纳米颗粒；配体；以及前药。

38.根据实施例37所述的方法，并且进一步包括核苷酸，所述核苷酸被配置成与所述靶配体或所述膜结合蛋白或所述分裂补体系统的所述第二组分偶联。

39.根据实施例35所述的方法，其中核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸：sgRNA；RNAi分子；以及DNA分子。

40.一种将靶配体选择性地递送到受体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

-转染供体细胞以异源性地表达蛋白质，所述蛋白质能够掺入到胞外囊泡(EV)的膜中并且被进一步配置成与至少一种靶配体偶联；以及

-由所述供体细胞形成包封所述靶配体的一个或多个EV。

41.根据实施例40所述的方法，其中所述膜结合蛋白包括水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒融合蛋白。

42.根据实施例40所述的方法，并且进一步包括标签，所述标签与所述能够掺入到EV的膜中的蛋白质偶联。

43.根据实施例40所述的方法，其中所述靶配体包括选自由以下组成的组的靶分子：蛋白质；蛋白质片段；治疗性蛋白；细胞重编程蛋白；标记的蛋白质；肽适体；抗体；抗体片段；肿瘤特异性抗原肽；基因组编辑酶；抗原；寡核苷酸；大范围核酸酶；核酸；DNA分子；RNA分子；RNAi分子；RNA诱导沉默复合物(RISC)中涉及的蛋白质；治疗性化合物；纳米颗粒；配体；以及前药。

44.根据实施例43所述的方法，并且进一步包括核苷酸，所述核苷酸被配置成与所述靶配体或能够掺入到EV的膜中的蛋白质偶联或被包封在所述一个或多个EV内。

45.根据实施例44所述的方法，其中核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸：sgRNA；RNAi分子；以及DNA分子。

46.一种组合物，其包括：

-g型核外颗粒体，所述g型核外颗粒体具有与分裂补体系统的第一组分偶联的膜结合水泡性口炎病毒G(VSY-G)病毒融合蛋白以及所述分裂补体系统的第二组分，其中所述膜结合蛋白或所述分裂补体系统的所述第二组分被配置成与至少一个靶分子偶联。

47.根据实施例46所述的组合物，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

48.根据实施例46所述的组合物，其中所述靶分子包括选自由以下组成的组的靶分子：蛋白质；蛋白质片段；治疗性蛋白；细胞重编程蛋白；标记的蛋白质；肽适体；抗体；抗体片段；肿瘤特异性抗原肽；基因组编辑酶；抗原；寡核苷酸；大范围核酸酶；核酸；DNA分子；RNA分子；RNAi分子；RNA诱导沉默复合物(RISC)中涉及的蛋白质；治疗性化合物；纳米颗粒；配体；以及前药。

49.根据实施例48所述的组合物，并且进一步包括核苷酸，所述核苷酸被配置成与所述靶分子或所述VSV-G病毒融合蛋白或所述分裂补体系统的所述第一组分或者第二组分偶联或被包封在所述g型核外颗粒体内。

50.根据实施例49所述的组合物，其中核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸：sgRNA；RNAi分子；以及DNA分子。

51.一种组合物，其包括：

-胞外囊泡(EV)，所述EV具有：

-膜结合蛋白，所述膜结合蛋白与分裂补体系统的第一组分偶联并且被进一步配置成能够与靶分子偶联；以及

-所述分裂补体系统的第二组分，所述第二组分被配置成能够与至少一个靶分子偶联。

52.根据实施例51所述的组合物，其中所述膜结合蛋白包括水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒融合蛋白。

53.根据实施例51所述的组合物，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

54.根据实施例51所述的组合物，其中所述靶分子包括选自由以下组成的组的靶分子：蛋白质；蛋白质片段；治疗性蛋白；细胞重编程蛋白；标记的蛋白质；肽适体；抗体；抗体片段；肿瘤特异性抗原肽；基因组编辑酶；抗原；寡核苷酸；大范围核酸酶；核酸；DNA分子；RNA分子；RNAi分子；RNA诱导沉默复合物(RISC)中涉及的蛋白质；治疗性化合物；纳米颗粒；配体；以及前药。

55.根据实施例54所述的组合物，并且进一步包括核苷酸，所述核苷酸被配置成与所述靶分子或所述膜结合蛋白或所述分裂补体系统的所述第二组分偶联或被包封在所述EV内。

56.根据实施例51所述的组合物，其中被配置成与所述靶分子或所述膜结合蛋白偶联的核苷酸包括选自由以下组成的组的核苷酸：sgRNA；RNAi分子；以及DNA分子。

57.一种扩增受试者的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：

-转染供体细胞以异源性地表达：

-融合缺陷型促融合蛋白，所述融合缺陷型促融合蛋白与分裂补体系统的第一组分偶联；

-分裂补体系统的第二组分，所述第二组分与抗体肽或肿瘤特异性抗原肽融合；

-通过重构所述分裂补体系统将所述抗体肽或肿瘤特异性抗原肽锚定至能够形成EV的膜；

-由所述供体细胞形成一个或多个EV，其中所述抗体肽或肿瘤特异性抗原肽存在于所述一个或多个EV的表面上；

-分离所述一个或多个EV；以及

-向有需要的受试者施用治疗有效量的所述分离的EV，其中存在于所述分离的EV的表面上的所述抗体肽或所述肿瘤特异性抗原肽引发所述受试者的免疫应答。

58.根据实施例57所述的方法，其中所述融合缺陷型促融合蛋白包括融合缺陷型VSV-G突变蛋白。

59.根据实施例57所述的方法，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

60.根据实施例57所述的方法，其中所述分裂补体系统的所述第一组分包括GFP11肽，并且所述分裂补体系统的所述第二组分包括GFP1-10肽，所述GFP11肽和所述GFP1-10肽在重构时形成活性绿色荧光蛋白(GFP)。

61.根据实施例57所述的方法，其中所述抗体肽包括双特异性抗体肽或其片段。

62.根据实施例61所述的方法，其中所述双特异性抗体肽或其片段包括选自由以下组成的组的双特异性抗体肽：CD3；以及EGFR。

63.根据实施例57所述的方法，其中所述肿瘤特异性抗原肽包括选自由以下组成的组的肿瘤特异性抗原肽：多巴色素-互变异构酶(TRP2)、黑色素细胞蛋白PMEL(gp100)、HPVE6/7、MAGE 1、MAGE 3、NY-ESO、雄激素受体(AR)、BCL-1、钙卫蛋白、癌胚抗原(CEA)、EGFR、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、上皮唾液粘蛋白、膜雌激素受体(mER)、FAP HER2/neu、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、IL-6、MOC-1、MOC-21、MOC-52、黑色素A(melan-A)/MART-1、黑色素瘤相关抗原、粘蛋白、OKT9、孕激素受体(PGR)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、突触素、VEGFR、CD19、CD20、CD22、CD30以及CD33。

64.根据实施例57所述的方法，其中分离一个或多个EV的所述步骤包括基于由所述重构分裂补体系统生成的可检测信号来分离一个或多个EV的步骤。

65.根据实施例57所述的方法，其中所述免疫应答包括受试者的CD8-T细胞激活。

66.根据实施例57所述的方法，其进一步包括转染所述供体细胞以过表达破坏巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质或替代性地转染所述供体细胞以过表达促进巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质的步骤。

67.根据实施例66所述的方法，其中转染所述供体细胞以过表达破坏所述EV的巨噬细胞清除的一种或多种蛋白质的所述步骤包括转染所述供体细胞以过表达CD47的步骤，或替代性地转染所述供体细胞以过表达促进巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质包括转染所述供体细胞以过表达抗CD47纳米抗体的步骤。

68.根据实施例57中的实施例所述的方法，其在体外、离体地或在体内执行。

69.一种扩增受试者的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：

-转染供体细胞以异源性地表达融合缺陷型蛋白，所述融合缺陷型蛋白能够掺入到胞外囊泡(EV)的膜中并且被进一步配置成与至少一种抗体肽或肿瘤特异性抗原肽偶联；

-由所述供体细胞形成一个或多个EV，其中所述抗体肽或肿瘤特异性抗原肽存在于所述一个或多个EV的表面上；

-分离所述一个或多个EV；以及

-向有需要的受试者施用治疗有效量的所述分离的EV，其中存在于所述分离的EV的表面上的所述抗体肽或所述肿瘤特异性抗原肽引发所述受试者的免疫应答。

70.根据实施例69所述的方法，其中所述融合缺陷型蛋白包括融合缺陷型VSV-G突变蛋白。

71.根据实施例70所述的方法，其中所述融合缺陷型VSV-G突变蛋白包括带标签的融合缺陷型VSV-G突变蛋白。

72.根据实施例71所述的方法，其中分离一个或多个EV的所述步骤包括基于与所述融合缺陷型VSV-G突变蛋白偶联的所述标签来分离一个或多个EV的步骤。

73.根据实施例70所述的方法，其中所述抗体肽包括双特异性抗体肽或其片段。

74.根据实施例73所述的方法，其中所述双特异性抗体肽或其片段包括选自由以下组成的组的双特异性抗体肽：CD3；以及EGFR。

69，其中所述肿瘤特异性抗原肽包括选自由以下组成的组的肿瘤特异性抗原肽：多巴色素-互变异构酶(TRP2)、黑色素细胞蛋白PMEL(gp100)、HPVE6/7、MAGE 1、MAGE 3、NY-ESO、雄激素受体(AR)、BCL-1、钙卫蛋白、癌胚抗原(CEA)、EGFR、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、上皮唾液粘蛋白、膜雌激素受体(mER)、FAP HER2/neu、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、IL-6、MOC-1、MOC-21、MOC-52、黑色素A/MART-1、黑色素瘤相关抗原、粘蛋白、OKT9、孕激素受体(PGR)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、突触素、VEGFR、CD19、CD20、CD22、CD30以及CD33。

76.根据实施例69所述的方法，其中所述免疫应答包括受试者的CD8-T细胞激活。

77.根据实施例69所述的方法，其进一步包括转染所述供体细胞以过表达破坏巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质或替代性地转染所述供体细胞以过表达促进巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质的步骤。

78.根据实施例77所述的方法，其中转染所述供体细胞以过表达破坏所述EV的巨噬细胞清除的一种或多种蛋白质的所述步骤包括转染所述供体细胞以过表达CD47的步骤，或替代性地转染所述供体细胞以过表达促进巨噬细胞或树突状细胞对所述EV的清除的一种或多种蛋白质包括转染所述供体细胞以过表达抗CD47纳米抗体的步骤。

79.一种组合物，其包括具有融合缺陷型促融合蛋白的胞外囊泡(EV)，所述融合缺陷型促融合蛋白能够掺入到EV的膜中并且被进一步配置成与至少一种抗体肽或肿瘤特异性抗原肽偶联。

80.根据实施例79所述的组合物，其中所述融合缺陷型促融合蛋白包括水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒融合蛋白。

81.根据实施例80所述的组合物，其中所述融合缺陷型VSV-G突变蛋白包括带标签的融合缺陷型VSV-G突变蛋白。

82.根据实施例79所述的组合物，其中所述抗体肽包括双特异性抗体肽或其片段。

83.根据实施例82所述的组合物，其中所述双特异性抗体肽或其片段包括选自由以下组成的组的双特异性抗体肽：CD3；以及EGFR。

84.根据实施例79所述的组合物，其中所述肿瘤特异性抗原肽包括选自由以下组成的组的肿瘤特异性抗原肽：多巴色素-互变异构酶(TRP2)、黑色素细胞蛋白PMEL(gp100)、HPVE6/7、MAGE 1、MAGE 3、NY-ESO、雄激素受体(AR)、BCL-1、钙卫蛋白、癌胚抗原(CEA)、EGFR、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、上皮唾液粘蛋白、膜雌激素受体(mER)、FAP HER2/neu、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、IL-6、MOC-1、MOC-21、MOC-52、黑色素A/MART-1、黑色素瘤相关抗原、粘蛋白、OKT9、孕激素受体(PGR)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、突触素、VEGFR、CD19、CD20、CD22、CD30以及CD33。

85.根据实施例79所述的组合物，其中所述免疫应答包括受试者的CD8-T细胞激活。

86.根据实施例79所述的组合物，并且进一步包括破坏所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的一种或多种蛋白质，或替代性地进一步包括促进所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的一种或多种蛋白质。

87.根据实施例86所述的组合物，其中破坏所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的所述一种或多种蛋白质包括CD47，或替代性地其中促进所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的所述一种或多种蛋白质包括抗CD47纳米抗体。

88.一种组合物，其包括EV，所述EV具有与分裂补体系统的第一组分偶联的融合缺陷型促融合蛋白以及所述分裂补体系统的第二组分，其中所述膜结合蛋白和所述分裂补体系统的所述第二组分被任选地配置成与至少一个靶分子偶联。

89.根据实施例88所述的组合物，其中所述融合缺陷型促融合蛋白包括水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒融合蛋白。

90.根据实施例89所述的组合物，其中所述分裂补体系统包括选自由以下组成的组的分裂补体系统：分裂GFP系统；NanoBiT分裂泛素系统；分裂β-gal系统；分裂荧光素酶系统；分裂mCherry系统；分裂FRET系统；以及分裂生物素系统。

91.根据实施例88所述的组合物，其中所述抗体肽包括双特异性抗体肽或其片段。

92.根据实施例91所述的组合物，其中所述双特异性抗体肽或其片段包括选自由以下组成的组的双特异性抗体肽：CD3；以及EGFR。

93.根据实施例88所述的组合物，其中所述肿瘤特异性抗原肽包括选自由以下组成的组的肿瘤特异性抗原肽：多巴色素-互变异构酶(TRP2)、黑色素细胞蛋白PMEL(gp100)、HPVE6/7、MAGE 1、MAGE 3、NY-ESO、雄激素受体(AR)、BCL-1、钙卫蛋白、癌胚抗原(CEA)、EGFR、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)、上皮唾液粘蛋白、膜雌激素受体(mER)、FAP HER2/neu、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、IL-6、MOC-1、MOC-21、MOC-52、黑色素A/MART-1、黑色素瘤相关抗原、粘蛋白、OKT9、孕激素受体(PGR)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、突触素、VEGFR、CD19、CD20、CD22、CD30以及CD33。

94.根据实施例88所述的组合物，其中所述免疫应答包括受试者的CD8-T细胞激活。

95.根据实施例88所述的组合物，并且进一步包括破坏所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的一种或多种蛋白质，或替代性地进一步包括促进所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的一种或多种蛋白质。

96.根据实施例95所述的组合物，其中破坏所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的所述一种或多种蛋白质包括CD47，或替代性地其中促进所述EV的巨噬细胞或树突状细胞清除的所述一种或多种蛋白质包括抗CD47纳米抗体。

根据下文呈现的详细描述和附图，本发明技术的另外的方面将显而易见。

附图说明

图1A-G：用于特定蛋白的细胞间转移的双组分荧光g型核外颗粒体的开发。(A)通过VSV-G与sfGFP或分裂GFP融合锚定的单组分和双组分g型核外颗粒体的示意图。(B-C)通过流式细胞术分析了用指示的模拟、VSV-G或BlaM构建体转染的HEK293T细胞的细胞内荧光信号。(C)通过NanoSight分析来自模拟、VSV-G-sfGFP和VSV-G转染的细胞的上清液中的颗粒。针对每个样品示出了透明散射通道和FITC通道中的上清液的曲线。应注意的是，由NanoSight软件针对每个样品调整y轴的比例，以进行清晰的曲线比较。插图中示出的大小分布(S)和颗粒浓度(C)是每种上清液的储备浓度。误差条表示测量值的标准误差。(D)模拟、VSV-G-sfGFP和VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10转染的细胞的上清液中存在的颗粒的大小和荧光强度的FACS分析。最左侧图示出了Apogee Flow二氧化硅荧光珠大小标准品(系统生物科学公司(SystemBiosciences))(110nm-1,300nm)的分布。(E)用VSV-G抗体染色的代表性VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10g型核外颗粒体的负染色电子显微镜图像。一级抗体：VSVG抗体；二级抗体：GAM IgG/M 6nm。(F)g型核外颗粒体介导的蛋白质转导的示意图。(G-H)用荧光CCF2β-内酰胺酶底物装载并且与从对照、VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10和VSV-G(P127D)-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10转染的HEK293T细胞采集的g型核外颗粒体一起温育的海拉(HeLa)细胞的流式细胞术分析。误差条，标准偏差。

图2A-FL：用细胞蛋白装载g型核外颗粒体的多功能性。(A)由g型核外颗粒体转导Cre蛋白的示意图。当由两个LoxP位点侧接的终止密码子被Cre重组酶环出时，293ColorSwitch细胞经历红到绿颜色切换。(B)用VSV-G-vpr-GFP11和Cre-vpr-GFP1-10表达载体瞬时转染的HEK293T细胞的细胞内荧光强度的流式细胞术分析。(C)指示在用VSV-G-GFP11和Cre-vpr-GFP1-10转染后在HEK293T细胞中产生的总EV(透明散射)和荧光g型核外颗粒体(GFP通道)的大小(S)和浓度(C)的NanoSight数据。变异性由平均值的±1标准误差指示。(D)293ColorSwitch细胞与从使用VSV-G/Cre-vpr-GFP1-10或VSV-G-GFP11/Cre-vpr-GFP1-10表达载体转染的HEK293T细胞收集的g型核外颗粒体温育。(E)对与对照和Cre g型核外颗粒体温育之后的293ColorSwitch细胞的共聚焦成像。未经处理的对照细胞针对红色荧光呈阳性，并且绿色细胞不可见。Cre的g型核外颗粒体递送应促进DsRed盒的去除，从而允许eGFP表达。由于DsRed的半衰期较长，因此在测量时，切换的细胞针对DsRed和eGFP均呈阳性。(F)Cre介导的颜色切换的效率的定量。误差条，标准偏差。(G)蛋白质印迹示出了分别从Triton不可溶级分和可溶级分中的HEK293T细胞培养上清液(顶部图)和细胞裂解物中采集的VSV-G和货物蛋白。对GAPDH进行印迹分析作为装载对照。(H)永生化细胞系或癌细胞系中的g型核外颗粒体介导的蛋白质转导。在与相同量的VSV-G-GFP-BlaM g型核外颗粒体温育16小时后，测试细胞系的BlaM活性。(I)g型核外颗粒体可以介导到MEF1、iPS和从小鼠器官分离的原代细胞中的蛋白质转导。

图3A-F：培养的细胞中的生物活性蛋白的VSV-G g型核外颗粒体递送的剂量和动力学。(A)由g型核外颗粒体转移BlaM-vpr蛋白质的效率。每毫升VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10荧光囊泡的数量通过NanoSight来确定。在对BlaM阳性细胞进行流式细胞术分析之前，将固定数量的海拉细胞(1×10

图4A-C：VSV-G g型核外颗粒体的纯化。(A)g型核外颗粒体纯化的示意图。(B)通过两种不同的富集方法对VSV-G-sfGFP的免疫印迹分析。指示了通过NanoSight或流式细胞术确定的针对每种方法在凝胶上装载的胞外颗粒的数量。将指示量的重组VSV-G蛋白(阿尔法诊断公司(AlphaDiagnostics))用作用于对颗粒中的VSV-G-sfGFP进行定量的标准品。底部图：免疫印迹之前对硝酸纤维素膜的丽春红S染色。69kDa条带可能是来自血清的牛白蛋白。(C)通过(B)中所述的两种纯化方法对g型核外颗粒体中的货物富集的定量免疫印迹分析。将指示量的重组BlaM装载到凝胶上作为用于进行定量的标准品。

图5A-C：用分裂GFP系统主动装载VSV-G g型核外颗粒体减少了细胞蛋白的非特异性掺入。(A)示出了竞争性生物分子货物到g型核外颗粒体中的包封的实验设计的图示。VSV-G核外颗粒体中的货物蛋白Cre-GFP1-10竞争性地抑制随机细胞蛋白的非特异性包装。将不带标签的BlaM用作用于测量到g型核外颗粒体中的非特异性掺入的代替物。(B)如所指示的，用质粒转染HEK293T细胞，并且在48小时后，将上清液用于感染海拉细胞以用于测试指示浓度下的BlaM活性(8×，经过超速离心)并用于感染293ColorSwitch细胞以用于用原始上清液测试Cre活性。图示出了具有Cre-GFP1-10和BlaM活性的细胞百分比。(C)蛋白质印迹示出了从HEK293T细胞(左图)中采集的VSV-G-GFP11、Cre-GFP1-10和BlaM蛋白以及来自使用VSV-G-GFP11与如(A)中的Cre-GFP1-10和BlaM质粒转染的海拉细胞的上清液(右图，经过超速离心)。底部图示出了GAPDH装载对照。

图6A-I：g型核外颗粒体与外泌体的功能性分离。(A)g型核外颗粒体和外泌体递送的示意图。(B)单独或组合地使用VSV-G-GFP11、CD9-GFP11、CD81-GFP11和Cre-GFP1-10质粒瞬时转染的HEK293T细胞的流式细胞术分析。(C)来自单独或组合地使用VSV-G-GFP11、CD9-GFP11、CD81-GFP11和Cre-GFP1-10质粒转染的HEK293T细胞的培养上清液的EV的NanoSight分析。(D)左：来自单独或组合地使用VSV-G-GFP11、CD9-GFP11、CD81-GFP11和Cre-GFP1-10质粒转染的HEK293T细胞的上清液在293ColorSwitch细胞中的转化的流式细胞术分析。右：293ColorSwitch细胞中的转化效率的定量。(E)蛋白质印迹示出了用CRISPR/Cas9/sgMunc13D处理的HEK293T细胞中的Munc13D、CD9和GW130蛋白的水平。(F)CD9-mCherry在用CRISPR/Cas9/sgMunc13D处理的HEK293T细胞和使用CD9-mCherry质粒瞬时转染的对照细胞中的转染效率。(G)具有从用CRISPR/Cas9/sgMunc13D处理的HEK293T细胞和对照细胞分泌的CD9-mCherry表达的EV的流式细胞术分析。(H)使用流式细胞术分析来确定具有从用CRISPR/Cas9/sgMunc13D处理的HEK293T细胞和G.中的对照细胞分泌的CD9-mCherry表达的EV的百分比。(I)Munc13D基因敲低对VSV-G-GFP-BlaM g型核外颗粒体的分泌和摄取没有影响。将HEK293T细胞用CRISPR/Cas9/sgMunc13D处理并且然后使用VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10瞬时转染。48小时之后，收集上清液以感染海拉细胞，并且然后用荧光CCF2β-内酰胺酶底物装载海拉细胞以测试BlaM活性。

图7A-G：对VSV-G g型核外颗粒体进行RNA干扰编程。(A)VSV-G g型核外颗粒体介导海拉细胞中的PINK1敲低。用CCCP处理稳定地表达维纳斯-帕金(Venus-Parkin)和RFP-MTS-Smac的海拉细胞导致维纳斯-帕金累积在线粒体(绿色斑点)上。直接用靶向人PINK1(shPINK1)的shRNA转染的细胞示出了减少的维纳斯-帕金线粒体募集。从HEK293T采集的VSV-G-GFP11/AGO2-GFP1-10/PINK1shRNA囊泡在扰动PINK1功能(VSVG/AGO2/PINK1)方面更有效，而用Elav取代AGO2则使PINK1活性不受扰动(VSVG/Elav/PINK1)。由任何两种组分制备的囊泡也是无效的。(B)根据(A)中的图像，线粒体上具有帕金蛋白的细胞百分比。(C)qRT-PCR示出了如(A)中所述处理的细胞中的PINK1敲低的效率。(D)蛋白质印迹示出了在海拉-维纳斯-帕金细胞中存在或不存在CCCP的情况下用VSV-G-GFP11/AGO2/shPINK1或对照shRNA处理之后的PINK1蛋白表达。(E)将稳定地表达维纳斯-帕金的海拉细胞与培养基对照或从用VSV-G-GFP11/SaCas9-GFP1-10/sgPINK1转染的HEK293T细胞中采集的g型核外颗粒体温育。将PINK1的sgRNA设计成靶向PINK1的外显子2。对照和经过g型核外颗粒体处理的海拉维纳斯-帕金细胞两者均用CCCP处理2小时。CCCP以PINK1依赖性方式触发线粒体上的维纳斯-帕金累积。与对照相比，暴露于VSV-G-GFP11/SaCas9-GFP1-10/sgPINK1g型核外颗粒体的细胞示出了减少的维纳斯-帕金线粒体募集。(F)示出了在存在CCCP的情况下线粒体上的维纳斯-帕金累积的细胞的百分比的定量。(G)蛋白质印迹示出了在存在或不存在CCCP的情况下用VSV-G-GFP11/SaCas9-GFP1-10/sgPINK1g型核外颗粒体或对照处理之后的PINK1蛋白表达。

图8A-F：VSV-G g型核外颗粒体上的CD47表达通过使单核细胞循环降低了清除率。(A)示出了用于测试CD47到细胞中的转移的实验程序示意性图示。(B)如(A)中所述，蛋白质印迹示出了HEK293T和分泌到培养上清液中的g型核外颗粒体中的货物蛋白的表达。(C)在与从用Raw264.7巨噬细胞预处理的上清液中收集的VSV-G-BlaM-g型核外颗粒体温育指示的时间之后，对用荧光CCF2β-内酰胺酶底物装载的海拉细胞中的BlaM活性的流式细胞术分析。(D)对被乙醛硫酸盐珠粒吸附并且来自与来自HEK293T的VSV-G-BlaM g型核外颗粒体温育的Raw264.7巨噬细胞的上清液的VSV-G-BlaM g型核外颗粒体的流式细胞术分析。(E)蛋白质印迹示出了有和没有CD47的VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体中的蛋白质。(F)对在静脉内注射之后3小时，小鼠血液循环中的VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体的流式细胞术分析。注射了在150μL PBS中有或没有过表达的CD47的10

图9A-E：通过基因编辑机制的系统性g型核外颗粒体递送在小鼠肝脏中的mPCSK9基因编辑。(A)体内小鼠实验的示意图。(B)注射之后血清PCSK9水平的时间过程(对于所有滴度和时间点，n＝3，误差条示出了S.E.M.)。(C)尾静脉注射1×10

图10A-C：(A)单独或组合地表达VSV-G-sfGFP、VSV-G-GFP11、VSV-G(P127D)-GFP11和货物BlaM-vpr-GFP1-10的HEK293T细胞的图像。(B)蛋白质印迹示出了分别从Triton不可溶级分和可溶级分中的HEK293T细胞培养上清液(顶部图)和细胞VSV-G和BlaM蛋白中采集的功能性突变VSV-G和BlaM蛋白。底部图示出了GAPDH装载对照。单独或组合地使用VSV-G-sfGFP、VSV-G-GFP11和BlaM-vpr-GFP1-10或其它货物瞬时转染HEK293T细胞。(C)胰蛋白酶处理消除了VSV-G-BlaM g型核外颗粒体与海拉细胞的融合。图示出了与从VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10转染的HEK293T培养上清液采集的核外颗粒体温育之后，用荧光CCF2β-内酰胺酶底物装载的海拉细胞的百分比。然后使用胰蛋白酶处理HEK293T细胞培养上清液指示的时间。

图11A-B：(A)对单独或组合地使用质粒VSV-G-GFP11和与GFP1-10融合的货物瞬时转染的HEK293T细胞的流式细胞术分析。(B)单独或组合地表达VSV-G-GFP11以及货物Cre-vpr-GFP1-10、AGO2-GFP1-10和SaCas9-GFP1-10的HEK293T细胞的图像。

图12：在连续的差分超速离心沉淀物中回收来自异质分泌性EV的蛋白质内容物。收集模拟和VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10转染的HEK293T细胞培养上清液并且通过在2,000rpm下离心10分钟进行清理。在10,000×g或100,000×g下对连续的上清液超速离心1.5小时。用所指示抗体通过蛋白质印迹来分析沉淀物(10K、100K)。

图13：(A)VSV-G-GFP11/AGO2g型核外颗粒体中PINK1基因的shRNA的RNAseq信号值。使用VSV-G-GFP11/AGO2-GFP1-10质粒与对照或shPINK1质粒转染HEK293T细胞。采集GFP阳性VSV-G-GFP11/AGO2g型核外颗粒体并且使用BDAria Fusion细胞分选仪通过流式细胞术进行纯化。从分选的绿色颗粒中提取RNA并且然后提交以进行RNAseq分析。(B)VSV-G-GFP-SaCas9g型核外颗粒体中PINK1基因的sgRNA的RNAseq信号值。使用VSV-G-GFP11/SaCas9-GFP1-10质粒与sgPINK1或模拟质粒转染HEK293T细胞。采集GFP阳性VSV-G-GFP11/SaCas9g型核外颗粒体并且使用BDAria Fusion细胞分选仪通过流式细胞术进行纯化。从分选的绿色颗粒中提取RNA并且然后提交以进行RNAseq分析。

图14A-B：对VSV-G g型核外颗粒体进行编程以用于异位表达的PINK1的基因编辑。(A)将稳定地表达EGFP-PINK1的海拉细胞与对照或从用VSV-G-GFP11/SaCas9-GFP1-10/sgPINK1转染的HEK293T培养上清液中采集的g型核外颗粒体温育。将PINK1的sgRNA设计成靶向PINK1的外显子2。对照和暴露于活性g型核外颗粒体的海拉-PINK1-EGFP细胞两者均用CCCP处理2小时。CCCP阻止EGFP-PINK1导入到线粒体中并且防止PINK1降解，从而使EGFP-PINK1稳定并且EGFP信号向右移动(Ctrl顶部和底部图)。在暴露于VSV-G-SaCas-sgPINK1g型核外颗粒体的细胞中，EGFP信号的增加要低得多。(B)示出了在存在CCCP的情况下的EGFP增加的细胞的百分比。蛋白质印迹示出了在存在或不存在VSV-G-SaCas-sgPINK1和/或CCCP的情况下的EGFP-PINK1蛋白表达。

图15A-B：VSV-G样病毒糖蛋白和人内源性Gag样可以被重新用于核外颗粒体介导的生物制剂细胞间转移和基因组编辑。(A)对用带GFP11标签的病毒糖蛋白和与BlaM-Vpr-GFP1-10共表达的人Gag样蛋白转染的293T细胞产生的核外颗粒体的Nanosight分析。(B)CNV-G核外颗粒体在蛋白质转移中的细胞类型特异性。

具体实施方式

本发明技术总体上包含用于在体外和/或体内生成工程化或可编程的促融合分泌性囊泡的系统、方法和组合物，所述工程化或可编程的促融合分泌性囊泡可以被配置成用一个或多个特异性靶分子装载。如图1A和F中总体上示出的，在一个实施例中，可以将供体细胞工程化以生成具有在囊泡的表面上表达的靶向部分的促融合分泌性囊泡。此靶向部分可以包含可以与靶细胞或受体细胞上存在的部分结合的蛋白质或蛋白质片段。如下所述，在一个优选的实施例中，工程化的促融合分泌性囊泡可以包含VSV-G蛋白，所述VSV-G蛋白已经被工程化以进一步包含相互作用部分，所述相互作用部分可以被包封的蛋白质直接或间接地识别以形成相互作用复合物。此相互作用部分可以进一步被配置成被包封的蛋白质识别，所述包封的蛋白质可以进一步结合如本文通常所描述的蛋白质、蛋白质片段、核酸和/或小分子。

再次总体上参考图1A和F，在一个实施例中，本发明可以进一步包含用于利用如本文通常所描述的一种或多种蛋白质、核酸和/或小分子生成和/或装载工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体的方法。在一个优选的实施例中，可以通过电穿孔、脂质体转染或与其它类型的囊泡融合以及本领域已知的其它机制用靶货物装载工程化的促融合分泌性囊泡。本发明可以进一步包含用于生成工程化的促融合分泌性囊泡(通常被称为g型核外颗粒体)的系统、方法和组合物，所述工程化的促融合分泌性囊泡具有含有相互作用部分的VSV-G或相关病毒G蛋白和/或其它微囊泡产生性蛋白，所述相互作用部分可以被结合如本文通常所概述的蛋白质/肽、核酸或小分子的包封的蛋白质识别。

本发明可以进一步包含用于生成工程化的促融合分泌性囊泡的系统、方法和组合物，所述工程化促融合分泌性囊泡具有人gag样内源性蛋白和可以被结合如本文通常所概述的蛋白质/肽、核酸或小分子的包封的蛋白质识别的相互作用部分。在优选的实施例中，工程化的促融合分泌性囊泡可以包含人gag样内源性蛋白和可以执行基因功能的扰动的相互作用部分，如Cas9、dCas9、SaCas9、dSaCas9、LwaCas13、Cas13、C2c1、C2C3、C2c2、Cfp1、CasX、碱基编辑器、CRISPRi、CRISPRa、CRISPRX、CRISPR-STOP和如本文通常所描述的碱基编辑器。

在一个实施例中，本发明可以包含将如Cre重组酶等重组酶装载到工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体中。此Cre重组酶可以进一步通过VSV-G介导的从供体细胞到靶细胞的转移进行转运，从而在受体细胞中产生永久性变化的编码基因组。如图2-3中总体上示出的，HEK293CRE报告细胞系表达含有DsRed的报告基因，所述报告基因带有由GFP上游的两个LoxP位点侧接的终止密码子。在没有CRE的情况下，CMV启动子将DsRed高表达驱动到终止密码子，并且细胞显示出强红色荧光。由于在DsRed之后的终止密码子，未表达下游GFP ORF。通过VSV-G核外颗粒体引入Cre后，CRE切除/缺失两个loxP位点之间的DNA片段，这去除了终止密码子，从而产生了如通过流式细胞术检测到的强绿色荧光。图2-3进一步证明了在此实施例中VSV-G、VSV-G-GFP11与Cre-GFP1-10的转化效率。

如上文所指出的，在一个优选的实施例中，工程化的促融合分泌性囊泡可以包含VSV-G，所述VSV-G已经被工程化以进一步包含相互作用部分，所述相互作用部分可以被包封的蛋白质直接或间接地识别以形成相互作用复合物。在一个优选的实施例中，可以通过与VSV-G或其它促融合蛋白如病毒糖蛋白的直接和/或间接相互作用来选择一个或多个靶分子。例如，在某些优选的实施例中，可以利用埃博拉、狂犬病、丙型肝炎、淋巴细胞脉络丛脑膜炎(LCMV)、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)和钱德普拉(Chandpura)(CNV)中的VSV-G样蛋白来产生可编程的核外颗粒体，所述可编程的核外颗粒体可以用于如本文通常所描述地转移蛋白质、RNAi和/或基因组编辑剂。如本文所述，这种促融合蛋白不仅可以促进可编程核外颗粒体的产生，而且还可以表现出独特的宿主和/或细胞范围。例如，在一个实施例中，可以使用病毒G蛋白如CNV-G来生成可编程的核外颗粒体。如图16中总体上示出的，这种CNV-G衍生的可编程核外颗粒体可以主要靶向神经元和淋巴细胞。如此，本发明技术允许生成细胞、组织和/或生物体的特异性可编程分泌性促融合核外颗粒体囊泡。

在另一个实施例中，本发明的技术可以进一步包含分泌性促融合囊泡如g型核外颗粒体的生成，所述分泌性促融合囊泡可以被进一步引入到本文通常描述的类型的蛋白质、核酸或小分子中。在一个实施例中，可以用如本文通常鉴别的蛋白质、核酸或小分子进行电穿孔或转染的分泌性促融合囊泡。在一个实施例中，自补分裂荧光蛋白(FP)可以用于生成具有重组VSV-G变体的双组分荧光g型核外颗粒体。这种VSV-G核外颗粒体可以被配置成介导VSV-G相互作用蛋白从供体细胞到靶细胞的转移。例如，在某些实施例中，可以生成若干种VSV-G变体。这种VSV-G变体可以含有衍生自分裂蛋白质系统的短肽标签，所述短肽标签使VSV-G能够与和其互补片段融合的任何一种或多种蛋白质形成稳定的复合物。例如，在一个实施例中，VSV-G与16个氨基酸的肽标签(GFP11)融合。当与其互补片段GFP1-10共表达时，这一融合生成荧光。在一个优选的实施例中，氨基酸肽标签GFP1-10可以与靶分子融合，所述靶分子如可以修饰基因表达或对靶细胞具有其它某种表型或治疗性作用的蛋白质。在此实施例中，GFP1-10-融合物可以与例如VSV-G-GFP11共表达，从而产生以高保真度从供体细胞到受体细胞的转移功能。

如上文所指出的，本发明可以包含分泌性促融合囊泡如g型核外颗粒体用于将新的和/或增强的表型、酶促或甚至代谢变化转移至受体细胞的用途。例如，在一个实施例中，帮助转移负责产生信号传导分子的酶的分泌性促融合囊泡可以包含在本发明中，所述信号传导分子包含但不限于cAMP和cGMP-AMP。如上文所指出的，在某些实施例中，本发明可以包含用于改进系统以通过分泌性促融合核外颗粒体囊泡将靶核糖核酸或治疗性RNA分子包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在此优选的实施例中，可以由供体细胞生成g型核外颗粒体，所述g型核外颗粒体可以被配置成包封蛋白质-RNA复合物以靶向RNAi对所关注基因的抑制。

在一个具体实施例中，结合小干扰RNA(siRNA)以及包含微RNA(miRNA)和Piwi相互作用RNA(piRNA)的其它非编码RNA的RNA诱导沉默复合物(RISC)的已知基本组分AGO2可以与标签如GFP1-10融合并且与VSV-G-GFP11以及靶干扰RNA分子如短发夹RNA(shRNA)共同引入。在此实施例中，通过直接转染，例如在体外模型中，可以将GFP1-10-AGO2构建体与VSV-G-GFP11和靶shRNA共同引入到受体细胞。在替代性实施例中，GFP1-10-AGO2构建体可以在体外或体内系统中通过将可编程的g型核外颗粒体从供体细胞引入到受体细胞与VSV-G-GFP11和靶shRNA共同引入，如图1A和F中总体上概述的。在上述实施例中的每个实施例中，靶RNAi分子如shRNA可以被配置成抑制靶细胞中特异性内源性基因的表达。可替代地，在某些优选的实施例中，靶RNAi分子如shRNA可以被配置成抑制特异性外源性基因如必需细菌或病原体基因或其它转基因的表达。

本发明进一步包含用于改进系统以通过分泌性促融合核外颗粒体囊泡如g型核外颗粒体将靶基因组编辑分子包封并递送到受体细胞的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包含被配置成以预定方式将特异性基因组编辑蛋白选择性地包封并递送到受体细胞的可编程的促融合核外颗粒体囊泡，如g型核外颗粒体。实例可以包含但不限于：

在优选的实施例中，本发明技术可以包含用于生成分泌性促融合囊泡的系统、方法和组合物，所述分泌性促融合囊泡含有Cas9和/或Cas13或与被称为

本发明技术可以进一步包含通过人Gag样蛋白的作用生成工程化的促融合分泌性囊泡。在此实施例中，一种或多种人Gag样内源性蛋白可以与相互作用部分如GFP11或类似的标签偶联，所述相互作用部分可以被结合如本文通常所描述的蛋白质/肽、核酸或其它小分子的包封的蛋白质识别。

本发明可以进一步包含用于治疗疾病病状的工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体的用途的系统、方法和组合物。实例可以包含但不限于癌症的治疗和/或预防、自身免疫性病状、疫苗以及器官和/或细胞移植排斥。在一个优选的实施例中，可以将治疗有效量的如本文通常所述的工程化的促融合分泌性囊泡引入到表现出疾病病状的受体细胞，使得工程化的促融合分泌性囊泡的作用可以缓解和或预防疾病病状。在另外的实施例中，工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体可以用于提高宿主免疫力和/或代谢适应性或甚至置换受体细胞中缺失或有缺陷的细胞途径。

在另外的实施例中，本发明可以包含例如通过表达防止免疫系统清除的表面生物标志物来生成可以抵抗免疫系统的清除的高效持久g型核外颗粒体。如图8所示，在一个优选的实施例中，可以通过在g型核外颗粒体的表面上过表达和呈递CD47蛋白来抵抗巨噬细胞的清除的这种高效持久g型核外颗粒体。

尽管已经参考多个实施例特别示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以对本文公开的各种实施例进行形式和细节上的改变而不背离本发明的精神和范围并且本文公开的各种实施例并不旨在充当对权利要求的范围的限制。本文所引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入。本文所使用的术语用于描述特定实施例并且不旨在是限制性的。如本文所使用的，除非内容和上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，对“一个”或“所述”标志物的引用可以包含两个或更多个这种标志物的组合。除非另外定义，否则所有科学和技术术语应被理解为具有与其所属领域中通常使用的含义相同的含义。出于本发明的目的，下文中定义了以下术语。

如本文通常所使用的，含VSY-G的EV通常被称为“g型核外颗粒体”。在其它实施例中，含有一种或多种促融合蛋白的EV也可以被称为“核外颗粒体”。

如本文所使用的，术语“促融合”是指微囊泡的质膜与靶细胞的膜的融合。“融合囊泡”可以包含掺入促融合蛋白的囊泡。

术语“内源性”蛋白是指所述蛋白质不是从真核细胞的基因组中天然发现的基因表达的。

术语“外源性”蛋白是指所述蛋白质不是从真核细胞的基因组中天然发现的基因表达的。

术语“促融合蛋白”是指可以诱导VLP的质膜来源的包膜与受体细胞的膜融合的蛋白质并且优选地病毒蛋白。正是这种机制导致VLP的蛋白质组分进入细胞质。众所周知，RNA病毒和逆转录病毒的包膜糖蛋白结合细胞受体并且诱导此融合。因此，这些蛋白质负责这些病毒的感染性。促融合蛋白的其它实例包含但不限于流感血凝素(HA)、呼吸道合胞病毒融合蛋白(RSVFP)、蜱传脑炎病毒(TBEV)和登革热病毒的E蛋白、西门利克森林病毒(SFV)的E1蛋白、狂犬病病毒和水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白以及杆状病毒gp64。也可以使用这些蛋白质的功能等效片段或衍生物。功能上等效的片段或衍生物将保留野生型蛋白的促融合活性的至少50％、更优选地至少75％并且最优选地至少90％。

特别优选的是来自水泡性口炎病毒(VSV-G)的包膜糖蛋白。VSV-G具有高促融合活性，并且几乎所有哺乳动物细胞都可以通过其质膜糖蛋白的碳水化合物部分结合VSV-G。不希望被理论所束缚，VSV-G细胞表面相互作用的分子机制由连接组成，之后是细胞的膜与病毒包膜之间的膜融合步骤。流感病毒血凝素和宿主细胞质膜的此过程已得到充分证明。

可以利用能够产生微囊泡的任何方便的细胞。在一些情况下，细胞是真核细胞。所关注细胞包含真核细胞，例如动物细胞，其中动物细胞的具体类型包含但不限于：昆虫、蠕虫、禽或哺乳动物细胞。可以使用各种哺乳动物细胞，包含例如马、牛、绵羊、犬、猫、鼠、非人灵长类动物和人细胞。在各种物种中，可以使用各种类型的细胞，如造血、神经、神经胶质、间充质、皮肤、粘膜、基质、肌肉(包含平滑肌细胞)、脾脏、网状内皮、上皮、内皮、肝、肾、胃肠、肺、成纤维细胞和其它细胞类型。所关注的造血细胞包含可以与红系、淋巴或骨髓单核细胞谱系有关的有核细胞以及成肌细胞和成纤维细胞中的任何一种。还关注的是干细胞和祖细胞，如造血、神经、基质、肌肉、肝、肺、胃肠和间充质干细胞，如ES细胞、epi-ES细胞和诱导性多能干细胞(iPS细胞)。所关注的特异性细胞包含但不限于：哺乳动物细胞，例如，HEK-293和HEK-293T细胞、COS7细胞、海拉细胞、HT1080、3T3细胞等；昆虫细胞，例如，High5细胞、Sf9细胞、Sf21等。另外的所关注细胞包含但不限于美国公开第20120322147号中描述的那些细胞，所述公开的公开内容通过引用的方式并入本文。

在具体实施例中，本发明还涉及用于通过使靶细胞与具有其它所关注分子的靶蛋白的货物的工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体接触而将所关注蛋白递送到所述靶细胞中的体外方法。靶细胞的实例是常见的实验室细胞系，如海拉细胞和衍生物、HEK293细胞、HEK293T细胞、NIH3T3细胞和衍生物、HepG2细胞、HUH7细胞和衍生物、小肺癌细胞、Caco-2细胞、L929细胞、A549细胞、MDCK细胞、THP1细胞、U937细胞、Vero细胞和PC12细胞；从骨髓、血液、脐带中纯化的人造血细胞CD34+；从血液单核细胞或从CD34+细胞分化的树突状细胞(DC)；从血液中纯化的原代人细胞，包含T细胞(CD8和CD4)、B细胞(包含记忆B细胞)、肥大细胞、巨噬细胞、DC、NK细胞；从血液中纯化的原代鼠细胞，包含T细胞(CD8和CD4)、B细胞(包含记忆B细胞)、肥大细胞、巨噬细胞、DC、NK细胞；原代人成纤维细胞，包含MRCS细胞、IMR90细胞；来自人、鼠、大鼠、鸡、兔来源的原代鼠成纤维细胞和胚胎干细胞(ES)。

如上文所总结的，本发明的各方面包含通过引入工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体来将蛋白质引入到靶细胞中的方法。这种方法包含在足以使微囊泡与靶细胞融合并且将工程化的促融合分泌性囊泡中含有的靶蛋白或分子递送到细胞中的条件下，将靶细胞与工程化的促融合分泌性囊泡接触，所述工程化的促融合分泌性囊泡例如如上所述，其中工程化的促融合分泌性囊泡可以存在于群体的组合物中(例如，其中工程化的促融合分泌性囊泡的数量的范围为10

如上文所指出的，靶蛋白可以包含研究蛋白，所述研究蛋白可以包含其活性可用于研究方案中和/或用作治疗方案的蛋白质。如此，研究蛋白是在实验程序中采用的蛋白质。研究蛋白可以是具有这种效用的任何蛋白，其中在一些情况下，研究蛋白是蛋白质结构域，所述蛋白质结构域也在研究方案中通过从编码载体在细胞中对其进行表达而提供。研究蛋白的具体类型的实例包含但不限于：诱导型表达系统的转录调节剂、信号产生系统的成员，例如其酶和底物、激素、激素原、蛋白酶、酶活性调节剂、微扰二聚物(perturbimer)和肽适体、抗体、蛋白-蛋白相互作用的调节剂、如CRE重组酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas-9核酸酶、TAL效应物核酸酶等基因组修饰蛋白、如Oct 3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin-28等细胞重编程蛋白等。

靶蛋白可以是活性可用于诊断方案中的诊断蛋白。如此，诊断蛋白是在诊断程序中采用的蛋白质。靶诊断蛋白可以是具有这种效用的任何蛋白质。诊断蛋白的具体类型的实例包含但不限于：信号产生系统的成员例如酶和其底物)、标记的结合成员例如标记的抗体和其结合片段、肽适体等。

所关注的靶蛋白进一步包含治疗性蛋白。所关注的治疗性蛋白包含但不限于激素以及生长和分化因子，包含但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GHRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子β超家族(包含TGFβ、激活素、抑制素)中的任何一种或骨形态发生蛋白(BMP)(包含BMP 1-15)中的任何一种、生长因子、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白、集聚蛋白的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族中的任何一种、脑信号素/脑衰蛋白、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶的家族中的任何一种。所关注的靶蛋白进一步包含但不限于：纤溶蛋白，包含但不限于尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)和组织纤溶酶原激活物(tpA)；促凝血蛋白，如因子Vila、因子VIII、因子IX和纤维蛋白原；用于改变血栓形成位点处的止血平衡的纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、血管性血友病因子、因子V、ADAMTS-13和纤溶酶原；等。作为靶蛋白所关注的还有转录因子，如jun、fos、max、mad、血清应答因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD、肌生成素、含ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、威尔姆斯肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白例如GATA-3和带翼螺旋蛋白的叉头家族。作为靶蛋白所关注的还有氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富马酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰coA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调节(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。

进一步包含用于通过在体内或体外向受试者施用或引入治疗有效量的被配置成具有治疗性作用的工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体来改善疾病疗法的功效的方法。在此上下中，术语“有效”或“有效量”或“治疗有效量”应广义地理解为包含减少或减轻疾病的体征或症状、改善疾病的临床病程或减少疾病的任何其它客观或主观指标。

如本文所使用的，术语“核酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。“核酸”或“核酸剂”聚合物通常以单链或双链形式存在，但也已知形成包括三个或更多个链的结构。术语“核酸”包含天然存在的核酸聚合物以及包括已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，所述核酸具有与参考核酸类似的结合性质并且以类似于参考核苷酸的方式进行代谢。示例性类似物包含但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、以及肽-核酸(PNA)。“DNA”、“RNA”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文可互换使用。

术语“工程化的”或“可编程的”包括已经过修饰以变得非天然存在并且可以被配置成装载和/或递送靶分子的促融合分泌性囊泡。

如本文所使用的，术语“基因”或“多核苷酸”是指任何长度的单核苷酸或核酸残基聚合物。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物并且可以是双链或单链的。多核苷酸可以包括经修饰的核酸(例如，甲基化的)、核酸类似物或非天然存在的核酸并且可以被非核酸残基中断。例如，多核苷酸包含基因、基因片段、cDNA、分离的DNA、mRNA、tRNA、rRNA、任何序列的分离的RNA、重组多核苷酸、引物、探针、质粒和载体。定义中包含已经过修饰的核酸聚合物，无论是天然修饰还是通过干预修饰。

在另一个实施例中，本发明提供了与本文所述的靶多核苷酸分子具有实质序列相似性的多核苷酸。当两个多核苷酸的氨基酸序列之间存在至少约70％序列同一性、至少约80％序列统一性、至少约90％序列统一性、至少约95％序列统一性或至少约99％序列统一性时，或者当多核苷酸能够在严格的杂交条件下与彼此形成稳定的双链体时，所述两个多核苷酸具有“实质序列同一性”。这种条件是本领域众所周知的。如上文关于多肽所述，本发明包含多核苷酸，所述多核苷酸是等位基因变体、SNP的结果或作为遗传密码简并性所固有的天然材料中存在的那些的替代密码子。

如本文所使用的，短语“表达”、“基因表达”或“蛋白质表达”如的水平包含与样品、细胞、患者中存在的、样品中分泌的并且从细胞中分泌的基因转录物或蛋白质的量有关的任何信息以及关于产生或累积或降解基因或蛋白质的速率的信息(例如，报告基因数据、来自核径流实验的数据、脉冲追踪数据等)。某些种类的数据可能被认为与基因和蛋白质表达两者有关。例如，细胞中的蛋白质水平反映了蛋白质水平以及转录水平，并且这种数据旨在由短语“基因或蛋白质表达信息”包含。这种信息的形式可以以每个细胞的数量的形式、相对于对照基因或蛋白质的数量的形式、以无单位度量等给出。术语“表达水平”指的是反映在基因或蛋白质表达数据中或可从其中得到的数量，无论数据是针对基因转录物累积还是蛋白质累积还是蛋白质合成率等。

如本文所使用的，当工程化的促融合分泌性囊泡如g型核外颗粒体已经与其所天然缔合的至少一种组分分离时，所述工程化的促融合分泌性囊泡被称为“分离的”。

可以例如通过本文的RNAi介导的过程而被靶向以用于表达抑制的靶分子基因所编码的多肽可以反映单个多肽或复合物或多肽。因此，在另一个实施例中，本发明提供了多肽，所述多肽是本文所述的蛋白质靶分子的片段、前体、后继体或经修饰版本。在另一个实施例中，本发明包含蛋白质靶分子，所述蛋白质靶分子包括前述片段、前体、后继体或经修饰多肽。如本文所使用的，多肽的“片段”是指单个氨基酸或指包括具有多肽的序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基或至少30个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多个氨基酸残基。如本文所使用的，多核苷酸或寡核苷酸的“片段”是指单个核酸或指包括具有多核苷酸的序列的至少15个连续核酸残基、至少30个连续核酸残基、至少60个连续核酸序列或至少90％的核酸序列的核酸残基的聚合物。在一些实施例中，片段是抗原性片段，并且片段的大小将取决于如抗体所识别的表位是线性表位还是构象表位等因素。因此，一些抗原性片段将由较长的区段组成，而其它抗原性片段将由较短的区段组成(例如5、6、7、8、9、10、11或12或更多个氨基酸长，包含至多为多肽的全长的每个整数)。本领域技术人员精通用于选择蛋白质的抗原性片段的方法。

当提及未经治疗受试者相对于经治疗受试者的任何症状的表达时，术语“减少”、“抑制”、“减弱”、“压制”、“降低”、“防止”和语法等效物(包含“较低”、“较小”等)意指经治疗受试者的症状的数量和/或程度比未经治疗受试者低被任何经过医学训练人员识别为与临床相关的任何量。在一个实施例中，经治疗受试者的症状的数量和/或程度比未经治疗受试者的症状的数量和/或程度低至少10％、低至少25％、低至少50％、低至少75％和/或低至少90％。

如本文所使用的，术语“引入”、“施用(administered)”或“施用(administering)”是指向患者提供工程化的促融合分泌性囊泡的组合物使得组合物对患者具有其预期作用的任何方法。在一个实施例中，可以在体内将工程化的促融合分泌性囊泡引入到患者，而在其它替代性实施例中，可以在体外将工程化的促融合分泌性囊泡引入到然后可以在体内向患者施用的受试者细胞。

如本文所使用的术语“患者”是人或动物并且不需要住院。例如，门诊病人、疗养院中的人就是“患者”。患者可以包括任何年龄的人或非人动物并且因此包含成年人和未成年人(即，儿童)两者。术语“患者”并不旨在意味着需要医学治疗，因此，无论是临床还是支持基础科学研究，患者都可以自愿或非自愿地成为实验的一部分。

如本文所使用的，术语“细胞”可以包含体内系统如受试者或患者或体外系统如细胞系或基于细胞的测定中的一种或多种细胞。

术语“偶联”可以包含直接连接和间接连接。在一个优选的实施例中，偶联可以表示如融合或嵌合蛋白或分子中的融合。

如本文所使用的，术语“受试者”是指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地灵长类动物，仍更优选地人。哺乳动物包含但不限于人、灵长类动物、野生动物、未驯服动物、农场动物、运动动物和宠物。

如本文所使用的，术语“蛋白质”是指由肽键连接的氨基酸残基组成、含有元素碳、氢、氮、氧，通常为硫的多种天然存在的极其复杂的物质中的任何一种(作为酶或抗体)。蛋白质通常包括具有数百个内的数量级的氨基酸。如本文所使用的，术语“肽”是指通过一个酸的氨基与另一个酸的羧基组合而衍生自两个或更多个氨基酸并且通常是通过蛋白质的部分水解获得的各种酰胺中的任何酰胺。肽通常包括具有数十个数量级的氨基酸。如上文所指出的，术语蛋白质和肽还包含蛋白质片段、表位、催化位点、信号传导位点、定位位点等。

如本文所使用的，术语“抗体”是指能够结合抗原上存在的表位的免疫球蛋白分子。术语旨在不仅涵盖完整的免疫球蛋白分子如单克隆抗体和多克隆抗体，而且还涵盖双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗特发性(抗ID)抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、融合蛋白和包括所需特异性的抗原识别位点的前述内容的任何修饰。

本发明的另外一个方面涉及用于抑制、改变、破坏表达和/或置换一个或多个靶基因的DNA编辑组合物和方法的用途。在各个实施例中，一个或多个靶基因可以通过可以通过工程化的促融合分泌性囊泡装载并递送到受体细胞的CRISPR/Cas-9、TALAN或锌(Zn2+)指核酸酶系统进行改变。

在一些实施例中，用于改变基因表达的药剂是CRISPR-Cas9或其功能等效物以及被布置成用于靶向一个或多个靶基因的适当的RNA分子。例如，本发明的一个实施例可以包含引入一种或多种指导RNA(gRNA)以由CRISPR/Cas9系统用于破坏、置换或改变受体细胞中的一个或多个靶基因的表达或活性。在此上下文中，基因编辑CRISPR/cas-9技术是利用细菌衍生的蛋白质(Cas9)和合成的指导RNA在基因组内的具体位置处引入双链断裂的RNA指导的基因编辑平台。通过用Cas9蛋白连同专门设计的指导RNA(gRNA)转染细胞或受试者来实现编辑，所述专门设计的gRNA通过与其匹配的基因组序列杂交来引导切割。通过利用此技术，可以在一个或多个靶基因中引入特异性基因改变。在一些实施例中，可以利用此CRISPR/cas-9用经修饰的版本置换一个或多个现有野生型基因，而另外的实施例可以包含添加改变、减少、增加或敲除受体细胞中的靶基因的表达的基因元件。

在一些实施例中，用于改变基因表达的药剂是锌指或锌指核酸酶或其它等效物。如本文所使用的，术语“锌指核酸酶”或“锌指”是指包括与包括锌指阵列的结合结构域缀合的核酸切割结构域的核酸酶。在一些实施例中，切割结构域是II型限制性核酸内切酶FokI的切割结构域。锌指核酸酶可以被设计成靶向给定核酸分子中的几乎任何期望的序列以进行切割，并且将锌指结合结构域设计成结合复杂基因组的情况下的独特位点的可能性允许在活细胞中靶向切割单个基因组位点，例如以实现治疗性价值的靶向的基因组改变。由于非同源DNA修复途径的易错性质，可以使用将双链断裂靶向期望的基因组基因座来将移码突变引入到基因的编码序列中。可以通过本领域技术人员众所周知的方法生成锌指核酸酶以靶向所关注位点。例如，可以通过组合已知特异性的单独的锌指基序来设计具有期望的特异性的锌指结合结构域。与DNA结合的锌指蛋白Zif268的结构已告知了此领域的许多工作，并且已经描述了针对64种可能的碱基对三联体中的每个碱基对三联体获得锌指并且然后将这些模块化锌指混合并匹配以设计具有任何期望的序列特异性的蛋白质的概念(Pavletich NP、Pabo Colo.(1991年5月).“锌指DNA识别：2.1A处Zif268-DNA复合物的晶体结构(Zinc finger-DNA recognition:crystal structure of a Zif268-DNA complex at2.1 A)”《科学(Science)》252(5007):809-17，所述文献的全部内容并入本文)。在一些实施例中，将各自识别3碱基对DNA序列的单独的锌指组合以生成识别长度在9个碱基对到18个碱基对的范围内的靶位点的3指、4指、5指或6指阵列。在一些实施例中，设想更长的阵列。在其它实施例中，将识别6-8个核苷酸的2指模块组合以生成4锌指、6锌指或8锌指阵列。在一些实施例中，采用细菌或噬菌体展示来发展锌指结构域，所述锌指结构域识别期望的核酸序列，例如，长度为3-30bp的期望的核酸酶靶位点。

在一些实施例中，锌指核酸酶包括通过接头例如多肽接头彼此融合或以其它方式缀合的锌指结合结构域和切割结构域。接头的长度确定了与由锌指结构域结合的核酸序列的切割距离。如果使用较短的接头，则切割结构域将更靠近结合的核酸序列来切割核酸，而较长的接头将导致切割与结合的核酸序列之间的距离更大。在一些实施例中，锌指核酸酶的切割结构域必须二聚化以切割结合的核酸。在这样的一些实施例中，二聚体是两个单体的异二聚体，所述两个单体中的每个单体包括不同的锌指结合结构域。例如，在一些实施例中，二聚体可以包括包含与FokI切割结构域缀合的锌指结构域A的一个单体以及包含与FokI切割结构域的锌指结构域B缀合的一个单体。在此非限制性实例中，锌指结构域A结合靶位点的一侧上的核酸序列，锌指结构域B结合靶位点的另一侧上的核酸序列，并且二聚化FokI结构域切割锌指结构域结合位点之间的核酸。

在一些实施例中，用于改变靶基因的药剂是TALEN系统或其等效物。如本文所使用的，术语TALEN或“转录激活因子样元件核酸酶”或“TALE核酸酶”是指包括与DNA切割结构域例如FokI结构域的转录激活因子样效应物DNA结合结构域的人工核酸酶。已经报道了用于生成工程化的TALE构建体的多种模块化组装方案。(Zhang,Feng等人(2011年2月))。本领域技术人员将理解，可以将TALE核酸酶工程化以便以高特异性靶向几乎任何基因组序列，并且这种工程化的核酸酶可以在本发明技术的实施例中用于例如通过在适合TALEN结合并切割其在细胞的基因组内的靶序列的情况下通过本文公开的方法或策略递送相应的TALEN来操纵细胞的基因组。在一些实施例中，递送的TALEN靶向与疾病或病症或生物过程相关的基因或等位基因或者一个或多个靶基因。在一些实施例中，将TALEN递送至受试者赋予了受试者治疗性益处，如减少、改善或消除患者的疾病病状。

在一些实施例中，通过借助于本文公开的策略或方法递送至细胞的核酸酶例如CRISPR/cas-9、TALEN或锌指核酸酶或多个这种核酸酶或这种核酸酶的组合来改变细胞、组织、器官或生物体的靶基因。在一些实施例中，通过核酸酶将单链或双链断裂引入基因组内的具体位点处，从而导致靶基因组序列的破坏。

在一些实施例中，靶基因组序列是靶基因的编码区域内的核酸序列。在一些实施例中，通过核酸酶引入的链断裂导致靶基因内的突变，所述突变削弱了经编码的基因产物的表达。在一些实施例中，核酸与核酸酶共同递送至细胞。在一些实施例中，核酸包括与和核酸酶靶位点相邻的序列相同或同源的序列。在这样的一些实施例中，受核酸酶影响的链断裂被细胞DNA修复机制修复，以在断裂位点将全部或部分共同递送的核酸引入到细胞DNA中，从而导致共同递送的核酸或其一部分的靶向插入。在一些实施例中，插入导致不期望的等位基因的破坏或修复。在一些实施例中，核酸通过与超荷电蛋白缔合而共同递送。在一些实施例中，超荷电蛋白还与功能性效应蛋白例如核酸酶缔合。在一些实施例中，将核酸酶递送至靶细胞导致基因的功能的临床或治疗上有益的改变。

在提供值范围的情况下，应当理解，介于所述范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确规定，否则到下限的单位的十分之一)以及所陈述范围中的任何其它所陈述的值或中间值均涵盖在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地包含在更小范围中并且也涵盖在本发明内，服从所陈述范围中的任何具体排除的极限。在所陈述范围包含极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些被包含在内的极限中的任一个或两个极限的范围也包含在本发明中。本文提供了在数值前面有术语“约”的某些范围。术语“约”在本文用于为其后面出现的精确数字以及接近或靠近所述术语后面的数字的数提供文字性支持。在确定数字是否接近或靠近具体叙述的数字时，接近或靠近的未叙述的数字可以为在其出现的上下文中提供具体叙述的数字的基本等同形式的数字。

如本文所使用的，术语被配置成介导RNA干扰的“RNAi分子”，“干扰RNA分子”或“干扰RNA”或RNA分子通常是指能够抑制或“沉默”靶基因的表达的RNA。在某些实施例中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mRNA分子的完全加工(例如，完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂包含非编码RNA分子例如包括成对链的RNA双链体以及可以从其生成这种小的非编码RNA的前体RNA。示例性RNA沉默剂包含dsRNA，如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施例中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施例中，RNA沉默剂能够介导翻译抑制。如本文所使用的，RNA分子或甚至RNAi分子可以进一步涵盖lincRNA分子以及IncRNA分子。

在本发明的一些实施例中，核酸剂是双链RNA(dsRNA)。如本文所使用的，术语“dsRNA”涉及通过碱基配对结合在一起的反平行多核糖核酸的两条链。两条链可以具有相同的长度或不同的长度，条件是两条链之间存在足够的序列同源性，使得形成在整个长度上具有至少60％、70％、80％、90％、95％或100％互补性的双链结构。根据本发明的实施例，dsRNA分子不存在突出端。根据本发明的另一个实施例，dsRNA分子包括突出端。根据其它实施例，使链对齐，使得未对齐的链的末端存在至少1个、2个或3个碱基(即，在相反链中不存在互补碱基)，从而使得当链退火时，在双链体的一端或两端处出现1个、2个或3个残基的突出端。应当注意的是，可以根据对靶基因转录物进行编码的DNA的核酸序列来定义dsRNA，并且应当理解的是，与基因的编码序列相对应的dsRNA序列包括基因的编码序列的RNA补体或转录为RNA的基因的其它序列。

抑制性RNA序列可以与靶基因转录物的一部分大于90％相同或甚至100％相同。可替代地，RNA的双链体区域可以在功能上定义为能够在严格条件下(例如，400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4，1mM EDTA，60摄氏度，杂交12小时；然后洗涤)与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列。与靶基因转录物互补的双链核苷酸序列的长度可以是至少约18个、19个、21个、25个、50个、100个、200个、300个、400个、491个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、900个、1000个或更多个碱基。在本发明的一些实施例中，双链核苷酸序列的长度为约18到约530个或更长的核苷酸。

本发明教导涉及各种长度的dsRNA，由此中较短的版本(即，x较短或等于50bp(例如，17-50))被称为siRNA或miRNA。51-600的更长dsRNA分子在本文中被称为dsRNA，可以对dsRNA进行进一步加工得到siRNA分子。根据一些实施例，dsRNA的核酸序列的长度大于15个碱基对。根据又其它实施例，dsRNA的核酸序列的长度为19-25个碱基对、长度为30-100个碱基对、长度为100-250个碱基对或长度为100-500个碱基对。根据仍其它实施例，dsRNA的长度为500-800个碱基对、长度为700-800个碱基对、长度为300-600个碱基对、长度为350-500个碱基对或长度为400-450个碱基对。在一些实施例中，dsRNA的长度为400个碱基对。在一些实施例中，dsRNA的长度为750个碱基对。

术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小的抑制性RNA双链体(通常介于17-30个碱基对之间，但也更长，例如，31-50bp)。通常化学合成siRNA作为21聚体(21mer)，所述21聚体具有19bp的中心双链体区域和在末端的对称的2碱基3'突出端，但是最近已描述了与相同位置处的21聚体相比，25-30碱基长度的化学合成的RNA双链体可以在效力上有多达100倍的提高。理论上认为使用更长的RNA触发RNAi所获得的增强的效力是由于为Dicer提供了底物(27聚体)而不是产物(21聚体)所产生的，并且这提高了siRNA双链体进入RISC中的速度或效率。已发现3'突出端的定位影响siRNA的效力，并且在反义链上具有3'突出端的不对称双链体通常比在有义链上具有3'突出端的不对称双链体更有效力(Rose等人,2005)。这可以归因于到RISC中的不对称链装载，因为靶向反义转录物时观察到了相反的功效模式。

在某些实施例中，dsRNA可以来自2个来源；一种源自由DNA的相反链上的相反基因启动子生成的基因转录物，并且2)来自由单个基因启动子产生但具有内部互补性的向后折叠发夹结构。例如，可以连接双链干扰RNA(例如，siRNA)的链以形成发夹或茎环结构(例如，shRNA)。因此，如所提及的，RNA沉默剂也可以是短发夹RNA(shRNA)。如本文所使用的，术语“shRNA”是指具有茎环结构的RNA剂，所述茎环结构包括互补序列的第一区域和第二区域，区域的互补性和取向程度足以使得区域之间发生碱基配对，第一区域和第二区域通过环区域连接，所述环是由于环区域内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而产生的。环中的核苷酸数量是介于3到23或5到15或7到13或4到9或9到11之间并且包含其的数字。环中的核苷酸中的一些核苷酸可以参与到与环中的其它核苷酸的碱基对相互作用中。可以用于形成环的寡核苷酸序列的实例包含5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp,T.R.等人(2002)《科学》296:550)和5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto,D.等人(2002)《RNA》8:1454)。本领域技术人员将认识到，所得的单链寡核苷酸形成茎环或发夹结构，所述茎环或发夹结构包括能够与RNAi机制相互作用的双链区域。

如本文所使用的，短语“微RNA(在本文中也可互换地称为“miRNA”)或其前体”是指充当转录后调节剂的微RNA(miRNA)分子。miRNA分子通常是长度为约20到22个核苷酸的RNA分子，所述RNA分子可以装载到RISC复合物中并且引导另一个RNA分子的切割，其中另一个RNA分子包括与miRNA分子的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列。miRNA分子通常从“pre-miRNA”或如本文所使用的pre-miRNA分子的前体通过蛋白质如DCL蛋白进行加工并且装载到RISC复合物上，在所述RISC复合物中，所述miRNA分子可以指导靶RNA分子的切割。pre-微RNA分子通常是从pri-微RNA分子(初级转录物)加工的。侧接pre-微RNA的单链RNA区段对于将pri-miRNA加工成pre-miRNA具有重要性。切割位点似乎由距茎-ssRNA连接点的距离确定(Han等人2006,《细胞(Cell)》125,887-901,887-901)。

如本文所使用的，“pre-miRNA”分子是约100到约200个核苷酸，优选地约100到约130个核苷酸的RNA分子，所述RNA分子可以采用包括不完美的双链RNA茎和单链RNA环(也被称为“发夹”)并且进一步包括双链RNA茎中的miRNA(和其补体序列)的核苷酸序列的二级结构。根据具体实施例，miRNA和其补体位于距miRNA双链RNA茎的自由端约10到约20个核苷酸处。单链环区的长度和序列不是关键性的并且可以有相当大的变化，例如长度介于30与50个核苷酸之间。miRNA与其补体之间的互补性不需要是完美的，并且可以容忍约1到3个未配对核苷酸凸起。RNA分子所采用的二级结构可以通过本领域常规的计算机算法如mFOLD来预测。来自通过DCL活性释放并且装载到RISC复合物上的pre-miRNA的双链RNA的特定链通过5'端处的互补性程度来确定，由此在其5'端处在切割的dsRNA茎的不同链的核苷酸之间的氢键合中涉及最少的链被装载到RISC复合物上并且将确定靶RNA分子降解的序列特异性。然而，如果凭经验，来自特定的合成pre-miRNA分子的miRNA分子不起作用(因为“错误的”链装载在RISC复合物上)，则将立即显而易见的是，可以通过交换miRNA分子和其补体在pre-miRNA分子的dsRNA茎的相应链上的定位来解决此问题。如本领域中已知的，涉及两个氢键的A与U之间或涉及两个氢键的G与U之间的结合不如涉及三个氢键的G与C之间的结合那么强。

天然存在的miRNA分子可以包括在其天然存在的pre-miRNA分子中，但是所述天然存在的miRNA分子也可以通过将通常从这种现有的pre-miRNA分子加工的miRNA分子的核苷酸序列交换为另一种所关注miRNA的核苷酸序列而引入到现有的pre-miRNA分子支架中。pre-miRNA的支架也可以是完全合成的。同样，合成的miRNA分子可以包括在现有的pre-miRNA分子支架或合成的pre-miRNA支架中并且从其进行加工。一些pre-miRNA支架可以因其正确地加工成设计的微RNA的效率而比其它支架更优选，尤其是当表达为嵌合基因时，其中除pre-微RNA外，如未翻译的前导序列或转录终止和聚腺苷酸化区域等其它DNA区域也被掺入初级转录物中。

根据本发明教导，dsRNA分子可以是天然存在的或合成的。dsRNA可以是长dsRNA分子和短dsRNA分子的混合物，如dsRNA、siRNA、siRNA+dsRNA、siRNA+miRNA或其组合。

在优选的实施例中，一种或多种核酸剂被设计成用于特异性地靶向所关注靶基因。应当理解的是，核酸剂可以用于下调一个或多个靶基因(例如，如上文详细描述的)。如果靶向多个靶基因，则使用包括用于靶向多个靶基因的多种核酸剂的异源组合物。可替代地，将所述多种核酸剂单独地调配。根据具体实施例，使用用于单个靶标的多个不同的核酸剂分子，所述多个不同的核酸剂分子可以单独使用或同时(即，共同调配)应用。

例如，为了使所关注mRNA的表达沉默，可以如下选择适合用于与本发明的一些实施例一起使用的dsRNA的合成。首先，扫描包含3'UTR和5'UTR的mRNA序列。其次，使用任何序列比对软件如可从NCBI服务器(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)获得的BLAST软件将mRNA序列与适当的基因组数据库进行比较。滤出与其它编码序列表现出显著同源性的mRNA序列中的推定区域。选择合格的靶序列作为用于dsRNA合成的模板。优选的序列是与基因组中的其它基因具有很少同源性以减少“脱靶”效应的序列。将理解的是，本发明的一些实施例的RNA沉默剂不需要局限于仅含有RNA的那些分子，而是进一步涵盖经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

术语“包括(comprises、comprising)”旨在具有美国专利法中赋予其的广义含义并且可以意指“包含(includes、including)”等。

现在通过参考以下实例将更容易理解总体上描述的本发明，所述实例仅出于说明本发明的实施例的某些方面的目的而包含在内。如本领域技术人员从上文教导和以下实例中将认识到的，其它技术和方法可以满足权利要求并且可以在不脱离要求保护的发明的范围的情况下采用，实例不旨在限制本发明。

实例

包膜病毒通常利用其病毒编码的融合蛋白来促进感染期间与宿主细胞的膜融合。VSV-G是研究最深入的病毒融合蛋白之一并且经常用于使逆转录病毒或慢病毒颗粒假型化以使其能够进入更广范围的细胞类型中。先前的研究报道了，VSV-G可以通过可沉淀的EV来介导从包装细胞到靶细胞的蛋白质转移。但是，尚不清楚什么类型的EV、产生所述EV的效率如何、可以转移哪些类型的蛋白质(细胞核或细胞质)以及这些囊泡是否甚至含有VSV-G和转移的细胞蛋白两者。为了解决这些问题，发明人将绿色荧光蛋白的变体超级折叠物GFP(sfGFP)与VSV-G的羧基端融合并且通过瞬时转染在HEK293T细胞中表达融合蛋白VSV-G-sfGFP(图1A)。流式细胞术表明约86％的细胞对GFP呈阳性(图1B)，并且共聚焦成像表明GFP信号集中在细胞膜处，这与VSV-G的大部分细胞表面表达一致(图10A)。还收集了来自对照和VSV-G-sfGFP转染的细胞的上清液，并且用NanoSight对其进行纳米颗粒跟踪分析(图1C)。来自模拟转染的细胞的上清液在荧光通道中含有平均大小为115nm的每毫升估计3.9×10

为了使能够将特定蛋白募集到g型核外颗粒体中并且减少随机细胞蛋白的非特异性装载，发明人使用GFP分裂系统作为建造块来构建双组分g型核外颗粒体(图1A，右图)。值得注意的是，如本领域中通常理解的，GFP可以在第十条β链与第十一条β链之间分裂，从而产生16氨基酸(aa)片段(GFP11)和其余蛋白质(GFP1-10)的单独构建体。在没有16aa肽的情况下，GFP1-10是非荧光的。在两个片段在细胞中共表达后，GFP11结合GFP1-10以重构功能性荧光GFP分子(图1A，右图)。为了确定分裂GFP系统是否可以用于桥接VSV-G和其在细胞中的结合配偶体，发明人将VSV-G与GFP11在其羧基端处(VSV-G-GFP11)并且将β-内酰胺酶-vpr报告基因(BlaM)与GFP1-10在其N端处(GFP1-10-BlaM)融合(图1A)。选择BlaM报告基因是因为其在细胞中的酶活性可以使用合成底物CCF2-AM通过流式细胞术容易地测量，所述CCF2-AM是由头孢菌素所桥接的7-羟基香豆素-3-羧酰胺和荧光素构成的细胞可渗透性荧光染料。通过β-内酰胺酶切割CCF2-AM后，两个荧光团分离，从而导致用底物装载的细胞中有荧光共振能量转移损失(图10B)。通过流式细胞术(图1B)和共聚焦显微镜(图10A)分析用VSV-G-GFP11、BlaM-vpr-GFP1-10或两者转染的HEK293T细胞。包含在此实验中在膜融合中有缺陷的VSV-G突变体(P127D)作为对照。尽管野生型、突变VSV-G-GFP11或BlaM-vpr-GFP1-10在单独表达时表现出与模拟转染相当的背景荧光，但如通过流式细胞术分析的，成对的转染在66％到89％的细胞中产生了强GFP信号，这与VSV-G-sfGFP相当(图1B)。GFP信号主要定位于细胞膜上并且从细胞核中排除(图10A)。包封这些蛋白质并且从细胞中释放的g型核外颗粒体通过用识别VSV-G和包封的蛋白质的抗体进行的蛋白质印迹分析进行验证(图10B)。这些结果表明VSV-G适于与分裂GFP系统进行蛋白质栓系。

接下来，从转染的细胞中收集培养基，并且通过NanoSight测量荧光和非荧光囊泡。如在图1C中观察到的，模拟转染的HEK293T细胞培养基含有平均大小为约115nm的非荧光囊泡。用双组分分裂GFP产生的荧光EV的平均粒径为约207nm(图1C)。VSV-G突变体(P127D)还形成相当数量的荧光EV，这表明EV的产生与膜融合功能无关。流式细胞术分析表明，VSV-G-GFP11/BlaM-vpr-GFP1-10转染的细胞的上清液中存在双组分g型核外颗粒体(图1D)。使用BDAria细胞分选仪，分离出GFP阳性g型核外颗粒体。用对照抗体或抗VSV-G抗体进行免疫染色之后，通过电子显微镜可视化FACS纯化的颗粒。VSV-G存在于球形囊泡的表面上(图1E)。因此，VSV-G存在于荧光g型核外颗粒体的表面上。

为了确定从转染的HEK293T细胞中收集的g型核外颗粒体是否可以将货物转移到靶细胞的细胞质中，发明人首先测试了g型核外颗粒体与海拉细胞的温育(图1F)。BlaM-vpr-GFP1-10转移的效率通过流式细胞术进行测量(图1G)。在此测定中，由于受体细胞中存在的颗粒数量有限并且货物释放到细胞质中导致GFP再次分裂，因此几乎无法检测到g型核外颗粒体的GFP荧光(图1F)。另外，CCF2-AM底物FITC(488nm)的荧光强度高至少一个数量级。如图1H所示，在装载CCF2-AM底物后，暴露于VSV-G-GFP11和BlaM-vpr-GFP1-10g型核外颗粒体的细胞为GFP阳性，而没有g型核外颗粒体暴露的对照细胞大多为FITC通道阳性。相比之下，具有GFP11的突变VSV-G无法介导BlaM-vpr-GFP1-10的转移，这与货物转移需要促融合VSV-G的观点一致(图1G-H)。用胰蛋白酶处理g型核外颗粒体仅仅10分钟足以阻断受体细胞中的BlaM活性的出现(图10C)，这表明g型核外颗粒体介导的蛋白质转移需要膜表面上的蛋白质的完整性。

为了证明在各种细胞蛋白的递送中g型核外颗粒体的一般性，发明人接下来测试了Cre重组酶是否可以高效地掺入到g型核外颗粒体中以递送生物活性Cre来修饰受体细胞(图2A)。将Cre-vpr-GFP1-10瞬时转染到具有或不具有VSV-G-GFP11的HEK293T细胞中(图2B)。对从转染的细胞中收集的培养基进行的NanoSight分析揭示了，基于FITC通道中的NanoSight痕迹，荧光Cre g型核外颗粒体比BlaM g型核外颗粒体相对更均质(图2C)。为了测试通过g型核外颗粒体递送Cre的功能，发明人从HEK293T细胞中收集了已用拴系的VSV-G-GFP11/Cre-vpr-GFP1-10、未拴系的VSV-G/Cre-vpr-GFP1-10或模拟转染对照转染的培养基。将类似数量的g型核外颗粒体与293ColorSwitch细胞温育，所述293ColorSwitch细胞稳定地表达颜色切换报告基因。Cre g型核外颗粒体摄取后，由于切除了阻止GFP表达的flox化RFP-STOP盒，因此细胞从强RFP切换到GFP信号(图2A)。超过80％的293ColorSwitch细胞已利用VSV-G-GFP11/Cre-GFP1-10切换到GFP，而模拟转染或未拴系的VSV-G/Cre-GFP1-10并未导致可检测到的变化(图2D-E)。通过共聚焦显微镜也独立地确认了作为重组的结果的颜色切换(图2F)。这些结果表明，生物活性Cre重组酶可以通过g型核外颗粒体高效地递送以介导靶细胞中的Cre-lox重组，并且通过分裂GFP将Cre与VSV-G桥接大大提高了Cre递送至受体细胞的细胞核的效率。

由于BlaM和Cre两者都是具有相对较小大小的蛋白质，因此发明人进一步探讨了较大的蛋白质是否可以高效地掺入到g型核外颗粒体中。将AGO2、SaCas9和LwaCas13与GFP1-10融合并且与VSV-G-GFP11共表达。流式细胞术和共聚焦显微镜分析证实，这些蛋白质与由分裂GFP介导的VSV-G-GFP11形成复合物(图11A，LwaCas13未示出)。包封这些蛋白质的g型核外颗粒体从细胞释放，如通过用识别VSV-G和包封的蛋白质的抗体进行的蛋白质分析验证的(图2G)。在没有VSV-G-GFP11的共表达的情况下，在上清液中没有检测到任何细胞内蛋白，这表明将这些蛋白包封到g型核外颗粒体中需要与这些蛋白进行VSV-G相互作用。

将BlaM g型核外颗粒体与若干种人癌细胞系和永生化鼠类胚胎成纤维细胞(MEF)温育。据发现，在大多数测试的细胞系中，除了HCC4006和HaCaT角质形成细胞外，摄取g型核外颗粒体非常高效(图2H)。从小鼠分离的原代细胞示出了对g型核外颗粒体介导的货物转移类似的易感性(图2I)。因此，g型核外颗粒体可以将其货物递送到许多培养的细胞和原代细胞。总的来说，这些结果证明，g型核外颗粒体可以容纳各种货物蛋白并且用作多功能递送媒剂。

利用g型核外颗粒体，可能可以以剂量控制的方式实现瞬时或稳定的细胞修饰。为了评估g型核外颗粒体递送的剂量依赖性，将增加数量的荧光BlaM g型核外颗粒体颗粒添加到固定数量的海拉细胞中持续12小时，并且通过流式细胞术测量BlaM阳性细胞的级分。BlaM向海拉细胞的转移严格取决于剂量，其中每个细胞的EC

为了研究g型核外颗粒体介导的蛋白质转移的动力学，发明人测量了在暴露于由转染的HEK293T细胞制备的亚最大剂量的BlaM g型核外颗粒体之后16小时的时间内海拉细胞中的BlaM活性。BlaM活性迅速上升并且在海拉细胞中在暴露于g型核外颗粒体后8小时内达到稳态水平(图3B)。为了测量递送的BlaM的稳定性，在16小时时针对用g型核外颗粒体装载的海拉细胞执行培养基更换。在这种情况下，确定保留BlaM信号的细胞的级分高达72小时。BlaM信号在24小时之后迅速下降并且在48与72小时之间返回到基线(图3C)。BlaM阳性细胞的减少很可能是由于细胞内转移的BlaM酶的降解。当通过g型核外颗粒体转移时，此蛋白质的动力学曲线与瞬时递送许多生物活性分子之后的曲线一致。

除蛋白质外，还已知EV包封核酸，所述核酸包含miRNA、mRNA并且甚至包含质粒DNA。尽管BlaM的快速上升和下降与此假设不一致，但由g型核外颗粒体转移的BlaM或Cre功能可能由于对这些蛋白质进行编码的核酸的转移而不是直接的蛋白质转移而发生。为了进一步排除从头合成蛋白质，发明人使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺执行了一组实验。直接用BlaM表达质粒瞬时转染或暴露于g型核外颗粒体转移的BlaM的海拉细胞在进行流式细胞术分析之前用环己酰亚胺(10μg/mL)或媒剂对照处理16小时。如所预期的，当蛋白质合成被环己酰亚胺抑制时，已用对BlaM进行编码的表达质粒瞬时转染的海拉细胞表现出较少的BlaM活性。相比之下，在已经使用g型核外颗粒体将BlaM蛋白直接转移到的海拉细胞中，在环己酰亚胺处理后，更多的细胞针对BlaM表达呈阳性，这表明g型核外颗粒体处理之后的BlaM活性来自直接蛋白质转移，而不是来自经转移的核酸的新蛋白质合成(图3D)。

为了进一步排除通过g型核外颗粒体而非蛋白质转导进行核酸转移的可能性，发明人利用了最近开发的LwaCas13介导的RNA沉默，所述沉默赋予宿主细胞对入侵核酸的先天免疫力。发明人在293ColorSwitch细胞中将LwaCas13连同或不连同靶向Cre的2个串联sgRNA表达(图3E)。以此方式，生成了在存在sgRNA的情况下被编程成抑制Cre mRNA的细胞。接下来，发明人将LwaCas13编程的或未编程的细胞与Cre g型核外颗粒体一起温育或将Cre表达载体直接转染到这些细胞中。如所预期的，LwaCas13/Cre sgRNA抑制了用Cre表达质粒转染的HEK293T细胞中的Cre蛋白表达(图3F，泳道3与泳道6)，这表明LwaCas13介导的Cre敲低是有效的。LwaCas13/CresgRNA显著降低了转染的细胞中RFP向GFP的切换，如将预期的具有较低的Cre表达(图3G，最后两列)。相比之下，g型核外颗粒体介导的Cre转移未受到LwaCas13/CresgRNA的显著影响(图3G，中间两列)。综上所述，这些结果表明，由于DNA或mRNA从生产细胞转移到受体细胞，因此g型核外颗粒体介导的Cre转导是不可能的。

研究EV的主要挑战之一是这些囊泡和其货物的巨大异质性。不存在简单的方法来确定每个颗粒的含量，并且也不存在有效的方法来纯化具有定义的分子含量的EV。如NanoSight分析所示，取决于包封的生物活性蛋白，荧光g型核外颗粒体在采集的细胞培养基中占总EV的约10％到50％(图1C和图2C)。尽管g型核外颗粒体的这一显著富集可能以其它EV为代价，但仍需对其进行纯化以减少不期望的污染，这可能会混淆对实验结果的解释。使用被开发用于纯化外泌体的公认方案，发明人试图通过差速超速离心和浮选以密度梯度从其它EV中纯化g型核外颗粒体。对若干种有据可查的EV蛋白进行印迹分析(图12)。在100K级分中观察到外泌体标志物CD9的优先富集；然而，VSV-G和货物蛋白BlaM存在于10K级分和100K级分两者中，其中100K级分中的量更高。因此，超速离心可以富集g型核外颗粒体，但不能有效地将所述g型核外颗粒体与外泌体分离。由于流式细胞术可以通过大小和荧光来区分颗粒，因此发明人比较了100K离心与FACS对VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体富集的有效性(图4A)。定量免疫印迹被用来评估纯化的有效性并且使用已知量的纯化重组VSV-G或BlaM作为标准品确定每个g型核外颗粒体的蛋白质分子数量(图4BC)。利用VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体，100K离心和FACS分别产生24倍和72倍的VSV-G富集(表1)。对于荧光双组分g型核外颗粒体，纯化表(表2)表明100K离心可以实现g型核外颗粒体中BlaM的约33倍富集，而FACS可以实现货物蛋白BlaM的约467倍富集(图4C和表2)。因此，分裂GFP系统使能够分离和纯化期望的g型核外颗粒体。

实例6：用分裂GFP系统主动装载VSV-Gg型核外颗粒体减少了细胞蛋白的非特异

由于g型核外颗粒体具有有限的货物空间，因此在掺入预期的VSV-G相互作用蛋白与非特异性细胞蛋白之间可能会发生竞争。为了测试此假设，发明人从BlaM中去除了GFP1-10并且表明没有GFP1-10的BlaM可以非特异性地掺入到VSV-G-GFP11g型核外颗粒体中并且使用从HEK293T细胞中浓缩的g型核外颗粒体以低但可检测的量转移到受体海拉细胞(图5A)。在这些条件下，BlaM用作被动和非特异性地将细胞蛋白掺入到g型核外颗粒体中而不与VSV-G互补的代替物。应当注意，来自对HEK293T细胞的仅BlaM转染的上清液不会产生到海拉细胞的任何BlaM转移；这表明没有VSV-G的EV不能介导BlaM转移。利用固定量的VSV-G-GFP11、BlaM和输入DNA的总量，通过流分析(图5B)，在共转染实验中增加Cre-GFP1-10的量会导致BlaM转导降低，这是通过对释放的g型核外颗粒体的免疫印迹分析(图5C)得到独立地验证的结果。此结果表明，主动装载g型核外颗粒体改善了其货物和蛋白质转导的特异性。

通过超速离心富集了g型核外颗粒体和外泌体的事实提出了所述g型核外颗粒体和外泌体在来源和功能上是否是独立的实体的问题。为了区分这两种类型的囊泡，发明人首先将GFP11标签添加到因其在外泌体表面上的存在而闻名的两种蛋白质标志物CD9和CD81的羧基端。接下来，发明人在HEK293T细胞中共表达CD9-GFP11、CD81-GFP11或VSV-G-GFP11连同Cre-vpr-GFP1-10(图6A)。对于所有三对，都成功并稳健地重构了GFP信号(图6B)。对来自转染的细胞的培养基的NanoSight分析证实，荧光EV以相当的水平产生(图6C)。将从对照和成对转染中收集的g型核外颗粒体与293ColorSwitch细胞温育，并且通过流式细胞术分析来评估重组活性。尽管VSV-G g型核外颗粒体触发了与Cre转移一致的稳健颜色切换(约80％)，但与VSV-G的颜色相比，来自CD9和CD81的EV均未产生显著变化(图6D)。此实验表明，含有CD9或CD81的囊泡(很可能是外泌体)在促进蛋白质转导方面与VSV-G g型核外颗粒体在功能上有所不同。

先前的研究表明，急性Ca

为了解决g型核外颗粒体是否可以包装和递送RNA干扰功能以抑制所关注基因在受体细胞中的表达，发明人将RNA诱导沉默复合物(RISC)的结合并解开小干扰RNA双链体的组分AGO2与GFP1-10融合。将所得载体AGO2-GFP1-10与VSV-G-GFP11连同对人PINK1siRNA进行编码的构建体共转染到HEK293T细胞中。在此实验中，使用另一种RNA结合蛋白ELAV/HuR作为阴性对照。发明人先前表明，响应于CCCP处理将帕金蛋白募集至线粒体需要PINK1。如所预期的，维纳斯-帕金在未刺激细胞的细胞质中扩散并且在CCCP处理后重新定位到线粒体(图7A)。用携带通过AGO2装载的PINK1siRNA的g型核外颗粒体处理的细胞使无法在线粒体上进行CCCP诱导的帕金蛋白累积。具有AGO2但不具有ELAV的PINK1siRNA g型核外颗粒体阻断CCCP将帕金蛋白募集到线粒体并且比将PINK1shRNA直接瞬时转染到海拉细胞更高效(图7A和B)。PINK1抑制活性严格取决于VSV-G-GFP11的存在并且经过延伸取决于g型核外颗粒体。利用适当的对照通过实时PCR分析确认了AGO2/shPINK1g型核外颗粒体对PINK1mRNA的敲低(图7C)；PINK1表达的损失也通过用PINK1抗体进行免疫印迹得到验证(图7D)。通过定制RNA微阵列分析独立地确认了AGO2/siPINK1g型核外颗粒体中PINK1siRNA的存在(图13A)。这些结果证明，可以用RNA干扰复合物对g型核外颗粒体进行编程，以使给定的所关注基因失活。

在图3F中，发明人表明，SaCas9-GFP1-10可以被包封到g型核外颗粒体中并且释放到培养基中。为了研究g型核外颗粒体是否可以递送感受态基因编辑复合物以对受体细胞的基因组进行靶向的改变，发明人通过将VSV-G-GFP11和SaCas9-GFP1-10与或不与PINK1sgRNA共转染来收集在HEK293T细胞中制成的g型核外颗粒体。发明人将这些g型核外颗粒体与维纳斯-帕金海拉细胞温育。在没有PINK1sgRNA的情况下，SaCas9g型核外颗粒体对维纳斯-帕金线粒体募集没有影响。暴露于SaCas9/PINK1sgRNA g型核外颗粒体的细胞示出了针对帕金蛋白募集呈阳性的细胞数量减少了40％(图7E和7F)。如通过蛋白质印迹确定的，这伴随着PINK1表达的部分降低(图7G)。由于并非所有基因编辑事件都会导致功能损失的事实，因此对PINK1损失的影响可能不完全。通过定制RNA微阵列分析独立地确认了SaCas9/sgPINK1g型核外颗粒体中PINK1sgRNA的存在(图13B)。除了维纳斯-帕金海拉细胞外，发明人还将SaCas9/PINK1sgRNA g型核外颗粒体与稳定地表达PINK1-EGFP的海拉细胞温育。用SaCas9/sgPINK1g型核外颗粒体处理之后，还观察到GFP信号的部分损失(图14)。为了确认基因编辑确实在内源性PINK1基因座处或在异位表达的PINK1-EGFP转基因处发生，发明人从相应的细胞系中提取了基因组DNA并且用对靶向的区域进行扩增的一对引物执行了PCR分析。对所得PCR产物进行TA克隆。对含有经扩增区域的克隆的DNA测序示出了sgRNA靶向位点附近的可变大小缺失(补充表1)，这是与用于通过SaCas9产生这些突变的双链断裂的非同源末端连接修复一致的模式。这些结果表明，用SaCas9和设计的sgRNA包装的g型核外颗粒体可以在内源性或转基因位点处执行基因编辑。

循环单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞通过吞噬作用去除死细胞、细胞碎片、外泌体和微囊泡。这些吞噬细胞表达信号调节蛋白α(SIRPα)，所述信号调节蛋白α用作在肿瘤细胞和正常细胞等中以高水平存在的跨膜蛋白CD47的受体。CD47与SIRPα的结合触发“别吞噬我(don't eat me)”的信号。先前的研究已经表明，外泌体上CD47的存在限制了其清除，从而导致更高的血液水平。用纳米抗体A4阻断CD47增强了肿瘤细胞的巨噬细胞吞噬作用。为了测试CD47-SIRPα系统是否在巨噬细胞在体外对g型核外颗粒体的清除中起作用，发明人在HEK293T细胞连同标准g型核外颗粒体组分中过表达带Myc和GFP11标签的小鼠CD47(mCD47)或带Myc标签的小鼠CD47纳米抗体(图8A)。利用此设计，g型核外颗粒体将在其表面上具有更高的CD47或抗CD47纳米抗体连同VSV-G表达(图8B)。接下来，发明人将对照、CD47和含有VSV-G/BlaM的抗CD47g型核外颗粒体与小鼠RAW 264.7巨噬细胞温育3或6小时。温育之后回收上清液，并且通过BlaM活性来测量培养基中剩余的g型核外颗粒体的量。3小时和6小时之后，RAW264.7细胞分别耗竭了约25％和70％的对照g型核外颗粒体(图8C)。相比之下，耗竭了仅10％和50％的CD47g型核外颗粒体，但从培养基中去除了70％和80％的抗CD47纳米体g型核外颗粒体。通过测量巨噬细胞暴露之后遗留在上清液中的GFP荧光颗粒的量，也证实了g型核外颗粒体耗竭(图8D)。CD47对巨噬细胞对g型核外颗粒体的耗竭的影响不具有报告基因特异性，因为Cre g型核外颗粒体表现出类似的耗竭趋势(未示出)。通过蛋白质印迹证实了HEK293T细胞中CD47的表达(图8E)。为了测试CD47是否在体内抑制了g型核外颗粒体清除，向Balb/c小鼠静脉注射有或没有CD47的VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体(图8E)。通过流式细胞术测量在注射之后3小时在循环中的荧光VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体颗粒水平。具有CD47的VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体示出了在循环中在统计学上显著更高的保留(图8F)。因此，这些结果证明，mCD47在g型核外颗粒体上的存在会减慢其被巨噬细胞去除，并且相反，扰动mCD47-SIRPα相互作用会加速其耗竭。

如果此平台可以介导活动物的体组织中的基因编辑，那么使用g型核外颗粒体进行基因编辑核糖核蛋白复合物的生物相容性递送可以与治疗剂更加相关。已经证明，SaCas9和靶向原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的sgRNA到小鼠肝细胞的AAV病毒递送导致了血清PCSK9和总胆固醇水平显著降低。广泛验证了用于靶向mPCSK9和Rosa26的两个sgRNA具有最小的脱靶活性。由于静脉内施用之后VSV-G假型化病毒颗粒在小鼠肝脏中累积，因此发明人研究了是否可以通过将SaCas9/mPCSK9sgRNA g型核外颗粒体注射到BALB/c小鼠中来获得对mPCSK9的部分抑制。在动物研究之前，发明人测试了是否可以利用用于通过g型核外颗粒体递送在MEF中编辑mPCSK9基因的相同sgRNA。执行与图9和补充表1所示的那些实验类似的实验，并且PCR以及DNA测序结果示出了在MEF细胞中对mPCSK9的稳健编辑(补充表2)，从而进一步验证了g型核外颗粒体作为用于在体外递送基因编辑机制的有效方法。

为了确定对SaCas9/mPCSK9sgRNA的体内g型核外颗粒体递送的功效，在第0天、第2天、第4天和第6天通过尾静脉注射向BALB/c小鼠施用1×10

构建体：通过对来自pCMV-VSV-G-Myc载体的编码序列进行PCR扩增来获得VSV-GcDNA，并且然后将其克隆到与sfGFP或GFP11和Vpr标签融合的pBbrs真核表达载体中。从pCMV-VSV-G(P127D)-Myc对VSV-G-P127D进行PCR扩增，并且将其克隆到与GFP11和Vpr标签融合的pBbrs载体中。从pCMV4-BlaM-Vpr对编码序列的BlaM基因进行PCR扩增，并且将其克隆到pBbrs载体中以生成pBbsr-BlaM-Vpr-GFP1-10。通过从pcDNA3.1-CMV-CFP；UBC-Cre25nt、EGFP-hAgo2、pBS-elav-1、pX602-AAV-TBG::NLS-SaCas9-NLS-HA-OLLOAS-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA和pJJB302的PCR扩增获得编码序列的Cre、AGO2、Elva、NLS-SaCas9-NLS和LwaCas13基因，并且将其克隆到pBbrs-GFP1-10载体中以生成pBbsr-Cre-GFP1-10、pBbsr-AGO2-GFP1-10、pBbsr-Elva-GFP1-10、pBbsr-NLS-SaCas9-GFP1-10和pBbsr-LwaCas13-GFP1-10。通过基因合成(扭转生物科学公司(TwistBiosciences))制备hCD9和hCD81基因，并且将其克隆到与GFP11融合的pBbrs载体中。通过克隆靶向Munc13D的一对寡核苷酸来制备Lenti-CRISPR/Cas9-sgMunc13D构建体。先前描述了pLKO-PINK1-shRNA。合成shPCSK9并且将其克隆到pLKO-shRNA中以生成pLKO-PCSK9-shRNA。合成sgCre、sgPINK1、sgEGFP和sgPCSK9并且将其克隆到pEntry-bGH-U6-(SaCas9)-sgRNA中以生成pEntry-bGH-U6-(LwaCas13)-2×sgCre、pEntry-bGH-U6-(SaCas9)-sgPINK1、pEntry-bGH-U6-(SaCas9)-sgEGFP和pEntry-bGH-U6-(SaCas9)-sgPCSK9。合成sgCre并且将其克隆到pEntry-bGH-U6-(LwaCas13)-sgRNA中以生成pEntry-bGH-U6-(LwaCas13)-2×sgCre。

VSV-G g型核外颗粒体的细胞培养和产生：从美国模式培养物保藏所(AmericanType Culture Collection)(ATCC)获得HEK293T、海拉、RPE、PANC-1、C2C12、HaCat、MEF-1、Hep3B、HCT116、Jurkat和HCC4006细胞系。将HEK293T、海拉、RPE、PANC-1、C2C12、HaCat、MEF-1和Hep3B在37℃下在5％CO

VSV-G g型核外颗粒体释放测定：发明人按照Votteler等人所描述的方法测定从转染的HEK293T细胞中对VSV-G g型核外颗粒体的释放。简而言之，将HEK293T细胞接种到6孔板中并且使用PEI方法用1μg的pBbrs-VSV-G-Vpr-GFP11和/或1μg表达指示的货物蛋白如BlaM-Vpr-GFP1-10、Cre-GFP1-10、AGO2-GFP1-10(具有5μg指示的shDNA质粒)或SaCas9-GFP1-10(具有5μg指示的sgDNA质粒)的质粒以70-80％融合度进行转染。6小时后，将培养基用2mL新鲜DMEM置换。48小时后，收集细胞和培养上清液。以2000rpm清理10分钟以去除细胞碎片之后，通过在100,000×g 4℃下超速离心90分钟从上清液中获得全部释放的颗粒。将细胞在100μL裂解缓冲液(50mMTris pH 7.4、150mM NaCl、1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)中在冰中裂解30分钟并且然后通过在12,000rpm 4℃下离心5分钟来澄清以得到Triton可溶和不可溶的细胞级分。将沉淀的培养上清液和Triton不可溶沉淀物分别通过煮沸5分钟而溶于30μL和100μL SDS-PAGE装载缓冲液中。将Triton可溶级分、Triton不可溶级分和释放的颗粒按照标准方案进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。

蛋白质印迹和抗体：为了分析蛋白质水平，将Triton可溶级分、Triton不可溶级分、释放的颗粒或总细胞提取物通过12％SDS-PAGE进行解析并且转移至0.22-m硝酸纤维素膜并且与特异性抗体在4℃下温育过夜。用于蛋白质印迹的抗体如下：抗VSV-G(小鼠，1:1000，卡拉法斯特公司(Kerafast))；抗GFP(兔，1:1000，细胞信号传导技术公司(CellSignaling Technology))；抗BlaM(小鼠，1:1000，艾博抗公司(Abcam))；抗PINK1(兔，1:1000，细胞信号传导技术公司)；抗GAPDH(1:2000，圣克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotechnology))；抗CD9(兔，1:1000，细胞信号传导技术公司)；抗GM130(小鼠，1:1000，细胞信号传导技术公司)；抗β-肌动蛋白(小鼠，1:2000，圣克鲁兹生物技术公司)；抗辅肌动蛋白4(小鼠，1:1000，圣克鲁兹生物技术公司)；抗TSG101(小鼠，1:1000，圣克鲁兹生物技术公司)；抗膜联蛋白V(小鼠，1:1000，细胞信号传导技术公司)；抗脂筏标记蛋白(anti-Flotillin)(小鼠，1:1000，细胞信号传导技术公司)。Munc13D抗体是来自Jingshi Shen博士的馈赠。

对VSV-G g型核外颗粒体的Nanosight分析：在HEK293T细胞中表达并组合与GFP11融合的VSV-G和与GFP1-10融合的货物基因，使得在NanoSight分析下，具有货物蛋白的分泌性VSV-G包被的g型核外颗粒体示出GFP信号。使用配备有sCMOS相机和NanoSight NTA 3.0软件的NanoSight NS300(英国NanoSight有限公司(NanoSight Ltd.,UK))对来自HEK293T培养上清液的原始释放的VSV-G g型核外颗粒体进行测定以测量全部颗粒和VSV-G g型核外颗粒体的大小分布和浓度。测量条件如下：温度介于21℃与23.6℃之间；黏度介于0.9与0.965cP之间；测量时间未60秒；以及重复3次。所有样品的测量阈值均类似。在透明散射测量下获得全部颗粒的数据。发明人使用488nm的荧光滤光片来阻挡散射的激光并且仅对来自VSV-G g型核外颗粒体的荧光信号进行成像以测量大小分布。结果指示了颗粒的平均大小和三次重复的标准偏差。

VSV-G g型核外颗粒体纯化：使用来自HEK293T培养上清液的含有VSV-G-GFP-BlaM-Vpr蛋白的原始释放颗粒来通过超速离心对VSV-G g型核外颗粒体进行纯化以用于蛋白质印迹实验和流式细胞术分选从而得到纯的绿色VSV-G g型核外颗粒体以进行负染色电子显微镜和蛋白质印迹分析。为了进行超速离心，对用VSV-G-Vpr-GFP11和BlaM-Vpr-GFP1-10质粒瞬时转染的HEK293T细胞的原始培养上清液进行清理以去除细胞碎片并且通过在4℃下在SW41Ti(贝克曼库尔特有限公司(BeckmanCoulter))中在100,000×g下超速离心90分钟进行收集。将沉淀物重悬并且在SDS-PAGE装载缓冲液中煮沸5分钟以进行蛋白质印迹分析从而对包膜蛋白VSV-G与货物蛋白BlaM之间的包装比例进行定量。发明人使用FACSAria融合细胞分选仪通过流式细胞术获得了纯的VSV-G g型核外颗粒体。将鞘缓冲液中的分选的VSV-G绿色颗粒在100,000×g 4℃下通过20％蔗糖垫超速离心90分钟。将沉淀物重悬于PBS中以进行免疫金标记并且在SDS-PAGE装载缓冲液中煮沸5分钟以进行蛋白质印迹分析，从而在标准蛋白(重组VSV-IG印第安纳蛋白对照和重组β内酰胺酶)存在的情况下对每个VSV-G g型核外颗粒体中的包膜蛋白VSV-G和货物蛋白BlaM的量进行定量。

电子显微镜的阴性染色-免疫金标记：将通过如上所述的FACS分选纯化的VSV-G-GFP-BlaM g型核外颗粒体应用于阴性染色-免疫金标记分析。首先，将样品置于放电的、碳涂覆的400目铜网格上、用纯水冲洗并且用0.75％的甲酸铀酰染色。将网格可视化以进行颗粒验证并且然后应用于免疫金标记。其次，将网格上的样品与小鼠抗VSV-G(或小鼠血清)以1:50连续温育1小时，并且与山羊抗小鼠IgG/M-金6nm以1:40温育1小时。以52,000×放大率在120kV Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜上记录图像。

BlaM和Cre蛋白递送测定：对于β-内酰胺酶(BlaM)递送测定，发明人使用了先前描述的改进方法。简而言之，发明人将2mL的原始释放的VSV-G-GFP-BlaM g型核外颗粒体置于6孔板中的每个孔的海拉细胞上以摄取颗粒。16小时后或在指示的时间点，将海拉细胞胰蛋白酶化并且通过在1000rpm下减慢旋转5分钟进行采集。按照悬浮液标记方法使用根据制造商的说明书(GeneBLAzer体内检测试剂盒，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))制备的50μL的CCF2-AM标记溶液将细胞沉淀物重悬。将细胞在25℃下标记1小时并且然后添加500μL新鲜DMEM培养基以进行流式细胞术测定(BD FACSCelesta，BD生物科学公司(BDBiosciences))。分析荧光发射光谱从绿色(520nm)到蓝色(447nm)的变化。用BD FACSDiva收集结果，并且所述结果指示三次重复的平均百分比和标准偏差。对于Cre重组酶递送测定，发明人使用293ColorSwitch细胞作为受体细胞。293ColorSwitch细胞系表达含有DsRed与终止密码子的报告基因，所述终止密码子由GFP上游的两个LoxP位点侧接。在没有Cre的情况下，CMV启动子将DsRed高表达驱动到终止密码子，并且细胞显示出强红色荧光。由于在DsRed之后的终止密码子，未表达下游GFP ORF。在引入Cre后，Cre切除/缺失两个loxP位点之间的DNA片段，这去除了终止密码子，从而产生了如通过流式细胞术检测到的强绿色荧光。发明人将2mL的原始释放的VSV-G-GFP-Cre g型核外颗粒体置于6孔板中的每个孔的293ColorSwitch细胞上以摄取颗粒。二十四小时后，采集感染的293ColorSwitch细胞并且使其直接进行流式细胞术测定。用BD FACSDiva收集结果，并且所述结果指示绿色细胞的平均百分比和三次重复的标准偏差。

siRNA递送测定：使用VSV-G g型核外颗粒体将指示的siRNA转移到靶细胞中。发明人使用上述方法制备了含有AGO2-shPINK1(或shPCSK9)的VSV-G g型核外颗粒体。简而言之，使用表达质粒VSV-G-Vpr-GFP11和AGO2-GFP1-10与转录质粒shPINK1或shPCSK9瞬时转染HEK293T细胞。然后，采集释放的VSV-G g型核外颗粒体，并且将其直接用于放置在受体细胞海拉-维纳斯-帕金-RFP-Smac和海拉-PINK1-EGFP(对于shPINK1)或Hep3B细胞(对于shPCSK9)上。三天或五天后，在海拉-维纳斯-帕金-RFP-Smac中，发明人分析在如所述的CCCP处理下在线粒体上的帕金蛋白定位。在海拉-PINK1-EGFP细胞中，发明人使用流式细胞术分析检查PINK1-EGFP水平。简而言之，使用20μM CCCP处理细胞2小时，并且采集所述细胞以使用FACSCelesta仪器(BD生物科学公司)运行流式细胞术。

应用通过VSV-G g型核外颗粒体递送的所有siRNA细胞以提取总RNA用于RT-qPCR从而检查PINK1或PCSK9基因的mRNA水平并且提取总蛋白质用于蛋白质印迹从而按照标准程序探测PINK1或PCSK9的蛋白质水平。qRT-PCR中使用的引物在下文列出：5'-5'-CACCGCCTGGAGGTGACAAAGAGCA-3'-3'(PINK1，正向)、5'-5'-AAACTGCTCTTTGTCACCTCCAGGC-3'-3'(PINK1，反向)、5'-ATGGTCACCGACTTCGAGAAT-3'(PCSK9，正向)和5'-GTGCCATGACTGTCACACTTG-3'(PCSK9，反向)。

CRISPR基因组编辑机递送和编辑的基因组测定：将VSV-G g型核外颗粒体用于CRISPR基因编辑机递送。发明人使用上述方法制备含有SaCas9-sgPINK1(或sgPCSK9)的VSV-G g型核外颗粒体。简而言之，使用表达质粒VSV-G-Vpr-GFP11和SaCas9-GFP1-10与转录质粒sgPINK1或sgPCSK9瞬时转染HEK293T细胞。然后，采集释放的VSV-G g型核外颗粒体，并且将其直接用于放置在受体细胞海拉-维纳斯-帕金-RFP-Smac和海拉-PINK1-EGFP(对于sgPINK1)或MEF细胞(对于sgPCSK9)上。三天或五天后，在海拉-维纳斯-帕金-RFP-Smac和海拉-PINK1-EGFP细胞中，发明人分析在如上所述的CCCP处理下在线粒体上的帕金蛋白定位以及PINK1-EGFP蛋白的水平，并且提取总RNA(用于RT-qPCR以检查PINK1mRNA水平)和DNA并将其储存在-80℃下以进行后续分析。为了检查PCSK9基因编辑，提取经处理的MEF细胞的DNA并将其储存在-80℃下以进行后续分析。

为了追踪VSV-G g型核外颗粒体是否介导SaCas9-sgRNA的传递，按照制造商的说明书使用血液和组织DNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取经处理的细胞的基因组DNA。PINK1基因靶标的引物序列为5'-CGCTGCTGCTGCGCTTCA-3'(PINK1Ex1，正向，对于外显子PCR)和5'-CTGCTCCATACTCCCCAGCC-3'(PINK1Ex3，反向，对于外显子PCR)、5'-GTCTCCATAATCAGACACCT-3'(PINK1Int2，正向，对于内含子PCR)和5'-GGATGGTGAACTAACCAATC-3'(PINK1Int3，反向，对于内含子PCR)。PCSK9基因靶标的引物序列如下：5'-GATGCCACTTTACTTCGGAGGA-3'(正向)和5'-AGGAGGATTGGAGTGGGGATTA-3'(反向)。PCR程序作为标准程序执行。然后回收PCR产物并且将其应用于TA克隆(TOPO TA克隆试剂盒，英杰公司(Invitrogen))。对具有插入片段的菌落进行测序，以与GeneBank中的基因组序列进行序列比对。

小鼠注射、加工和血清分析：发明人将VSV-G-GFP-SaCas9-sgPCSK9g型核外颗粒体应用于小鼠，以分析VSV-G g型核外颗粒体是否可以将基因编辑机转移到小鼠肝脏中。对于小鼠注射，针对在Freestyle 293表达培养基中生长的HEK293T产生所有颗粒并且在2000rpm下去除细胞碎片10分钟之后采集所述颗粒。然后通过上文描述的Nanosight测量VSV-G颗粒的浓度。使用截止值为100KDa的Amicon Ultra-15离心过滤单元通过超滤将原始释放的VSV-G g型核外颗粒体浓缩约100倍。所有小鼠实验方案均得到科罗拉多大学博尔德分校的IACUC办公室批准。通过尾静脉将VSV-G-GFP-SaCas9-sgPCSK9g型核外颗粒体静脉注射到4周龄的雄性BALB/c小鼠中。将150μL无菌磷酸盐缓冲盐水中的约1×10

为了探测小鼠血清中PCSK9蛋白和LDL-胆固醇的水平，将小鼠禁食过夜15小时，然后通过大隐静脉进行血液收集。对于每次，在注射后每10天，从每只小鼠收集约100μL血液。获得血清并将其储存在-20℃下以进行后续分析。注射后30天，通过二氧化碳吸入处死所有小鼠，并且收集肝组织样品并将其储存在-80℃下以进行后续DNA和蛋白质提取，所述DNA用于上文描述的PCSK9基因编辑分析，所述蛋白质用于通过蛋白质印迹进行PCSK9蛋白质分析。血清中PCSK9蛋白的水平使用市售ELISA试剂盒(小鼠前蛋白转化酶9/PCSK9QuantikineELISA试剂盒，MPC-900，R&D系统公司(R&DSystems))并且按照制造商的说明书通过ELISA来确定。按照制造商的说明书使用小鼠LDL-胆固醇试剂盒(晶体化学公司(Crystal Chem))测量血清中的LDL-胆固醇水平。

统计分析：使用ImageJ和GraphPad Prism 6执行对蛋白质印迹的统计分析。使用GraphPad Prism 6执行对RT-qPCR的统计分析。通过维纳斯-帕金与RFP-Smac-MTS在每种条件下在约200个细胞中共定位并且根据至少三个独立实验来对维纳斯-帕金线粒体募集进行定量。从至少三组数据中计算出标准偏差。所有p值均使用GraphPad Prism6确定。

表

表1.从293T细胞培养上清液中纯化VSV-G-sfGFP g型核外颗粒体的结果。

表2.从细胞培养上清液中纯化包封在g型核外颗粒体中的BlaM-vpr-GFP的结果。

补充表3.含有来自由VSV-G-GFP11/SaCas9/sgPINK1编辑的海拉细胞的PINK1扩增区域的克隆的DNA测序。

补充表4.含有来自由VSV-G-GFP11/SaCas9/sgPCSK9g型核外颗粒体编辑的MEF和小鼠肝脏的PCSK9扩增区域的克隆的DNA测序。

参考文献

[1]Abudayyeh,O.O.、Gootenberg,J.S.、Essletzbichler,P.、Han,S.、Joung,J.、Belanto,J.J.、Verdine,V.、Cox,D.B.T.、Kellner,M.J.、Regev,A.等人(2017).用CRISPR-Cas13进行RNA靶向(RNA targeting with CRISPR-Cas13).《自然(Nature)》550,280-284。

[2]Ahi,Y.S.、Bangari,D.S.和Mittal,S.K.(2011).腺病毒载体免疫力：其意义和规避策略(Adenoviral vector immunity:its implications and circumventionstrategies.)《当代基因疗法(Curr.Gene Ther.)》11,307-320。

[3]Al-Nedawi,K.、Meehan,B.、Micallef,J.、Lhotak,V.、May,L.、Guha,A.和Rak,J.(2008).致癌受体EGFRvIII通过衍生自肿瘤细胞的微囊泡进行细胞间转移(Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesiclesderived from tumour cells.)《自然细胞生物学(Nat.Cell Biol.)》10,619。

[4]Al-Nedawi,K.、Meehan,B.、Kerbel,R.S.、Allison,A.C.和Rak,J.(2009).自分泌VEGF在摄取含有致癌EGFR的肿瘤源性微囊泡后的内皮表达(Endothelial expressionof autocrine VEGF upon the uptake of tumor-derived microvesicles containingoncogenic EGFR.)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》106,3794-3799。

[5]Barclay,A.N.和Van den Berg,T.K.(2014).信号调节蛋白α(SIRPα)与CD47之间的相互作用：结构、功能和治疗性靶标(The interaction between signal regulatoryprotein alpha(SIRPα)and CD47:structure,function,and therapeutic target.)《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》32,25-50。

[6]Cabantous,S.、Terwilliger,T.C.和Waldo,G.S.(2005).用绿色荧光蛋白的工程化自组装片段对蛋白质进行标签化和检测(Protein tagging and detection withengineered self-assembling fragments of green fluorescent protein.)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》23,102-107。

[7]Capecchi,M.(1989).通过同源重组改变基因组(Altering the genome byhomologous recombination.)《科学(Science)》244,1288-1292。

[8]Cavrois,M.、de Noronha,C.和Greene,W.C.(2002).检测原代T淋巴细胞中的HIV-1病毒体融合的基于敏感性和特异性酶的测定(A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1virion fusion in primary T lymphocytes.)《自然生物技术》20,1151-1154。

[9]Chao,M.P.、Weissman,I.L.和Majeti,R.(2012).癌症免疫逃逸中的CD47-SIRPα途径和潜在的治疗意义(The CD47-SIRPαpathway in cancer immune evasion andpotential therapeutic implications.)《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)》24,225-232。

[10]Charlesworth,C.T.、Deshpande,P.S.、Dever,D.P.、Camarena,J.、Lemgart,V.T.、Cromer,M.K.、Vakulskas,C.A.、Collingwood,M.A.、Zhang,L.、Bode,N.M.等人(2019).鉴别人类针对Cas9蛋白已有的适应性免疫(Identification of preexistingadaptive immunity to Cas9 proteins in humans.)《自然医学(Nat.Med.)》25,249-254。

[11]Chevillet,J.R.、Kang,Q.、Ruf,I.K.、Briggs,H.A.、Vojtech,L.N.、Hughes,S.M.、Cheng,H.H.、Arroyo,J.D.、Meredith,E.K.、Gallichotte,E.N.等人(2014).外泌体的微RNA含量的定量和化学计量分析(Quantitative and stoichiometric analysis of themicroRNA content of exosomes.)《美国国家科学院院刊》111,14888-14893。

[12]Clarke,D.C.和Liu,X.(2010).使用定量免疫印迹测量smad转录因子的绝对丰度(Measuring the absolute abundance of the smad transcription factors usingquantitative immunoblotting.)

[12]Clarke,D.C.、Betterton,M.D.和Liu,X.(2006).Smad信号传导的系统理论(Systems theory of Smad signalling.)《IEE系统生物学学报(IEE Proc Syst Biol)》153,412-424。

[13]Cocucci,E.和Meldolesi,J.(2015).核外颗粒体和外泌体：消除胞外囊泡之间的混乱(Ectosomes and exosomes:shedding the confusion between extracellularvesicles.)《细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.)》25,364-372。

[14]Cox,D.B.T.、Gootenberg,J.S.、Abudayyeh,O.O.、Franklin,B.、Kellner,M.J.、Joung,J.和Zhang,F.(2017).利用CRISPR-Cas13进行RNA编辑(RNA editing withCRISPR-Cas13.)10。

[15]Deregibus,M.C.、Cantaluppi,V.、Calogero,R.、Lo Iacono,M.、Tetta,C.、Biancone,L.、Bruno,S.、Bussolati,B.和Camussi,G.(2007).内皮祖细胞源性微囊泡通过mRNA的水平转移激活内皮细胞中的血管生成程序(Endothelial progenitor cellderived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells bya horizontal transfer of mRNA.)《血液(Blood)》110,2440-2448。

[16]Doudna,J.A.和Charpentier,E.(2014).利用CRISPR-Cas9进行基因组工程化的新领域(The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.)《科学》346,1258096-1258096。

[17]Follenzi,A.、Santambrogio,L.和Annoni,A.(2007).对慢病毒载体的免疫应答(Immune responses to lentiviral vectors.)《当代基因疗法(Curr.Gene Ther.)》7,306-315。

[18]Fu,A.、Tang,R.、Hardie,J.、Farkas,M.E.和Rotello,V.M.(2014).细胞内蛋白质递送的前景和缺陷(Promises and pitfalls of intracellular delivery ofproteins.)《生物共轭化学(Bioconjug.Chem.)》25,1602-1608。

[19]Gallardo,H.F.、Tan,C.、Ory,D.和Sadelain,M.用水泡性口炎病毒G糖蛋白假型化的重组逆转录病毒介导人外周血淋巴细胞中稳定的基因转移和假性转导两者(Recombinant Retroviruses Pseudotyped With the Vesicular Stomatitis Virus GGlycoprotein Mediate Both Stable Gene Transfer and Pseudotransduction inHuman Peripheral Blood Lymphocytes.)7。

[20]Hammond,S.M.(2001).Argonaute2，RNAi的基因分析与生化分析之间的联系(Argonaute2,a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi.)《科学》293,1146-1150。

[21]Haraszti,R.A.、Didiot,M.-C.、Sapp,E.、Leszyk,J.、Shaffer,S.A.、Rockwell,H.E.、Gao,F.、Narain,N.R.、DiFiglia,M.、Kiebish,M.A.等人(2016).对来自不同细胞来源的外泌体和微囊泡的高分辨率蛋白质组学和脂质组学分析(High-resolutionproteomic and lipidomic analysis of exosomes and microvesicles from differentcell sources.)《胞外囊泡杂志(J Extracell Vesicles)》5,32570。

[22]Hirschberg,K.、Miller,C.M.、Ellenberg,J.、Presley,J.F.、Siggia,E.D.、Phair,R.D.和Lippincott-Schwartz,J.(1998).分泌蛋白运输的动力学分析和活细胞中的高尔基体到质膜转运中间体的表征(Kinetic analysis of secretory protein trafficand characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates inliving cells.)《细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)》143,1485-1503。

[23]Hurley,J.H.、Boura,E.、Carlson,L.-A.和

[24]Jeppesen,D.K.、Fenix,A.M.、Franklin,J.L.、Higginbotham,J.N.、Zhang,Q.、Zimmerman,L.J.、Liebler,D.C.、Ping,J.、Liu,Q.、Evans,R.等人(2019).外泌体组成的重新评估(Reassessment of Exosome Composition.)《细胞》177,428-445.e18。

[25]Kaczmarek,J.C.、Kowalski,P.S.和Anderson,D.G.(2017).RNA治疗剂的递送进展：从概念到临床现实(Advances in the delivery of RNA therapeutics:fromconcept to clinical reality.)《基因组医学(Genome Med.)》9,60。

[26]Kamerkar,S.、LeBleu,V.S.、Sugimoto,H.、Yang,S.、Ruivo,C.F.、Melo,S.A.、Lee,J.J.和Kalluri,R.(2017).外泌体促进对胰腺癌中致癌性KRAS的治疗性靶向(Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreaticcancer.)《自然》546,498-503。

[27]Kanada,M.、Bachmann,M.H.、Hardy,J.W.、Frimannson,D.O.、Bronsart,L.、Wang,A.、Sylvester,M.D.、Schmidt,T.L.、Kaspar,R.L.、Butte,M.J.等人(2015).通过胞外囊泡递送至靶细胞的生物分子的差异命运(Differential fates of biomoleculesdelivered to target cells via extracellular vesicles.)《美国国家科学院院刊》112,E1433-E1442。

[28]Kowal,J.、Arras,G.、Colombo,M.、Jouve,M.、Morath,J.P.、Primdal-Bengtson,B.、Dingli,F.、Loew,D.、Tkach,M.和Théry,C.(2016).蛋白质组学比较定义了新颖的标志物以表征胞外囊泡亚型的异质群体(Proteomic comparison defines novelmarkers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesiclesubtypes.)《美国国家科学院院刊》113,E968-E977。

[29]Levin,A.A.(2019).用寡核苷酸在RNA水平下治疗疾病(Treating Diseaseat the RNA Level with Oligonucleotides.)《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》380,57-70。

[30]Liu,M.-L.、Winther,B.L.和Kay,M.A.(1996).通过使用浓缩的假型水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)-莫罗尼鼠白血病病毒源性逆转录病毒载体对肝细胞进行假转导：VSV-G与两性载体针对肝基因转移的比较(Pseudotransduction of Hepatocytes byUsing Concentrated Pseudotyped Vesicular Stomatitis Virus G Glycoprotein(VSV-G)–Moloney Murine Leukemia Virus-Derived Retrovirus Vectors:Comparison ofVSV-G and Amphotropic Vectors for Hepatic Gene Transfer.)《病毒学杂志(JVIROL)》70,6。

[31]Lodish,H.F.和Weiss,R.A.(1979).在产生病毒糖蛋白时有缺陷的水泡性口炎病毒的突变体的选择性分离(Selective Isolation of Mutants of VesicularStomatitis Virus Defective in Production of the Viral Glycoprotein.)《病毒学杂志》30,13。

[32]Maeder,M.L.和Gersbach,C.A.(2016).基因和细胞疗法的基因组编辑技术(Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy.)《分子疗法(Mol.Ther.)》24,430-446。

[33]Mangeot,P.-E.、Dollet,S.、Girard,M.、Ciancia,C.、Joly,S.、Peschanski,M.和Lotteau,V.(2011).通过VSV-G诱导的纳米囊泡将蛋白质转移到人细胞中(ProteinTransfer Into Human Cells by VSV-G-induced Nanovesicles.)《分子疗法》19,1656-1666。

[34]Mathieu,M.、Martin-Jaular,L.、Lavieu,G.和Théry,C.(2019).外泌体和其它胞外囊泡用于细胞间通讯的分泌和摄取的特异性(Specificities of secretion anduptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cellcommunication.)《自然细胞生物学》21,9-17。

[35]Meister,G.和Tuschl,T.(2004).由双链RNA进行基因沉默的机制(Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.)《自然》431,343-349。

[36]Messenger,S.W.、Woo,S.S.、Sun,Z.和Martin,T.F.J.(2018).由Munc13-4调节癌细胞中的Ca 2+刺激的外泌体释放途径(A Ca 2+-stimulated exosome releasepathway in cancer cells is regulated by Munc13-4.)《细胞生物学杂志》jcb.201710132。

[37]Narendra,D.P.、Jin,S.M.、Tanaka,A.、Suen,D.-F.、Gautier,C.A.、Shen,J.、Cookson,M.R.和Youle,R.J.(2010).PINK1在受损的线粒体上选择性地稳定化以激活帕金蛋白(PINK1is selectively stabilized on impaired mitochondria to activateParkin.)《PLoS生物学(PLoS Biol)》8。

van Niel,G.、D'Angelo,G.和Raposo,G.(2018).胞外囊泡的细胞生物学展望(Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.)《分子细胞生物学自然评论(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.)》19,213-228。

[38]Pan,D.、Gunther,R.、Duan,W.、Wendell,S.、Kaemmerer,W.、Kafri,T.、Verma,I.M.和Whitley,C.B.(2002).对小鼠进行静脉内施用并观察骨髓的体内转导之后VSVG假型慢病毒载体的生物分布和毒性研究(Biodistribution and Toxicity Studies of VSVG-Pseudotyped Lentiviral Vector after Intravenous Administration in Mice withthe Observation of in Vivo Transduction of Bone Marrow.)《分子疗法》6,19-29。

[39]Ran,F.A.、Cong,L.、Yan,W.X.、Scott,D.A.、Gootenberg,J.S.、Kriz,A.J.、Zetsche,B.、Shalem,O.、Wu,X.、Makarova,K.S.等人(2015).使用金黄色葡萄球菌Cas9进行体内基因组编辑(In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.)《自然》520,186-191。

[40]Raposo,G.和Stoorvogel,W.(2013).胞外囊泡：外泌体、微囊泡和朋友(Extracellular vesicles:Exosomes,microvesicles,and friends.)《细胞生物学杂志》200,373-383。

[41]Rolls,M.M.、Webster,P.、Balba,N.H.和Rose,J.K.(1994).通过从自复制RNA表达水泡性口炎病毒糖蛋白生成的新颖感染性颗粒(Novel infectious particlesgenerated by expression of the vesicular stomatitis virus glycoprotein from aself-replicating RNA.)《细胞》79,497-506。

[42]Rose,N.F.、Buonocore,L.、Schell,J.B.、Chattopadhyay,A.、Bahl,K.、Liu,X.和Rose,J.K.(2014).含有单个结构蛋白的高滴度病毒样囊泡的体外进化(In vitroevolution of high-titer,virus-like vesicles containing a single structuralprotein.)《美国国家科学院院刊》111,16866-16871。

[43]Shalem,O.、Sanjana,N.E.和Zhang,F.(2015).使用CRISPR-Cas9的高通量功能基因组学(High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9.)《遗传学自然评论(Nat.Rev.Genet.)》16,299-311。

[44]Skog,J.、Würdinger,T.、van Rijn,S.、Meijer,D.H.、Gainche,L.、CurryJr.,W.T.、Carter,B.S.、Krichevsky,A.M.和Breakefield,X.O.(2008).胶质母细胞瘤微囊泡转运促进肿瘤生长并提供诊断性生物标志物的RNA和蛋白质(Glioblastomamicrovesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth andprovide diagnostic biomarkers.)《自然细胞生物学》10,1470。

[45]Sockolosky,J.T.、Dougan,M.、Ingram,J.R.、Ho,C.C.M.、Kauke,M.J.、Almo,S.C.、Ploegh,H.L.和Garcia,K.C.(2016).对CD47阻断的持久抗肿瘤应答需要适应性免疫刺激(Durable antitumor responses to CD47blockade require adaptive immunestimulation.)《美国国家科学院院刊》113,E2646-2654。

[46]Tkach,M.和Théry,C.(2016).胞外囊泡的通讯：所处何地以及需要去往何处(Communication by Extracellular Vesicles:Where We Are and Where We Need toGo.)《细胞》164,1226-1232。

[47]Valadi,H.、

[48]Votteler,J.和Sundquist,W.I.(2013).病毒萌芽和ESCRT途径(VirusBudding and the ESCRT Pathway.)《细胞宿主微生物(Cell Host Microbe)》14,232-241。

[49]Votteler,J.、Ogohara,C.、Yi,S.、Hsia,Y.、Nattermann,U.、Belnap,D.M.、King,N.P.和Sundquist,W.I.(2016).设计的蛋白质诱导含有纳米笼的胞外囊泡的形成(Designed proteins induce the formation of nanocage-containing extracellularvesicles.)《自然》540,292-295。

[50]Weissenhorn,W.、Hinz,A.和Gaudin,Y.(2007).病毒膜融合(Virus membranefusion.)《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)》581,2150-2155。

[51]Weissenhorn,W.、Poudevigne,E.、Effantin,G.和Bassereau,P.(2013).如何摆脱：ssRNA包膜病毒和膜裂变(How to get out:ssRNA enveloped viruses andmembrane fission.)《当前病毒学观点(Curr.Opin.Virol.)》3,159-167。

[52]Wittrup,A.、Ai,A.、Liu,X.、Hamar,P.、Trifonova,R.、Charisse,K.、Manoharan,M.、Kirchhausen,T.和Lieberman,J.(2015).可视化来自核内体的脂质体调配的siRNA释放和靶基因敲低(Visualizing lipid-formulated siRNA release fromendosomes and target gene knockdown.)《自然生物技术》33,870。

[53]Zhang,C.、Lee,S.、Peng,Y.、Bunker,E.、Giaime,E.、Shen,J.、Zhou,Z.和Liu,X.(2014a).PINK1触发帕金蛋白的自催化激活以指定细胞命运决定(PINK1 triggersautocatalytic activation of parkin to specify cell fate decisions.)《当代生物学(Curr.Biol.)》24,1854-1865。

[54]Zhang,C.、Lee,S.、Peng,Y.、Bunker,E.、Giaime,E.、Shen,J.、Zhou,Z.和Liu,X.(2014b).PINK1触发帕金蛋白的自催化激活以指定细胞命运决定(PINK1triggersautocatalytic activation of parkin to specify cell fatedecisions.)《当代生物学》24,1854-1865。

[55]Zhang,C.、Liu,Z.、Bunker,E.、Ramirez,A.、Lee,S.、Peng,Y.、Tan,A.C.、Eckhardt,S.G.、Chapnick,D.A.和Liu,X.(2017).索拉非尼靶向线粒体电子转运链复合物和ATP合成酶以激活PINK1-帕金途径并调节细胞药物应答(Sorafenib targets themitochondrial electron transport chain complexes and ATP synthase to activatethe PINK1-Parkin pathway and modulate cellular drug response.)《生物化学杂志(JBiol Chem)》292,15105-15120。

[56]Zhang,Y.、Chopp,M.、Meng,Y.、Katakowski,M.、Xin,H.、Mahmood,A.和Xiong,Y.(2015).衍生自多能性间充质基质细胞的外泌体对创伤性脑损伤后大鼠的功能恢复和神经血管可塑性的影响(Effect of exosomes derived from multipluripotentmesenchymal stromal cells on functional recovery and neurovascular plasticityin rats after traumatic brain injury.)《神经外科杂志(J Neurosurg)》122,856-867。

[57]Zomer,A.、Maynard,C.、Verweij,F.J.、Kamermans,A.、

[58]美国专利申请第13/505,506号。

[59]美国专利9,593,356。