检测受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的装置

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及检测受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的装置。

背景技术

PRDM1(positive regulator domain 1-binding factor 1)编码蛋白质为blimp-1，是一个包含锌指结构蛋白的转录因子，在B细胞和T细胞的中都具有重要的调控作用。一方面，PRDM1的表达是B细胞分化成浆细胞所必需的，PRDM1可以促进B淋巴细胞终末分化为抗体分泌细胞；另一方面，PRDM1也在维持T细胞自我耐受和稳态中极其重要：在小鼠T细胞中敲除PRDM1后会导致外周血中效应T细胞的比例增加，并且出现严重的T细胞介导的组织器官病理损伤。这些都表明PRDM1在T细胞中具有重要的调节功能。此外，PRDM1在效应Treg的产生和分化中起着重要作用，有研究发现在急性髓细胞性白血病(AML)患者中T细胞中高表达PRDM1，并且高表达的PRDM1损害了自身细胞毒性功能并降低了Th1的分化。然而，在人体稳态条件下T细胞中PRDM1的作用仍不清楚。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是在骨髓动员中性粒细胞中起主要作用关键调节分子，并广泛运用于临床造血干细胞移植(HSCT)。对健康供者应用G-CSF可以有效降低移植物抗宿主病(GVHD)的发生，提示了G-CSF具有重要的免疫调节功能。越来越多的研究发现，G-CSF不仅可以影响细胞因子分泌，使T细胞从Th1极化到Th2，包括降低IL-2，干扰素和增加IL-4的分泌。G-CSF除对效应T细胞具有直接调控作用外，同时还可以通过调节性T细胞(Treg)，树突状细胞(DC)等，从而抑制T细胞增殖。然而，G-CSF诱导T细胞免疫耐受的分子机制仍然不清楚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何确定治疗GVHD等自身免疫疾病的靶分子或如何在临床上预测GVHD的发生。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的装置。所述装置包括：

A1)数据获取模块：用于读取受检者T细胞中PRDM1基因表达的数据。

A2)数据选择模块：用于读取健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据。

A3)数据分析模块：用于统计分析A1)所述数据与A2)所述数据的差异显著性。

A4)结果输出模块：根据所述差异显著性，输出所述受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的结果为0或1，所述1代表所述受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病；所述0代表述受检者未发生移植物抗宿主病或不会即将发生移植物抗宿主病。

上文所述装置中，A1)所述数据显著或极显著低于A2)所述数据，则A4)所述结果输出模块的结果为1；A1)所述数据与A2)所述数据之间不存在显著差异或A1)所述数据显著高于A2)所述数据，则A4)所述结果输出模块的结果为0。

上文所述的装置中，A1)和/或A2)中所述数据可通过荧光定量PCR检测获得。

上文所述的装置中，A2)中所述数据可来源于已有数据库。

上文所述的装置中，A1)和/或A2)中所述T细胞可来源于所述受检者和/或健康人的外周血。

上文所述的装置中，所述受检者为急性白血病造血干细胞移植后患者或进行造血干细胞移植前提供造血干细胞的经过G-CSF处理后的健康供者。

上文所述的装置中，所述的健康人可为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者或经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者的造血干细胞的健康人供者，所述健康供者经过G-CSF处理。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一个存储有计算机程序的计算机可读存储介质。所述计算机程序使计算机可执行如下步骤：

1)读取受检者和健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据；统计分析受检者T细胞中PRDM1基因表达的数据与健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据的差异显著性。

2)根据所述差异显著性，结果输出模块输出所述受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的结果为0或1，所述1代表所述受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病；所述0代表述受检者未发生移植物抗宿主病或不会即将发生移植物抗宿主病。

上文所述计算机可读存储介质中，所述受检者T细胞中PRDM1基因表达的数据显著或极显著低于所述健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据时，所述结果输出模块的结果为1；所述受检者T细胞中PRDM1基因表达的数据与所述健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据之间不存在显著差异或所述受检者T细胞中PRDM1基因表达的数据显著高于所述健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据时，所述结果输出模块的结果为0。

上文所述的装置和/或上文所述的计算机可存储介质在检测所述受检者发生T细胞免疫耐受中的应用也属于本发明的保护范围。

上文所述的受检者可为经造血干细胞移植后的急性白血病患者。所述的受检者也可为进行造血干细胞移植前提供病造血干细胞的经过G-CSF处理后的健康供者。

上文所述的健康人可为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者。所述健康人也可为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者的造血干细胞的健康人供者，所述健康供者经过G-CSF处理。

当上文所述受检者为经造血干细胞移植后的急性白血病患者时，上文所述健康人为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者。当上文所述受检者为进行造血干细胞移植前提供造血干细胞的经过G-CSF处理后的健康供者时，所述健康人为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者的造血干细胞的健康供者，所述健康供者经过G-CSF处理。

上文所述的T细胞可为从外周血或骨髓中分离的原代CD3+T细胞。

本发明的实施例通过检测G-CSF动员后供者T细胞中PRDM1表达的变化，发现与健康人相比，PRDM1的表达水平在G-CSF动员后的供者T细胞中显著上升；此外还发现T细胞中高表达的PRDM1可以抑制T细胞增殖，并且增加T细胞中Treg细胞的比例以及IL-4的分泌水平。在临床标本中，发生GVHD的患者T细胞中PRDM1的表达相比未发生GVHD的患者明显降低；此外，未发生GVHD病人的供者在G-CSF动员后CD4

附图说明

图1为PRDM1在G-CSF动员后供者骨髓T细胞中的表达。

图2为原代T细胞中过表达PRDM1可诱导耐受样表型。A-G:通过慢病毒感染在健康人的CD3

图3为PRDM1敲低后T细胞IL-4的分泌和Treg比例减低。A:qPCR验证siRNA敲低效率。B-C:75nM siRNA处理G-CSF动员后供者CD3

图4为Jurkat细胞系中过表达PRDM1对增殖能力的影响。A-E:通过PRDM1慢病毒载体感染Jurkat细胞系，感染48h后。A：慢病毒感染效率在空白对照、空载对照和过表达组的流式典型图。B：qPCR检测PRDM1过表达效率。C-D：流式检测细胞周期的变化。E：qPCR检测细胞周期相关的调控基因变化水平。

图5为Jurkat细胞系中高表达PRDM1对FOXP3表达的影响。A-B:通过PRDM1慢病毒载体感染Jurkat细胞系，感染48h后。A:qPCR检测FOXP3 mRNA水平的变化。B:western blot检测过表达后Foxp3蛋白水平的变化。

图6为PRDM1的高表达与低aGVHD发生率相关。A：造血干细胞移植后aGVHD患者(n＝7)与同期未发生GVHD患者(n＝7)PRDM1 mRNA的水平变化。aGVHD患者(N＝9)和non-GVHD(N＝9)患者的供者在移植前G-CSF动员后CD4

具体实施方式

下述实施例中的动物病毒公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

研究对象

从北京大学人民医院收集2018年10月-2020年7月的健康人骨髓血13例(A组)；G-CSF动员后的健康供者的骨髓血30例(B组)。收集2020年1月-7月急性白血病造血干细胞移植后患者，共15例患者的外周血(C组)，其中8例发生急性移植物抗宿主病(GVHD)的患者(C-GVHD组)，7例为未发生GVHD的患者作为对照(C-CK组)；15例急性白血病造血干细胞移植后患者中，其中T淋巴母细胞瘤2例，急性髓系细胞白血病9例，急性淋巴细胞白血病4例。上述每个参与者均签署知情同意书。

本发明实施例中的T细胞的分离与培养方法：通过Ficoll密度梯度离心法从骨髓血中分离出人骨髓单核细胞(BMMCs)。使用CD3 MicroBeads(Miltenyi Biotec,BergischeGladbach,Germany)从BMMCs中纯化CD3

本发明实施例中定量qPCR检测基因的表达方法为：根据RNeasy mini试剂盒(QIAGEN)的实验方法提取T细胞的RNA。使用cDNA逆转录试剂盒(TaKaRa，RR047A)进行cDNA的合成。利用SYBR Green染料法检测细胞中目的基因的表达情况。以18S作为内参，使用ΔCT方法计算目的基因mRNA的相对表达量。

本发明实施例中相关试剂或试剂盒来源如下：

PRDM1过表达的慢病毒载体LV-PRDM1-3*flag-ZsGreen-PURO及其对应的空载体对照载体(LV-ZsGreen-PURO)均购自Sangon Biotech(中国上海)。离子霉素(1000ng/mL；Sigma Aldrich)。固定/通透(穿孔)试剂盒(BD Bioscience，货号562574)。cDNA逆转录试剂盒(TaKaRa，RR047A)。RNeasy mini试剂盒(QIAGEN)。

实施例一、PRDM1可调控诱导T细胞的免疫耐受

1.G-CSF动员后骨髓T细胞PRDM1的表达升高

从13例健康人骨髓血(A组)和30例G-CSF动员后的健康供者的骨髓血(B组)中，使用T细胞的分离与培养方法分离T细胞。根据RNeasy mini试剂盒(QIAGEN)的实验方法分别提取A组和B组分离所得T细胞的RNA。使用cDNA逆转录试剂盒(TaKaRa，RR047A)进行cDNA的合成。利用SYBR Green染料法检测T细胞中PRDM1基因的表达情况。以18S作为内参，使用ΔCT方法计算目的基因mRNA的相对表达量。

结果如图1所示，G-CSF动员后(B组，图1中由“Post-G”代表)T细胞PRDM1的mRNA水平相比健康人(A组，图1中由“Pre-G”代表)明显升高。2.在原代T细胞中过表达PRDM1后诱导出耐受样表型

在体外通过慢病毒在稳态T细胞中过表达PRDM1。

2.1T细胞的制备：

将从健康人骨髓血分离的CD3

2.2PRDM1过表达慢病毒感染T细胞

实验设置三个重复。

将2.1中制备的24孔T细胞培养液每孔培养体系浓缩至一半，每孔加入10-60μL(根据病毒滴度不同加量不同，病毒滴度范围为1-6×10^8TU/mL)的PRDM1过表达慢病毒载体(LV-PRDM1-3*flag-ZsGreen-PURO)，使得MOI达到30，然后加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg/ml；培养24h后换IMDM+10％9500BIT+IL-2(100U/ml)液。

加入病毒48h后，通过流式细胞仪检测荧光标记的慢病毒载体感染效率。在使用PRDM1过表达慢病毒载体感染T细胞的同时，使用不含PRDM1基因的慢病毒空载体LV-ZsGreen-PURO(图2中由LV-Control代表)感染相同培养条件下的T细胞，用作对照进行感染效率分析。实验结果如图2中A所示，通过流式圈门进一步分析证明慢病毒载体成功感染了原代CD3

使用步骤1中的qPCR检测方法验证了感染慢病毒后T细胞的PRDM1的过表达水平，结果如图2中B所示，未感染慢病毒的T细胞(图2中由Non-infection代表)与感染慢病毒空载体的T细胞(图2中由LV-Control代表)的PRDM1基因表达水平无差异；感染PRDM1过表达慢病毒的T细胞(图2中由LV-PRDM1代表)的PRDM1基因表达水平极显著高于感染慢病毒空载体的T细胞(LV-Control)，说明感染PRDM1过表达慢病毒上调了CD3

使用流式细胞术检测T细胞表型：在室温下使用PBS洗涤培养的细胞后重悬T细胞于PBS中，使用流式抗体避光孵育20分钟进行表面CD4-Percp-Cy5.5，CD25-APC染色。使用固定/穿孔试剂盒(BD Bioscience)对T细胞进行固定30分钟后加入单克隆抗体FoxP3-PE或Ki-67-PE染色(单克隆抗体和固定液均购于BD公司)，并在室温下孵育20分钟。PBS洗涤并上机检测。结果显示与空载病毒感染的T细胞对照(LV-Control)相比，感染PRDM1过表达慢病毒的T细胞(LV-PRDM1)中的Ki-67的表达有下降趋势(图2中C所示)，表明T细胞过表达PRDM1后增殖能力下降。

使用流式细胞术检测细胞因子：将CD3

3.体外利用siRNA在T细胞中敲降PRDM1

为了进一步探讨PRDM1在人T细胞中的功能，使用不同浓度的siRNA处理了G-CSF动员后的T细胞(步骤1中B组骨髓血分离制备的T细胞)，并对处理后的T细胞中中PRDM1的表达水平使用定量qPCR进行了检测，结果显示，与经无功能siRNA(NC-siRNA)处理的T细胞对照组(图3中由“scramble”代表)相比，处理siRNA浓度为75nM(图3的A中由“75nM”所示)时，PRDM1的水平下降明显(图3中A)。此外，与经无功能siRNA(NC-siRNA)处理的T细胞对照组(图3的B和C中由“scramble”代表)相比，由siRNA处理引起的T细胞中PRDM1的低表达(图3的B和C中“PRDM1”所示)导致了T细胞中Treg的比例下降以及分泌IL-4的能力的减低(图3中B-C)。因此，通过siRNA敲低G-CSF诱导的耐受态T细胞中PRDM1的水平后，T细胞中Treg细胞的比例以及IL-4的分泌下降。

4.PRDM1通过下调CCND2抑制T细胞的增殖能力

步骤2中结果表明T细胞过表达PRDM1后增殖能力的下降，为了探索PRDM1抑制T细胞增殖的作用机制，在Jurkat细胞中也使用步骤2.2中的PRDM1过表达慢病毒载体(LV-PRDM1-3*flag-ZsGreen-PURO)稳定过表达了PRDM1(感染效率大于95％，图4中A)，并且通过qPCR验证了PRDM1过表达效率，结果显示感染PRDM1过表达慢病毒的Jurkat细胞(图4的B中由LV-PRDM1代表)的PRDM1基因表达水平极显著高于感染慢病毒空载体的Jurkat细胞(图4的B中LV-Control)。通过使用Ki67/DAPI染色后进行流式检测，将细胞周期分为G0，G1和S/G2/M期，结果显示高表达PRDM1的Jurkat细胞(图4的C和D中由LV-PRDM1代表)中处于S/G2/M期的细胞比例与对照组(图4的C和D中由LV-Control代表)相比明显降低(图4中C-D)；我们还发现CCND2基因mRNA表达水平的下降(图4中E)，其活性是细胞周期由G1期进入S期所必需的。

5.PRDM1的表达对FOXP3表达的影响

通过对步骤4中制备得到的过表达PRDM1的Jurkat细胞使用qPCR进行FOXP3表达水平的检测。结果如图5所示，高表达PRDM1的Jurkat细胞(图5的A中由“OE”代表)中FOXP3的mRNA和蛋白水平明显高于感染慢病毒空载体的Jurkat细胞对照组(图5的A中由“CT”代表)。

6.PRDM1的低表达与GVHD的发生相关

上述结果均显示PRDM1的表达对诱导T细胞耐受具有调控作用，收集移植后患有GVHD的患者(C-GVHD组)(n＝7)与同期移植后未发生GVHD患者(C-CK组)(n＝7)的外周血标本，并通过qPCR对患者CD3

通过进一步探究造血干细胞移植后患者GVHD的发生与其供者骨髓T细胞中PRDM1的表达水平的相关性，结果显示与未发生GVHD病人的供者在G-CSF动员后CD4

基于此，本发明提供了一种检测受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的装置。该所述装置包括：

A1)数据获取模块：用于读取受检者T细胞中PRDM1基因表达的数据；

A2)数据选择模块：用于读取健康人T细胞中PRDM1基因表达的数据；

A3)数据分析模块：用于统计分析A1)所述数据与A2)所述数据的差异显著性；

A4)结果输出模块：根据所述差异显著性，输出所述受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病的结果为0或1，所述1代表所述受检者发生移植物抗宿主病或即将发生移植物抗宿主病；所述0代表述受检者未发生移植物抗宿主病或不会即将发生移植物抗宿主病。

上述装置中，A1)所述数据显著或极显著低于A2)所述数据，A4)所述结果输出模块的结果为1；A1)所述数据与A2)所述数据之间不存在显著差异或A1)所述数据显著高于A2)所述数据，A4)所述结果输出模块的结果为0。

上述装置中，A1)和/或A2)中所述数据通过荧光定量PCR检测获得。

上述装置中，A2)中所述数据可来源于已有数据库。

上述装置中，A1)和/或A2)中所述T细胞来源于受检者和/或健康人的外周血。

上述装置中，所述受检者为急性白血病造血干细胞移植后患者或进行造血干细胞移植前提供造血干细胞的经过G-CSF处理后的健康供者。

上述的装置中，所述的健康人可为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者或经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者的造血干细胞的健康人供者，所述健康供者经过G-CSF处理。

上述的装置中，当上述受检者为经造血干细胞移植后的急性白血病患者时，上述健康人为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者。当上述受检者为进行造血干细胞移植前提供病造血干细胞的经过G-CSF处理后的健康供者时，所述健康人为经造血干细胞移植后未发生GVHD的急性白血病患者的造血干细胞的健康供者，所述健康供者经过G-CSF处理。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。