一种Rhizopus oryzae绝对定量的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种Rhizopus oryzae绝对定量的引物、探针及试剂盒，属于生物领域、食品领域、检测领域。

背景技术

Rhizopus oryzae广泛存在于食品中，尤其是传统发酵食品，参与发酵过程中的生物反应过程包括白酒、普洱茶等。例如在白酒发酵过程中，Rhizopus oryzae可以分泌多种淀粉酶、蛋白酶，作用于淀粉和蛋白的水解，对乙醇以及风味成分的代谢至关重要。因此实时有必要跟踪Rhizopus oryzae的生物量，对判断发酵批次稳定性以及发酵参数调控具有重要的指导意义。但目前传统发酵食品体系多数是多菌种共发酵体系，通过简单的OD比色法无法判断样本中Rhizopus oryzae的含量，虽然荧光定量PCR法结合特异性引物或探针可以实现混菌系统中Rhizopus oryzae的定量，但是需要高额的设备和高要求的操作环境。因此，为方便、快速、准确地跟踪样本中Rhizopus oryzae的生长变化趋势，有必要开发相应的Rhizopus oryzae定量方法以及试剂盒。

G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。

目前，发明人团队在前期研究中已针对Pichia kudriavzevii、Lactobacillusacetotolerans、Lactobacillus jinshani、Zygosaccharomyces bailii、Aspergillustubingensis、Schizosaccharomyces pombe设计了基于G四链体/血红素模拟酶活性检测原理的微生物定量方法，但是针对Rhizopus oryzae的定量方法尚未被开发。其中困难性主要体现在两个方面：①无可用特异性序列用于区分目标物种和其他进化关系相近的物种；②Rhizopus oryzae在菌株的种类上存在多样性，目前NCBI已报道45个菌株，在种间特异性序列寻找中，如何保证序列在种内的覆盖度，是开发具有普适性Rhizopus oryzae定量方法的关键。

发明内容

本发明的一种用于Rhizopus oryzae绝对定量的探针、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)目前不存在已报道的Rhizopus oryzae的特异性序列；(2)现有的方法无法实现所有Rhizopus oryzae的总量检测；(3)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(4)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(5)现有定量方法操作繁琐等。

本发明的第一个目的是提供一组引物对，包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

基于该引物对，设计了探针一组种间高特异性、种内高覆盖度的探针，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQ ID NO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC)。

在一种实施方式中，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示(GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA)。

本发明的第二个目的是提供Rhizopus oryzae定量方法，所述方法包括使用本发明的引物对或探针。

所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针(序列如SEQ IDNO.1)，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针(序列如SEQ ID NO.2)与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征Rhizopus oryzae的生物量。

在一种实施方式中，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性(或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，比如催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+后溶液在波长420nm下的吸光值)与Rhizopus oryzae的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性代入标准曲线，即获得待测样品中的Rhizopus oryzae的生物量。

在一种实施方式中，所述方法为相对定量方法，还包括：检测多个样品，根据不同样本检测得到的过氧化氢酶活性的相对比值确定该多个不同样本中Rhizopus oryzae的生物量的相对值。

在一种实施方式中，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。

在一种实施方式中，所述样品为食品或者取自食品生产过程中的样品或环境样本。

在一种实施方式中，所述食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品、蜜饯、水产品、饮料、糖果、饼干、方便面等；所述环境样本选自肠道、土壤、水体等。

在一种实施方式中，所述待测样品中DNA发生解链，是采用高温方式进行。可选地，是将待测样品在高于90℃温度下处理。可以是金属浴、水浴、烘箱、保温仪等任意一种能提供对应温度的环境。

在一种实施方式中，所述解链是在缓冲液中进行。可选地，所述缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH

在一种实施方式中，所述过量是指，加入量高于能与待测样本的目标核苷酸片段全部结合形成双链时所需要的信号探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。

在一种实施方式中，所述过量是指，超过10

在一种实施方式中，所述信号探针与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，是在50-60℃温度范围下进行的。

在一种实施方式中，所述足量是指，加入量足以与全部未结合的信号探针形成双链时所需要的淬灭探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。

在一种实施方式中，所述足量是指，信号探针的双倍量。

在一种实施方式中，所述加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，是在能使淬灭探针与未结合的信号探针形成双链的温度下进行；本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定。

在一种实施方式中，所述利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征Rhizopus oryzae的生物量，是指在体系中加入血红素反应后，再加入ABTS和H

在一种实施方式中，所述吸光值是在波长420nm下的吸光值。

在一种实施方式中，所述定量方法，具体是：

(1)待测样品进行DNA解链处理；

(2)加入信号探针，于55℃反应30min；

(3)加入淬灭探针，于55℃反应30min；

(4)加入血红素，于37℃反应30min；

(5)加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和H

(6)检测反应物在波长420nm下的吸光值；

(7)结合吸光值对样品中Rhizopus oryzae进行定量。

在一种实施方式中，所述定量方法，还包括：配置不同已知Rhizopus oryzae含量的样品，测定不同样品经上述方法处理后得到的吸光值；绘制吸光值与不同Rhizopusoryzae含量的标准曲线；将待测样品经经上述方法处理后得到的吸光值代入标准曲线，即获得待测样品中Rhizopus oryzae含量。

本发明的第三个目的是提供一种用于Rhizopus oryzae绝对定量的检测试剂盒，含有本发明的引物对，或者序列如SEQ ID NO.1的信号探针。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有序列如SEQ ID NO.2的淬灭探针。

在一种实施方式中，所述检测试剂盒还含有如下任意一种或多种：血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H

在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH

在一种实施方式中，所述检测试剂盒是Rhizopus oryzae绝对定量试剂盒，所述试剂盒同时包括四种试剂(试剂1，试剂2，试剂3，试剂4)和一套Rhizopus oryzae定量探针(信号探针，淬灭探针)；所述的试剂1包括血红素；所述的试剂2包括缓冲液(Tris-HCl，KCl，pH＝7.9；其中KCl可替换为NH

在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，试剂或探针可以是液体状态或者固体状态，使用时本领域技术人员可以常规地调整到适合的浓度。

本发明的第四个目的是提供所述试剂盒的使用方法。

在一种实施方式中，所述使用方法包括：在DNA解链的待测样本中加入过量的信号探针反应一段时间，使信号探针与待测样本中的目标片段结合；然后在加入足量淬灭探针使之与未结合的信号探针的形成双链；再加入血红素，反应一段时间后加入ABTS和H

在一种实施方式中，所述方法包括，将试剂和探针调整到适合使用的浓度。

(1)待测样品进行DNA解链处理；(2)加入信号探针，于55℃反应30min；(3)加入淬灭探针，于55℃反应30min；(4)加入血红素，于37℃反应30min；(5)加入2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和H

本发明的第五个目的是提供所述试剂盒在Rhizopus oryzae定量中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于食品技术领域或环境领域；可选地，所述食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品、蜜饯、水产品、饮料、糖果、饼干、方便面等；环境样本选自肠道、土壤、水体等。

在一种实施方式中，所述应用时，待测样本可以为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为食品成品或者取自食品生产过程中的样品或环境样本；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。

有益效果：

本发明将G四链体与特异性性序列结合形成信号探针，信号探针与目标序列结合使得G四链体裸漏在序列之外，加入足量淬灭探针与未反应信号探针形成双链，破坏G四链体结构，通过与血红素反应形成G四链体/血红素模拟酶，表现出过氧化氢酶活性，以过氧化氢酶活性表征微生物的生物量。本发明的Rhizopus oryzae定量探针，能够实现Rhizopusoryzae的总量检测；进一步地，对信号探针进行优化，信号探针序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针为

GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。与SEQ ID NO.3的信号序列相比，SEQID NO.1的信号探针中G四链体序列不与特异性序列产生额外的空间结构(图1)，检测的准确性更高、最低检出限改善。

本发明的探针用于检测和Rhizopus oryzae定量时，不需要昂贵仪器的检测流程。还首次提供一种用于微生物绝对定量试剂盒，可在2.5h内完成定量工作。本发明为避免使用高额设备，如PCR仪，通过信号探针和淬灭探针组合的方式实现微生物定量。本发明解决了目前的微生物定量手段均依赖较昂贵的仪器，在实际用于过程中十分受限制的问题。

进一步，本发明能够实现快速Rhizopus oryzae检测，样品不必须进行核酸提取，仅需要将样本中的微生物洗脱于缓冲液中，直接进行后续实验。同时，与荧光定量PCR定量结果相比，本发明所得到的定量结果无显著性差异。

综上，基于本发明所提供的探针及检测试剂盒，用于Rhizopus oryzae定量，具有快速、便宜、准确的特点。

附图说明

图1：信号探针二聚体结构。(A)SEQ ID NO.1的G四链体序列不与特异性序列自成环；(B)已报道的SEQ ID NO.3用于微生物定量的G四链体序列与特异性序列自成环.

图2：Rhizopus oryzae探针的特异性。

图3：基于基因组提取的Rhizopus oryzae定量探针的标准曲线。

图4：基于不提取样本基因组的Rhizopus oryzae定量探针的标准曲线。

图5：qPCR标准曲线。

图6：比较基于基因组提取的Rhizopus oryzae探针定量实验、基于不提取样本基因组的Rhizopus oryzae探针定量实验和qPCR Rhizopus oryzae定量实验；其中，(A)基于不提取样本基因组的Rhizopus oryzae探针定量实验，(B)基于基因组提取的Rhizopusoryzae探针定量实验，(C)qPCR Rhizopus oryzae定量实验。

图7：比较基于SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2的探针(A)和SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4探针(B)的检测结果的稳定性。

具体实施方式：

实施例1：基于保守看家基因的Rhizopus oryzae特异性片段的筛选

为开发种间高特异性以及种内高覆盖度的特异性片段，本发明首先选择高覆盖度的marker基因序列中筛选特异性片段，包括26S、ITS、18S，通过同源比对结果如表1所示，Rhizopus oryzae和Rhizopus属其他物种看家基因的相似度极高(相似度高于99％)，无法实现特异性片段的筛选。

表1 Rhizopus oryzae看家基因与其他物种种间相似性

实施例2：基于比较基因组学的Rhizopus oryzae特异性片段的筛选

(1)特异性基因的筛选

收集NCBI收录的Rhizopus基因组信息98个，包括Rhizopus oryzae在内的5个物种。通过基因预测、相似度同源聚类，获得10,608条Rhizopus oryzae特异性基因。

(2)特异基因中种间特异性和种内覆盖度片段的筛选

从10,608条特异性基因中设计出10,102对特异性引物。对10,102对特异性引物的特异性以及覆盖度分别进行计算、筛选。经过大量的筛选，最终获得了Rhizopus oryzae种内覆盖度最高的特异性引物，如表2所示，其特异性和覆盖度均为100％，该引物序列(SEQID NO.5、SEQ ID NO.6)可作为Rhizopus oryzae特异性片段，用于信号探针试剂和淬灭探针的构建。

表2 Rhizopus oryzae特异性引物信息

实施例3：Rhizopus oryzae定量探针组合试剂

探针组合试剂；含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示的。

信号探针试剂和淬灭探针试剂，为干粉或者液体状；为干粉时，可以在实验之前稀释到合适的浓度，比如，使用无菌水或者缓冲液稀释至浓度为20μM；为液体状时，浓度可以是20-200μM，试剂使用前可以进行稀释，或者直接使用。

实施例4：Rhizopus oryzae定量试剂盒及其使用

Rhizopus oryzae定量试剂盒，含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示。

该试剂盒使用时，可以与血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、H

使用方法是：

(1)溶液配置。配置100nM的血红素溶液(试剂1)；配置终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9(试剂2)；7mM的2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(试剂3)以及7mM的H

(2)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2加入4μL的样本基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(3)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链。淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(4)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1，37℃处理30min。

(5)显色反应。向(4)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4，37℃处理30min，进行显示反应(绿色)。

检测反应物在波长420nm下的吸光值；结合吸光值对样品中Rhizopus oryzae进行定量。

当然，在进行绝对定量时，可以自行绘制吸光值与Rhizopus oryzae生物量的标准曲线，或者根据试剂盒推荐的使用方法和标准曲线直接换算得到Rhizopus oryzae的生物量。

实施例5：Rhizopus oryzae定量试剂盒

Rhizopus oryzae定量试剂盒，含有独立包装的信号探针试剂和淬灭探针试剂；其中，信号探针序列如SEQ ID NO.1所示的，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示。

该试剂盒中还含有100nM的血红素溶液(试剂1)、Tris-HCL缓冲液、7mM的2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、7mM的H

实施例6：Rhizopus oryzae定量试剂盒的特异性

(1)选择来源于发酵谷物中的Rhizopus oryzae作为阳性对照，选择发酵食品样本中广泛存在的36个细菌种微生物和6个真菌种微生物作为阴性对照，细菌微生物分别为Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcusacidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacilluscurvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissellaviridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostoc pseudomesenteroides,Enterococcus italicus,Enterococcus lactis,Enterococcus faecalis,Bacillus coagulans,Bacillus licheniformis,Bacillustequilensis,Bacillus subtilis,Bacillus velezensis,Acetobacter pasteurianus,Enterococcus faecium。真菌微生物分别为Saccharomyces cerevisiae，Mucorrouxianus，Schizosaccharomyces pombe，Zygosaccharomyces bailii，Pichiakudriavzevii，Saccharomycopsis fibuligera。

(2)以上微生物选择不同的培养基进行培养，其中Lactobacillus buchneri,Lactobacillus dioilvorans,Lactobacillus brevis,Lactobacillus crustorum,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus harbinensis,Lactobacillus acidiliscis,Pediococcus ethanolidurans,Pediococcus acidilactici,Pediococcus pentosaceus,Lactobacillus murinus,Lactobacillus curvatus,Lactobacillus casei,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus panis,Lactobacillus fermentum,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus delbrueckii,Lactococcus lactis,Weissella confusa,Weissella paramesenteroides,Weissella viridescens,Leuconostoc citreum,Leuconostoc lactis,Leuconostoc mesenteroides,Leuconostocpseudomesenteroides使用MRS培养基，培养基配方为胰蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏8.0g/L，酵母提取物4.0g/L，葡萄糖18.0g/L，无水山梨醇油酸酯0.8mL/L，K

(3)单菌基因组提取。上述菌液在12000rpm条件下处理2min，收集沉淀。43种微生物纯培养物的基因组使用基因抽提试剂盒DNeasy Tissue Kit提取。

(4)探针选择为Rhizopus oryzae特异性探针，信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(5)信号探针与样本DNA形成双链。分别向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同微生物的基因组DNA，于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

实施例7：定量方法准确性评估

(1)Rhizopus oryzae菌液根据实施例6中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例6。

(2)通过10倍梯度稀释Rhizopus oryzae基因组DNA。

(3)使用Rhizopus oryzae的探针，以不同浓度的Rhizopus oryzae基因组DNA进行显色反应。信号探针的序列为GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(4)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL不同稀释度的基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(8)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图3所示，R

实施例8：葡萄酒样本中Rhizopus oryzae的定量实验

(1)参考Gayevskiy,V.,＆Goddard,M.(2012).Geographic delineations ofyeast communities and populations associated with vines and wines in NewZealand.ISME J,6(7),1281-1290.的Materials and methods方法，样本采集于山东烟台某知名葡萄酒生产厂家。基因组浓度为658.39ng/μL。(2)使用Rhizopus oryzae的探针进行显色反应。信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(4)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL样本宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(7mM H

(8)根据实施例7所得的标准曲线，计算得样本中Rhizopus oryzae总量为0log

实施例9：酒醅样本中Rhizopus oryzae的绝对定量

(1)参考Song Z W,Du H,Zhang Y,Xu Y.Unraveling core functionalmicrobiota in traditional solid-state fermentation by high-throughputamplicons and metatranscriptomics sequencing.Frontiers in microbiology 2017；8:1294的MATERIALS AND METHODS中的方法，提取来源于山东省的酒醅样本中的宏基因组，基因组浓度为100.02ng/μL。

(2)使用Rhizopus oryzae的探针进行显色反应。信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(3)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酒醅宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(4)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(3)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(5)形成血红素/G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(6)显色反应。向(5)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(7)根据实施例7所得的标准曲线，计算得样本中Rhizopus oryzae的微生物总量为5.32log

(8)通过荧光定量法(定量步骤和材料同实施例13(6))对上述同一酒醅样本中的Rhizopus oryzae进行定量，结果显示Rhizopus oryzae的微生物总量为5.41log

实施例10：基于不提取样本基因组的Rhizopus oryzae绝对定量方法

(1)Rhizopus oryzae菌液根据实施例4中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定。

(2)通过10倍梯度稀释(1)中的Rhizopus oryzae菌液

(3)使用Rhizopus oryzae的探针进行显色反应。信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(4)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL不同稀释度的菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水浴中处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(5)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(4)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(6)形成血红素/G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(7)显色反应。向(6)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(8)通过计算吸光值与菌液浓度之间的线性关系构建标准曲线，如图4所示，R

实施例11：基于不提取样本基因组的微生物绝对定量方法测定葡萄酒样本中Rhizopus oryzae的含量

(1)样本采集于山东烟台某知名葡萄酒生产厂家，样本处理方法如下：1mL样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。

(2)洗涤。向(1)中所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。

(3)菌体重悬，将向(2)中所获得的菌体中加入1mL试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)，吹吸混匀。

(4)使用Rhizopus oryzae的探针进行显色反应。信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(5)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL葡萄发酵菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水水浴下处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(9)根据实施例10所得的标准曲线，计算得样本中Rhizopus oryzae总量为0log

(10)通过荧光定量PCR(定量步骤和材料同实施例13(6))对上述同一样本中的Rhizopus oryzae进行定量，结果显示Rhizopus oryzae总量为0log

实施例12：基于不提取样本基因组的绝对定量方法测定酒醅样本中Rhizopusoryzae的含量(1)样本来源于山东某酒厂的发酵酒醅，样本处理方法如下：1g样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。

(2)洗涤。向(1)中所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。

(3)菌体重悬，将向(2)中所获得的菌体中加入1mL试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)，吹吸混匀。

(4)使用Rhizopus oryzae的探针进行显色反应。信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(5)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL酒醅菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水水浴下处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(9)根据实施例10所得的标准曲线，计算得样本中Rhizopus oryzae总量为5.39log

(10)通过荧光定量PCR(定量步骤和材料同实施例13(6))对上述同一样本中的Rhizopus oryzae进行定量，结果显示Rhizopus oryzae总量为5.41log

实施例13：微生物定量检测试剂盒与荧光定量PCR检测的结果比较

(1)样本选择来自山东某酒厂发酵终点的三个白酒酒醅样本。

(2)样本处理：

(i)提取三个样本中的总基因组，基因组浓度分别为369ng/μL、590ng/μL、321.89ng/μL。

(ii)1g样本中加入5mL磷酸缓冲液，3000×g离心10min收集菌体。向所获得的菌体中加入5mL磷酸缓冲液，12000×g离心2min收集菌体，重复一次。菌体重悬，将向所获得的菌体中加入1mL试剂2缓冲液，吹吸混匀。

(3)使用Rhizopus oryzae的探针进行显色反应。信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。

(4)基于不提取基因组的试剂盒定量方法测定。

(i)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入10μL酒醅菌液(不加样本菌液为空白对照)。于沸水浴中处理20min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(ii)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(i)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(iii)形成血红素/G四链体结构。向(ii)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100mM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(iv)显色反应。向(iii)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(v)根据实施例8所得的标准曲线，计算得样本中Rhizopus oryzae总量为5.64±0.047log

(5)基于提基因组的试剂盒定量方法测定

(i)信号探针与样本DNA形成双链。向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL酒醅宏基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。加入4μL 20μM的信号探针之后于55℃下反应30min。

(ii)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(i)步骤反应之后的体系中加入8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(iii)形成血红素/G四链体结构。向(ii)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(iv)显色反应。向(5)反应结束的体系中加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(v)根据实施例5所得的标准曲线，计算得样本中Rhizopus oryzae总量为5.54±0.10log

(6)qPCR定量样本中Rhizopus oryzae含量(i)Rhizopus oryzae菌液根据实施例6中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，基因组的提取同实施例6。

(ii)通过10倍梯度稀释Rhizopus oryzae基因组DNA。

(iii)qPCR的体系为SYBR Green 10μL，上下游引物20μM，模板DNA 0.5μL，无菌水补齐20μL。

(iv)qPCR的反应程序：预变性95℃5min，循环阶段：95℃5s，60℃20s；循环数40，溶解曲线从65℃升温到95℃，每5s升高0.5℃。

(v)使用Rhizopus oryzae特异性引物对提取的基因组进行qPCR，引物序列上游序列为AAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.5)，下游序列为TTGCAAGCTATTTGCATTTTT(SEQ IDNO.6)。

(vi)通过10倍梯度稀释基因组DNA，建立CT值与Rhizopus oryzae菌浓的标准曲线，如图4所示，R

(vii)qPCR体系和反应条件同(iii)，(iv)。根据反应结束的CT值，通过所建立的标准曲线计算Rhizopus oryzae在样本中的浓度为5.42±0.12log

(7)通过显著性差异分析，结果如图6所示，三种定量方法之间无显著性差异(P<0.05)

实施例14：应用两种不同序列信号探针进行检测的检出限

(1)Rhizopus oryzae菌液根据实施例4中的培养方法获得，微生物菌浓通过平板计数法测定，浓度为7.49log10 CFU/mL基因组的提取同实施例4。

(2)通过10倍梯度稀释Rhizopus oryzae基因组DNA，得到log10 CFU/mL的DNA模板。

(3)本发明所提供的Rhizopus oryzae信号探针的序列为

GGGTGGGTGGGTGGGTAAGGCATAAAACTCTTCC(SEQ ID NO.1)，淬灭探针的序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTACCCA(SEQ ID NO.2)。加入(2)中得到的3.2log

(4)利用Rhizopus oryzae信号探针序列为(SEQ ID NO.3)GGGATTGGGATTGGGATTGGGAAGGCATAAAACTCTTCC，淬灭探针序列为GGAAGAGTTTTATGCCTTCCCAA(SEQ ID NO.4)。加入(2)中得到的log10 CFU/mL Rhizopusoryzae基因组DNA进行显色反应。

(5)信号探针与样本DNA形成双链。将向2mL的试剂2(包括终浓度为50mM的Tris-HCL，终浓度为50mM的KCl，最终pH为7.9)加入4μL Rhizopus oryzae基因组DNA(不加样本DNA为空白对照)。于90℃下水浴处理10min。分别加入4μL 20μM的不同信号探针之后于55℃下反应30min。

(6)淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构。向(5)步骤反应之后的体系中加入分别8μL 20μM的淬灭探针，55℃下反应30min。

(7)形成血红素/G四链体结构。向(6)步骤反应之后的体系中加入终浓度为100nM的试剂1(血红素)，37℃处理30min。

(8)显色反应。向(7)反应结束的体系中分别加入终浓度为7mM的试剂3(ABTS)和终浓度为7mM的试剂4(H

(9)重复(5)(6)(7)(8)步骤9次，比较检测结果的稳定性，如图7所示。基于SEQ IDNO.3的信号序列定量结果的变异系数(CV)为0.87；基于SEQ ID NO.1的信号序列的定量结果变异系数为0.07，检测效果稳定。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种Rhizopus oryzae绝对定量的引物、探针及试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggtgggtgg gtgggtaagg cataaaactc ttcc 34

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggaagagttt tatgccttac cca 23

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gggattggga ttgggattgg gaaggcataa aactcttcc 39

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggaagagttt tatgccttcc caa 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aaggcataaa actcttcc 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ttgcaagcta tttgcatttt t 21