一种木霉菌厚垣孢子的生产方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种木霉菌厚垣孢子的生产方法。

背景技术

由于化学农药和化肥过量使用导致的农业面源污染对生态环境和农业可持 续发展的威胁，生物防治技术逐渐受到重视。木霉菌作为国际上普遍应用的植物 病害生物防治真菌，已经成为生物农药和生物肥料开发的重要资源微生物。但是 作为活性生物制剂，木霉菌生物农药和生物肥料的稳定性和货架期是制约其应用 的重要因素。

厚垣孢子是木霉菌在不利环境下形成的抗逆性强的生存结构，通过适当的发 酵条件诱导木霉产生厚垣孢子是生产货架期长、实际施用效果稳定的木霉菌制剂 的重要途径。Agosin等(1997)报道碳氮比例和pH值对于哈茨木霉厚垣孢子的 性状和货架期有重要影响，Yaqian Li等(2016)通过统计学方法优化培养基配比 实现了发酵液成品中4.5亿/ml的较高木霉孢子产量。但是厚垣孢子在逆境的诱 导下生成，但是碳源过于匮乏会影响形成厚垣孢子的菌丝质量，继而影响孢子的 活性和产量，目前木霉发酵工艺多为一次性加料，难以解决这一矛盾；另一方面 离心、过滤、干燥等分离方式不可避免的会造成孢子的损失损伤，如何从液体发 酵发酵液中有效分离并稳定厚垣孢子，在制剂过程中保持孢子活性也是技术难 点。液态发酵成规模制取厚垣孢子的报道罕见，受到如上技术问题和成本产量等因素的制约，成品也难以达到干燥后孢子粉成品一年货架期和每克两亿活孢子的 国家标准和大规模生产的市场要求。因此市场上至今木霉菌剂产品中仍以固体发 酵分生孢子为主，罕见成熟商品化的厚垣孢子产品。

CN1821383B公开了一种木霉菌属真菌通过液体深层通气发酵生产厚垣孢子 的发酵培养基配方及发酵工艺，通过调整培养基配方并控制发酵参数得到厚垣孢 子。该发明显著地缩短了木霉菌液体深层发酵产厚垣孢子的发酵周期，大幅度地 增加了产厚垣孢子发酵产率，大幅度地降低了木霉菌的发酵生产成本。同时，通 过该发明生产出的厚垣孢子比用传统方法生产的分生孢子具有更强的生活力和 抗逆能力，更适合于生产应用；CN1242056B公开了一种木霉菌厚垣孢子的生产 方法，利用从作物根表土壤分离获得的木霉菌，采用控制营养条件、添加形成厚 垣孢子促进剂，调节温度、pH值、接菌量、供氧量及搅拌速度等技术参数控制 发酵条件使其产生厚垣孢子，首先将取自作物根际的木霉菌纯化后转移至试管斜 面内作母菌种，然后在三角瓶内振荡培养为液体菌种，再经生产罐发酵制成厚垣 孢子悬浮液。本发明所得的厚垣孢子具有寿命长、防效高、耐储存等优点，其制 剂比分生孢子制剂可提高商品货价期一年以上。但是，该类方法仍然为一次性加 料，不能满足碳源发酵过程中的碳源匮乏，从而会影响形成厚垣孢子的菌丝质量， 继而影响孢子的活性和产量。

总之，科学合理的多次补料分段发酵控制和经济减损的孢子分离制剂方式是 大规模商业化生成木霉厚垣孢子的关键突破口。

发明内容

本发明的目的在于提出一种木霉菌厚垣孢子的生产方法，利用搅拌式液体发 酵方式实现了大规模发酵生产哈茨木霉厚垣孢子。针对木霉菌生长特性，通过合 理控制发酵条件和适时补料，诱导木霉菌高产厚垣孢子。通过前期补料，提供充 足的快速碳源和氮源，促进木霉高速生长，并逐渐消耗罐内营养形成诱导木霉生 成厚垣孢子的发酵环境。中期通过补加黄腐酸钾和玉米淀粉，调控发酵环境，一 方面促进菌丝浓缩形成孢子，另一方面保持一定养分提高厚垣孢子质量。另外， 本发明还包括将成熟发酵液中提取稳定厚垣孢子的方法，即以硅藻土和二氧化硅 (白炭黑)为固体载体和助滤剂，与发酵液混合后采用板框压滤法分离发酵液清 液和孢子为主的固体组分，清液富含木霉代谢产物有液体肥原料等用途；滤饼循 环烘干后粉碎，减少分离干燥过程中对孢子的损伤，制得高活性孢子粉。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种木霉菌厚垣孢子的生产方法，将哈茨木霉菌菌种活化后接 种在一级种子罐进行种子扩增，当pH值降低至2-3时，移种到二级种子罐进 一步发酵扩增，当pH值降低至2-3时移种到生产发酵设备中进行分段发酵， 当pH值降低至2-3时，第一次补料，然后补碱，控制pH值增加至5-7，待发 酵罐内pH值再次降低到2-3时加补碱稳定后续发酵过程在pH值3-4，观察， 厚垣孢子开始形成时，第二次补料，发酵到厚垣孢子成熟，出罐，后处理， 得到木霉菌厚垣孢子。

作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

S1.菌株维持和种子液培养：在洁净环境下无菌操作，将哈茨木霉菌株在 土豆葡萄糖琼脂平板上维持，在长满菌体的平板上打孔取菌栓接种于土豆葡 萄糖培养液中培养，接种于种子罐进行一级发酵；

S2.一级发酵：将步骤S1得到的菌液倒入玉米粉培养液中接种发酵，接种 后监控罐内pH值，当pH值降低至2-3时，移种到扩增罐进行二级发酵罐；

S3.二级发酵：将步骤S2得到的菌液倒入玉米粉培养液中接种发酵，接 种后监控罐内pH值，当pH值降低至2-3时，移种到生产发酵罐进行三级发 酵罐；

S4.三级发酵：接种后罐内pH值降低稳定在2-3时，进行第一次补料， 添加1％w/v的葡萄糖，补料后开启补碱，通过加入浓氨水调解罐内pH值到 5-7，当罐内pH值再次降低稳定在2-3时，通过补浓氨水维持pH值在3.0-3.5， 通过镜检观察菌丝末端开始隆起肿大，厚垣孢子开始形成时，添加0.3-0.8％w/v 的黄腐酸钾和0.2-0.5％w/v的玉米淀粉，继续发酵，若pH值下降至3.5以下 开启补碱补入浓氨水控制pH值在3.0-3.5，通过镜检观察大部分菌丝消失，孢 子脱落，厚垣孢子成熟，降温到20℃以下，准备出罐；

S5.出罐准备：继续搅拌，出罐前取样测定发酵液cfu；

S6.固体载体压滤分离：向罐中加入白炭黑和硅藻土，搅拌均匀后罐内加 压压入压滤机，待滤液不再大量流出，关闭加料阀，缓慢加压压滤，控制压 滤水压压力不超过0.12mPa，压滤后滤饼含水量在60-70％；

S7.干燥制剂：将滤饼送入循环抽湿烘干房内低温烘干，破碎过筛得到原 料孢子粉，4℃冷藏保存。

作为本发明的进一步改进，所述玉米粉培养液配方为：玉米粉60g/L、氯 化钠1g/L、硝酸钠1.42g/L、磷酸二氢钾3.82g/L、硫酸铵1.1g/L、七水合硫酸 镁0.5g/L、七水合硫酸锌0.002g/L、七水合硫酸亚铁0.0075g/L、一水合硫酸 锰0.0025g/L，余量为去离子水；处理方法为：灭菌后冷却到28-30℃后预备 接受移种。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述培养条件为：转速为100-200rpm， 温度为25-30℃，培养时间为40-50h。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述发酵条件为：发酵温度为 26-30℃，通气量为0.05-0.15m

作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述步骤S2中所述发酵条件为：发 酵温度为26-30℃，通气量为0.05-0.15m

作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述发酵条件为：发酵温度为 26-30℃，通气量为50-70m

作为本发明的进一步改进，所述浓氨水的浓度为20％w/w；所述1％w/v的 葡萄糖的制备方法为：将100kg葡萄糖溶解于约1kL的水中，115℃灭菌30min， 冷却到30℃以下，备用；所述0.3-0.8％w/v的黄腐酸钾和0.2-0.5％w/v的玉米 淀粉的制备方法为：30-80kg黄腐酸钾和20-50kg玉米淀粉，溶解于1kL水中， 121℃灭菌30min，冷却到30℃以下，备用。

作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述发酵液cfu在(1.5-2.5) ×10

作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述白炭黑的细度在1000-2000目之 间，所述硅藻土的细度在400-600目之间，所述硅藻土和所述白炭黑的质量比 在(2-5):1，载体总添加量为发酵液的5-12％w/v；所述压滤时所用滤布为 100-200目，加料和压滤压力控制在0.10±0.02mPa。

作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述孢子粉中孢子含量为(6-16) ×10

本发明具有如下有益效果：本方法通过多次补料分段发酵，克服了厚垣孢子 产量低的技术问题，规模发酵时发酵液中活孢子产量可以达到(1.5～2.5) ×10

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造 性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1生产发酵罐pH值和溶氧曲线图；

图2发酵过程中菌丝和孢子形态显微镜图片。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

培养基配比：

a)土豆葡萄糖培养液：

200g土豆的浸出液(200g土豆去皮切碎煮软后纱布过滤取清液)、20g葡萄 糖，加水定容为1L

土豆葡萄糖琼脂平板在上述的基础上再加入1.5％(15g/L)琼脂，灭菌121℃，25min。

b)玉米粉培养基，

发酵罐内混匀后121℃灭菌30min，灭菌后冷却到28℃接种，灭菌后pH值 在5.0。

S1.菌株维持和种子液培养：在洁净环境下无菌操作，哈茨木霉菌株在土豆 葡萄糖琼脂平板上维持。在长满菌体的平板上打孔取菌栓接种于500mL土豆葡 萄糖培养液，在28℃，120rpm摇床振荡培养48h，即可用于接种一级发酵罐(种 子罐)。

S2.一级发酵(种子罐)：在火焰掩护下向100L玉米粉培养液中倒入摇瓶中 的500ml菌液接种。发酵温度26-30℃，通气量为0.1m

S3.二级发酵(扩增罐)：二级发酵液体积为1kL，玉米粉培养液配方见(1)， 灭菌后冷却到28℃后预备接受移种。温度26℃，通气量为1m

S4.三级发酵(生产发酵罐)：三级发酵体积为10kL，加入玉米粉培养液，灭 菌后冷却到30℃后预备接受移种。通气量为60m

(1)发酵控制：

a)温度：发酵全程温度控制在26℃。

b)通气和转速控制：随着发酵进行溶氧会迅速降低到5％以下，因为本工艺 目的在于制取发酵停滞期的厚垣孢子，且哈茨木霉菌对于氧气限制环境耐受良 好，在提供充足氧气促进生长和对菌丝造成损伤的考虑中优先保护发酵中的菌丝 免于机械、氧化应激损伤，促进菌丝生物质积累形成壮实的厚垣孢子。因此，通 气量和搅拌转速以只减不增为原则；在第一次补料后，观察到罐内溶氧有回升时， 即可适当缓慢减少通气量和降低搅拌速度，在第二次补料时降至70rpm和42-48 m

c)pH值在发酵初期不控制，中期补充氨水控制pH值为3.0，后期罐内pH 值自然升高，不再控制pH值。

(2)发酵过程：

图1生产发酵罐pH值和溶氧曲线，①-⑤显示了主要发酵节点，依次为接种、 第一次补料(葡萄糖并加氨水调节pH值)、补氨水维持pH值、第二次补料(黄 腐酸钾和玉米淀粉)、发酵结束出罐，I-III表示发酵阶段。

a)接种后罐内pH值降低稳定在最低点时(pH值降到2)进行第一次补料(附 图1-②，接种后20h左右)，添加1％w/v的葡萄糖，为对数期生长的木霉菌提供 快速碳源并向罐内补水。将100kg葡萄糖溶解于约1kL的水中，115℃灭菌30min， 冷却到30℃以下补入三级发酵罐，补料中保持转速100rpm。补料后开启补碱， 通过加入20％的浓氨水调解罐内pH值到5，同时补充氮源。控制加碱速度不要 使pH值剧烈变化，变化速率小于0.2/min，加碱过程持续15min，同时保持转速 100rpm。

这一时期菌丝开始大量生长，补料后pH值会开始继续下降。当手动补料补 碱后罐内pH值再次降到低点稳定时(pH值降到2)后通过补氨水维持pH值在 3.0到第二次补料(附图1-③)。酸性环境抑制分生孢子产生，并促进哈茨木霉产 生厚垣孢子。继续监控溶氧变化，观察罐内溶氧上升则可适当降低转速和通气量， 直到降至70rpm和42m

b)三级发酵70h后，镜检可以看到菌丝旺盛生长(附图2,图2 为发酵过程中菌丝和孢子形态：A.67h B.100h C.154h D.190h(显微镜 照片，放大倍数100×)，此时厚垣孢子即将开始生成，准备进行第 二次补料(附图1-④)，0.5％的黄腐酸钾和0.3％的玉米淀粉，目的 是促进厚垣孢子形成并为孢子形成过程提供碳源，增加孢子产量。 50kg黄腐酸钾和30kg玉米淀粉，溶解于1kL水中，121℃灭菌30min。 灭菌后应注意避免通气冷却和搅拌，减少黄腐酸钾起泡。混合物灭菌 冷却到30℃以下，pH值为9，保持70rpm搅拌加入发酵罐。补料入 发酵罐内后罐内pH值会上升到4左右，随后pH值随着淀粉的利用 会略有下降。如果pH值降至3.5以下可以开启补碱补入氨水控制pH 值在3.0。

第二次补料后，每日随着溶氧回升逐渐下调通气量和转速，直到50rpm和 30m

S5.出罐准备：储罐暂储时应保持搅拌避免分层，出罐取样测定发酵液cfu， 可达到1.5×10

S6.固体载体压滤分离：向储罐发酵液中添加200kg的白炭黑和800kg的硅 藻土，搅拌均匀后罐内加压到0.1mPa压入装有200目滤布的压滤机。待滤液不 再大量流出，关闭加料阀，缓慢加压压滤，控制压滤水压压力不超过0.12mPa。 压滤后滤饼含水量在60％。

S7.干燥制剂：滤饼送入36℃循环抽湿烘干房内低温烘干至含水量<10％， 80目破碎过80目筛可得原料孢子粉，孢子粉中孢子6×10

实施例2

培养基配比：

a)土豆葡萄糖培养液：

200g土豆的浸出液(200g土豆去皮切碎煮软后纱布过滤取清液)、20g葡萄 糖，加水定容为1L

土豆葡萄糖琼脂平板在上述的基础上再加入1.5％(15g/L)琼脂，灭菌121℃，25min。

b)玉米粉培养基，

发酵罐内混匀后121℃灭菌30min，灭菌后冷却到30℃接种，灭菌后pH值 在5.3。

S1.菌株维持和种子液培养：在洁净环境下无菌操作，哈茨木霉菌株在土豆 葡萄糖琼脂平板上维持。在长满菌体的平板上打孔取菌栓接种于500mL土豆葡 萄糖培养液，在28℃，120rpm摇床振荡培养48h，即可用于接种一级发酵罐(种 子罐)。

S2.一级发酵(种子罐)：在火焰掩护下向100L玉米粉培养液中倒入摇瓶中 的500ml菌液接种。发酵温度30℃，通气量为0.1m

S3.二级发酵(扩增罐)：二级发酵液体积为1kL玉米粉培养液，灭菌后冷 却到30℃后预备接受移种。温度30℃，通气量为1m

S4.三级发酵(生产发酵罐)：三级发酵体积为10kL，加入玉米粉培养液，灭 菌后冷却到30℃后预备接受移种。通气量为60m

(1)发酵控制：

a)温度：发酵全程温度控制在30℃。

b)通气和转速控制：随着发酵进行溶氧会迅速降低到5％以下，在第一次补 料后，观察到罐内溶氧有回升时，即可适当缓慢减少通气量和降低搅拌速度，在 第二次补料时降至80rpm和48m

c)pH值在发酵初期不控制，中期补充氨水控制pH值为3.5，后期罐内pH 值自然升高，不再控制pH值。

(2)发酵过程：

a)接种后罐内pH值降低稳定在最低点时(pH值降到3)进行第一次补料(附 图1-②，接种后20h左右)，添加1％w/v的葡萄糖，为对数期生长的木霉菌提供 快速碳源并向罐内补水。将100kg葡萄糖溶解于约1kL的水中，115℃灭菌30min， 冷却到30℃以下补入三级发酵罐，补料中保持转速100rpm。补料后开启补碱， 通过加入20％的浓氨水调解罐内pH值到7，同时补充氮源。控制加碱速度不要 使pH值剧烈变化，变化速率小于0.2/min，加碱过程持续20min，同时保持转速 100rpm。

这一时期菌丝开始大量生长，补料后pH值会开始继续下降。当手动补料补 碱后罐内pH值再次降到低点稳定时(pH值降到3)后通过补氨水维持pH值在 3.5到第二次补料(附图1-③)。酸性环境抑制分生孢子产生，并促进哈茨木霉产 生厚垣孢子。继续监控溶氧变化，观察罐内溶氧上升则可适当降低转速和通气量， 直到降至80rpm和48m

b)三级发酵80h后，镜检可以看到菌丝旺盛生长(附图2)，此 时厚垣孢子即将开始生成，准备进行第二次补料(附图1-④)，0.5％ 的黄腐酸钾和0.3％的玉米淀粉，目的是促进厚垣孢子形成并为孢子 形成过程提供碳源，增加孢子产量。50kg黄腐酸钾和30kg玉米淀粉， 溶解于1kL水中，121℃灭菌30min。灭菌后应注意避免通气冷却和 搅拌，减少黄腐酸钾起泡。混合物灭菌冷却到30℃以下，pH值为10， 保持80rpm搅拌加入发酵罐。补料入发酵罐内后罐内pH值会上升到 4左右，随后pH值随着淀粉的利用会略有下降。如果降至3.5以下可以开启补碱补入氨水控制pH值在3.5。

第二次补料后，每日随着溶氧回升逐渐下调通气量和转速直到 50rpm和30m

S5.出罐准备：储罐暂储时应保持搅拌避免分层，出罐取样测定发酵液cfu， 可达到2.5×10

S6.固体载体压滤分离：向储罐发酵液中添加200kg的白炭黑和800kg的硅 藻土，搅拌均匀后罐内加压到0.1mPa压入装有200目滤布的压滤机。待滤液不 再大量流出，关闭加料阀，缓慢加压压滤，控制压滤水压压力不超过0.12mPa。 压滤后滤饼含水量在70％。

S7.干燥制剂：滤饼送入38℃循环抽湿烘干房内低温烘干至含水量<10％， 80目破碎过80目筛可得原料孢子粉，孢子粉中孢子16×10

实施例3

培养基配比：

a)土豆葡萄糖培养液：

200g土豆的浸出液(200g土豆去皮切碎煮软后纱布过滤取清液)、20g葡萄 糖，加水定容为1L

土豆葡萄糖琼脂平板在上述的基础上再加入1.5％(15g/L)琼脂，灭菌121℃，25min。

b)玉米粉培养基，

发酵罐内混匀后121℃灭菌30min，灭菌后冷却到28℃接种，灭菌后pH值 在5.1。

S1.菌株维持和种子液培养：在洁净环境下无菌操作，哈茨木霉菌株在土豆 葡萄糖琼脂平板上维持。在长满菌体的平板上打孔取菌栓接种于500mL土豆葡 萄糖培养液，在28℃，120rpm摇床振荡培养48h，即可用于接种一级发酵罐(种 子罐)。

S2.一级发酵(种子罐)：在火焰掩护下向100L玉米粉培养液中倒入摇瓶中 的500ml菌液接种。发酵温度28℃，通气量为0.1m

S3.二级发酵(扩增罐)：二级发酵液体积为1kL玉米粉培养液，灭菌后冷 却到28℃后预备接受移种。温度28℃，通气量为1m

S4.三级发酵(生产发酵罐)：三级发酵体积为10kL，加入玉米粉培养液，灭 菌后冷却到30℃后预备接受移种。通气量为60m

(1)发酵控制：

a)温度：发酵全程温度控制在28℃。

b)通气和转速控制：随着发酵进行溶氧会迅速降低到5％以下，在第一次补 料后，观察到罐内溶氧有回升时，即可适当缓慢减少通气量和降低搅拌速度，在 第二次补料时降至70-80rpm和42-48m

c)pH值在发酵初期不控制，中期补充氨水控制pH值为3.3，后期罐内pH 值自然升高，不再控制pH值。

(2)发酵过程：

a)接种后罐内pH值降低稳定在最低点时(pH值降到2.5)进行第一次补料 (附图1-②，接种后20h左右)，添加1％w/v的葡萄糖，为对数期生长的木霉菌 提供快速碳源并向罐内补水。将100kg葡萄糖溶解于约1kL的水中，115℃灭菌 30min，冷却到30℃以下补入三级发酵罐，补料中保持转速100rpm。补料后开启 补碱，通过加入20％的浓氨水调解罐内pH值到6，同时补充氮源。控制加碱速 度不要使pH值剧烈变化，变化速率小于0.2/min，加碱过程持续17min，同时保 持转速100rpm。

这一时期菌丝开始大量生长，补料后pH值会开始继续下降。当手动补料补 碱后罐内pH值再次降到低点稳定时(pH值降到2.5)后通过补氨水维持pH值 在3.2到第二次补料(附图1-③)。酸性环境抑制分生孢子产生，并促进哈茨木 霉产生厚垣孢子。继续监控溶氧变化，观察罐内溶氧上升则可适当降低转速和通 气量，直到降至75rpm和45m

b)三级发酵70h-80h，镜检可以看到菌丝旺盛生长(附图2)， 此时厚垣孢子即将开始生成，准备进行第二次补料(附图1-④)，0.5％ 的黄腐酸钾和0.3％的玉米淀粉，目的是促进厚垣孢子形成并为孢子 形成过程提供碳源，增加孢子产量。50kg黄腐酸钾和30kg玉米淀粉， 溶解于1kL水中，121℃灭菌30min。灭菌后应注意避免通气冷却和 搅拌，减少黄腐酸钾起泡。混合物灭菌冷却到30℃以下，pH值为9-10， 保持70-80rpm搅拌加入发酵罐。补料入发酵罐内后罐内pH值会上升 到4左右，随后pH值随着淀粉的利用会略有下降。如果降至3.5以 下可以开启补碱补入氨水控制pH值在3.3。

第二次补料后，每日随着溶氧回升逐渐下调通气量和转速直到 50rpm和30m

S5.出罐准备：储罐暂储时应保持搅拌避免分层，出罐取样测定发酵液cfu， 可达到2×10

S6.固体载体压滤分离：向储罐发酵液中添加200kg的白炭黑和800kg的硅 藻土，搅拌均匀后罐内加压到0.1mPa压入装有200目滤布的压滤机。待滤液不 再大量流出，关闭加料阀，缓慢加压压滤，控制压滤水压压力不超过0.12mPa。 压滤后滤饼含水量在65％。

S7.干燥制剂：滤饼送入37℃循环抽湿烘干房内低温烘干至含水量<10％， 80目破碎过80目筛可得原料孢子粉，孢子粉中孢子10×10

成品孢子粉含水量<10％，厚垣孢子粉于干燥阴凉处保存货架期可以达到一 年以上，pH 6～7，80目筛细度>90％。产出的孢子粉可加入辅料制成微生物菌剂， 高于农用微生物菌剂国家标准的保质期六个月，80目筛细度>70％，粉剂含水量 <35％，有效活菌数>2×10

与现有技术相比，本方法通过多次补料分段发酵，克服了厚垣孢子产量低的 技术问题，规模发酵时发酵液中活孢子产量可以达到(1.5～2.5)×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。