可溶性表达弓形虫MIC1重组蛋白质的杆状病毒的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及可溶性表达弓形虫MIC1重组蛋白质的杆状病毒的制备方法。

背景技术

弓形虫是一种专性寄生于有核细胞内的寄生虫，无宿主特异性，可感染人和几乎所有温血动物。弓形虫感染是通过摄入被寄生虫抗性阶段(卵囊)污染的食物和水，或通过食用含有其包囊阶段的未煮熟的肉类而引起的。人类原发性感染通常是无症状的，或者在免疫系统完整的宿主中引发轻微症状。然而，免疫抑制患者的弓形虫病会由于潜伏囊肿的再活化而引起严重的损害。因无特效治疗药物，弓形虫病已经给人类和畜牧养殖业带来了巨大危害。

在弓形虫入侵宿主细胞的过程中，微线体蛋白发挥了极其重要的作用，微线体是存在于虫体前端的分泌器官，微线体蛋白在粗面型内质网合成后，经高尔基体到达微线体，并分泌到体外，目前已知的微线体蛋白有15种以上，包括MIC1，MIC12，AMA1等。在微线体蛋白分泌、运输和释放过程中，它们都与另外的微线体蛋白结合起来，以复合体的形式起作用。弓形虫微线体蛋白1(TgMIC1)是通过单克隆抗体筛选获得的。MIC1不含跨膜区，蛋白序列含有18个半胱氨酸残基，而受体分子中经常出现半胱氨酸区域，推测MIC1可能在弓形虫与宿主细胞表面结合过程中发挥作用。

常见的蛋白表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统，大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的原核表达系统，具有原核细胞良好的可操作性，遗传背景清晰，成本较低，表达产物分离纯化相对简单等优点，但其不能进行糖基化修饰，蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成等，且易产生内毒素。而昆虫杆状病毒表达系统是一类具有独特的生物学特性的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力，适用于大部分蛋白。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统，利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。由于重组病毒的分离是通过蓝白斑筛选，不存在野生型和非重组型病毒污染的问题，而且其具有高等真核生物表达系统的优点，如翻译后加工修饰的功能--二硫键的形成等，使重组蛋白在结构及功能上更加接近天然蛋白质。最高表达量可以达到昆虫细胞蛋白总量的50％。可表达非常大的外源性基因。杆状病毒能容纳大分子的插入片段，能包装大的基因片段。杆状病毒表达系统具备在同一个细胞内同时表达多个基因的能力，既可采用不同的重组病毒同时感染细胞，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因。表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。昆虫细胞在培养中可以达到较高的细胞密度，有利于大规模表达重组蛋白，是表达有生物活性的蛋白质的理想方式。

发明内容

为此，本发明提供可溶性表达弓形虫MIC1重组蛋白质的杆状病毒的制备方法，以达到体外高效、可溶性表达弓形虫MIC1的效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

可溶性表达弓形虫MIC1重组蛋白质的杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

S1、截去弓形虫微线体蛋白TGME49_291890的基因序列编码信号肽的1-72位序列作为目的基因，得到如SEQ1所示序列作为目的基因；

S2、设计MIC1带酶切位点的引物MIC1-NdeI-5与MIC1-XhoI-3；

S3、以目的基因的cDNA为模板，采用步骤S2所述引物扩增目的基因片段，再经NdeI与XhoI双酶切，获得带有酶切位点的目的片段，利用NdeI与XhoI双酶切pET22b载体，并分别纯化、回收酶切后的目的片段和线性化载体，对目的片段和线性化载体通过连接酶过夜连接，得连接产物pET22b-MIC1；

S4、设计pET22b-MIC1带酶切位点的引物MIC1-XbaI-5与MIC1-HindⅢ-5；

S5、以pET22b-MIC1为模板，采用步骤S4所述引物扩增目的片段，再经HindⅢ和XbaI双酶切获得带有酶切位点的目的片段，利用HindⅢ和XbaI双酶切昆虫细胞表达载体pFastBac1，并分别纯化、回收酶切后的目的片段和线性化载体，对目的片段和线性化载体通过连接酶进行连接反应，得连接产物pFastBac1-MIC1转移载体；

S6、将所述连接产物pFastBac1-MIC1转移载体转化至DH10Bac感受态细胞，经抗性蓝白斑筛选、分离，得到重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-MIC1；

S7、将所述重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-MIC1转染Sf9昆虫细胞，经三次细胞传代培养，得到重组杆状病毒。

进一步地，步骤S2中所述引物序列为：

MIC1-NdeI-5：5'-CCTT

MIC1-XhoI-3：5'-TAAC

进一步地，步骤S3中所述扩增采用PCR扩增；PCR扩增反应参数为：98℃预变性1min，98℃变性10s，47℃退火15s，72℃延伸10s，10个循环后；98℃变性10s，69℃火15s，72℃延伸10s，4℃再延伸，进行25个循环。

进一步地，步骤S3中所述过夜连接的温度为16℃。

进一步地，步骤S3中所述酶切的温度为37℃，时间为30min。

进一步地，步骤S3中所述扩增过程中反应物缓冲液、NdeI、XhoI、模板、dd H

进一步地，步骤S4中所述引物序列为：

MIC1-XbaI-5：5'-TTAA

MIC1-HindⅢ-5：5'-TTGC

进一步地，步骤S5中扩增采用PCR扩增；PCR扩增反应参数：98℃预变性1min，98℃变性15s，47℃退火15s，72℃延伸20s，4℃再延伸，进行35个循环。

进一步地，步骤S5所述扩增过程中反应物缓冲液、NdeI、XhoI、模板、dd H

进一步地，所述重组杆状病毒在昆虫细胞内表达的MIC1重组蛋白质具有可溶性与抗原性。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：

本发明提供了可溶性表达弓形虫MIC1重组蛋白质的杆状病毒的制备方法，本发明的重组杆状病毒，利用杆状病毒的递呈作用，在昆虫细胞中能成功表达出重组蛋白质，所述昆虫细胞中表的MIC1重组蛋白质，由于翻译后的准确修饰和正确折叠，保持了其抗原性与可溶性，可用于后续研制其抗体及生物学功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的MIC1目的片段扩增结果；

Mark为Trans 2K PLUS DNA Marker，目的片段大小为1300bp；

其中，M为DNA分子量标准；1，2，3，4为MIC1扩增产物。

图2为本发明提供的pET22b-MIC1质粒双酶切鉴定结果；

Mark为Trans 2K PLUS DNA Marker，pET22b载体为5493bp，目的片段大小为1300bp；

其中，M为DNA分子量标准；1为单酶切鉴定结果，2为pET22b-MIC1质粒的双酶切鉴定结果。

图3为本发明提供的pFast bac1-MIC1质粒双酶切鉴定结果；

Mark为Trans 2K PLUS DNA Marker，pFastBac1载体为4755bp，目的片段大小为1300bp；

其中，M为DNA分子量标准；1，2，3，4为pFastBac1-MIC1载体的双酶切鉴定结果。

图4为本发明提供的蓝白斑筛选含重组杆状病毒质粒的PCR鉴定结果；

其中，M为DNA分子量标准，1，2，3，4为白色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA扩增产物，5为蓝色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA扩增产物。

图5为本发明提供的接毒细胞/正常细胞上清提取杆状病毒基因组DNA后进行PCR验证；为保证实验准确性，重复做两次本实验，PCR验证结果；

其中，M为DNA分子量标准，1为接毒细胞上清液，2为空白对照细胞上清液。

图6为本发明提供的接毒细胞MIC1表达IFA检测明场结果。

图7为本发明提供的接毒细胞MIC1表达IFA检测DAPI染色结果。

图8为本发明提供的接毒细胞MIC1表达IFA检测鼠抗MIC1单抗结果。

图9为本发明提供的正常细胞MIC1表达IFA检测明场结果。

图10为本发明提供的正常细胞MIC1表达IFA检测DAPI染色结果。

图11为本发明提供的正常细胞MIC1表达IFA检测鼠抗MIC1单抗结果。

图12为本发明提供的接毒细胞MIC1表达Western Blot鉴定；

其中，M为蛋白Mark，1为正常Sf9细胞裂解液，2为接毒Sf9细胞裂解液。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

DH10Bac感受态细胞为沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存

原核表达载体pET22b、昆虫细胞表达载体pFastBac1为沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存

Sf9昆虫细胞为沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室保存

内切酶NdeI、XhoI、HindⅢ和XbaI TaKaRa公司

T4 DNA连接酶 TaKaRa公司

小型提质粒抽提试剂盒 TaKaRa公司

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 天根公司

SF900Ⅱ无血清培养基 美国Gibco公司

LipoInsect

杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒 碧云天公司

5×SDS-PAGE上样缓冲液 碧云天公司

HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) 碧云天公司

甘氨酸 北京酷来搏科技有限公司

牛血清白蛋白Ⅴ(BSA) 索来宝公司

Alexa Flour@488goat anti-rabbit Ig(H+L) 上海Invitrogen公司

ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermon Fisher公司

CD71鼠源单抗 Cell Signaling公司

DNA标准Mark 北京全式金公司

Trans1-T1感受态细胞 北京全式金公司

实施例1、含MIC1基因重组杆状病毒的构建

步骤一、登录Toxo DB网站上检索到TGME49_291890后，分析基因序列和蛋白序列，下载基因全长序列，截去编码信号肽的序列(1-72位)：如SEQ1，设计MIC1带酶切位点的引物，引物如下：

MIC1-NdeI-5：5'-CCTTCATATGGCGTCGCATTCTCAT-3'；

MIC1-XhoI-3：5'-TAACCTCGAGAGCAGAGACGGCCG-3'；

cDNA的合成：S1、弓形虫RH株总RNA的提取

使用Trizol试剂对弓形虫的总RNA进行提取，步骤如下：

1)从-80℃超低温冷藏冰箱中取出纯化后的虫体沉淀(约1×10

2)在Trizol混合液中加入200μL氯仿，于涡旋振荡器中剧烈震荡15～20s，后室温静置5min；(静置后，混合液出现明显分层，上层为无色澄清液，下层呈现出红色)；

3)将上述混合液置于4℃低温离心机中，12000×g离心15min，结束后吸取上清至新1.5mL离心管中，吸取的上清量大约为500μL；

4)往上清中加入相同体积的异丙醇溶液，充分混匀、颠倒1～2min，后置于-20℃静置30min以上；

5)此时，1.5mL离心管中出现少量沉淀，为核酸片段；将离心管置于4℃低温离心机中，12000×g离心20min，后弃掉上清留取沉淀；

6)往沉淀中加入1mL75％乙醇溶液，于涡旋振荡器中剧烈震荡30s后，再置于4℃低温离心机中，7500×g离心5min，弃上清；

7)再加入1mL75％乙醇溶液，于涡旋振荡器中剧烈震荡30s后，再置于4℃低温离心机中，12000×g离心5min，弃上清；

8)离心管开盖，室温静置3～5min以彻底挥发剩余的乙醇；后加入20～30μL的DEPC去离子水完全溶解沉淀，后置于冰中测定浓度，进入反转录实验流程。

S2、cDNA的合成：本实验流程主要参照莫纳生物(MonScript RTIII All-in-OneMix with dsDNase REF:MR05101)的反转录试剂盒进行操作。cDNA置于-20℃予以保存。

以cDNA为模板扩增目的基因片段，双酶切扩增后的目的片段及pET22b载体后，并分别纯化、回收酶切后的目的片段和线性化载体，16℃过夜连接，得到pET22b-MIC1；其中，扩增反应参数如表1所示，酶切反应参数如表2所示，连接反应参数如表3所示。

表1 PCR扩增反应体系

表2酶切反应体系

表3连接反应体系

步骤二、设计pET22b-MIC1带酶切位点的引物，引物如下：

MIC1-XbaI-5：5'-TTAATCTAGAATGGCGTCGCATTCTC-3'

MIC1-HindⅢ-5：5'-TTGCAAGCTTTCAGTGGTGGTGG-3'

以pET22b-MIC1为模板扩增目的片段，再经HindⅢ和XbaI双酶切获得带有酶切位点的目的片段，利用HindⅢ和XbaI双酶切昆虫细胞表达载体pFastBac1，并分别纯化回收、酶切后的目的片段和线性化载体，对目的片段和线性化载体通过T4 DNA连接酶进行连接反应，得连接产物pFastBac1-MIC1转移载体；其中，扩增反应参数如表4所示，酶切反应参数如表5所示，连接反应参数如表6所示。

表4 PCR反应体系

表5酶切反应体系

表6连接反应体系

将连接产物pFastBac1-MIC1转移载体转化到Trans1-T1感受态细胞中，取200μL菌液涂布Amp

步骤三、重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-MIC1的构建与鉴定

将步骤二的反应产物pFastBac1-MIC1转移载体转化到DH10Bac感受态细胞，涂布在X-gal三抗性琼脂平板，于37℃恒温培养48-72h，通过蓝白斑筛选，挑取含重组杆状病毒质粒的白色克隆菌到三抗LB液体培养基中培养，并用杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒抽提重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-MIC1；

随后用Bac to Bac杆状病毒载体通用引物进行PCR分析重组杆状病毒质粒DNA，如表7，结果蓝色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA的扩增产物大小约为300bp，白色菌落提取的重组杆状病毒质粒DNA的扩增产物约为4600bp，如图4。

表7重组杆状病毒质粒DNA的PCR反应体系

步骤四、重组杆状病毒毒株的获取

将2μL步骤三所制得的重组杆状病毒穿梭载体reBacmid-MIC1和5μL脂质体加到100μL SF900 II无血清培养基中，轻轻混匀，室温静置5min。将混合液转染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞，设置空白对照组。27℃培养72h后，收集上清培养液，此为第一代重组杆状病毒毒株。收集上清培养液后，继续经三次细胞传代培养后获得高效价重组杆状病毒毒株。

实施例2MIC1重组蛋白质在Sf9细胞中的表达与鉴定

1.检测reBacmid-MIC1转染Sf9昆虫细胞

通过基因组DNA提取试剂盒提实施例1所获得的三次细胞传代培养的上清液中杆状病毒基因组DNA，并用pUC/M13-F/R特异性引物进行PCR验证，结果如图5所示。由PCR验证可见reBacmid-MIC1成功转染Sf9昆虫细胞。

2.MIC1融合蛋白质的分析

2.1间接免疫荧光检测

Sf9昆虫细胞以1*10

2.2 Western blot检测MIC1重组蛋白质

Sf9昆虫细胞以1*10

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 可溶性表达弓形虫MIC1重组蛋白质的杆状病毒的制备方法

<130> GG21939746A

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3955

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cttgaccatt tcaatttaga gcgcaatagt tgtagatgat cgtgttgttg tgaccagcgt 60

ttatcgattg tcagaaggcc tacgataagc gttaaggcag attctgcttg cttagggagc 120

ttaatattcg tcgaaacgat ctgaatttat agatgtcgtg aactcattta ggataagcgc 180

gcacagatag tgagcatttc tgttctcgga acttcgcctc ggtcttcttg gcaaaaaagg 240

tgtcccctct caaaatgtac tgtgtgcctg tggtggtgtt tctgtcctgg cgtcgttgtt 300

tttgaagtga gacatcaaat ttcaccgcct ttgattacgg cagaacagtc agatggtcac 360

agatgcgaca gggagtcagt gataccggtt tctgataata tttccgatgg tttttcgcat 420

gtgtactgct ggcgcgtact gaaccacctc cacacctgca ctatgtggac gttgtgcagg 480

ctcactcgct agaacgcgta acgatgaaag cagactccta atgaaaagtt tcaggtcatt 540

tcactgaaga acacgcgatt tctagtaagc agccagcgtc acatattagc gtgtcaacca 600

ccggagtaca gactgatcgt tcagtggaag acggggatta ctaaacgaaa gcaatacaga 660

gcaggagata aaagacagtc aattttgcca cgccgtctca ttcacccctt tgtatcggaa 720

tgtagtggtg ctcaccagct gtaccttcag tcactttttc tctgatacat ggtgactaaa 780

aaaggaggcc gtgtcggtgc tgctcagtaa ttgtccgccc ttgaacggtg ggtcgaaaaa 840

tccccgaaac cgtattcaca gaaagaaaaa ggggtacctt cgttcaaagt gttttccggt 900

ggtgcagctt cgggtttttt gagaaaacga agacaattaa tttgaatccg agtaaaggtc 960

acagcttaaa agagagaagg tgcacggttt gcggcgacct gtgatactgt ttaccgggag 1020

tgtccccatc tagtgtcgga actgctctac ctcacgtcat ccgtggaaat gacgttttct 1080

tccgtcactg cacatcttta cggctaccaa aacaccgttt actaatgcgc gctataaaga 1140

atcggagtct ggtagacgac tgcgtgcagt agtatctgaa aaatcactgt tctaagtact 1200

gtaggatttg acaatcgaga cggtcccgtt ccacctcacc tgatctcgaa acttacttac 1260

agtgcactac agtgagtgaa ccaaccaagt ggaggagcca ccggaagtcg gcgaaaataa 1320

cctagtacac atgcgttttc aacatttttc agagccttct acacgtcaac ctgaaagcgg 1380

gtgccgcgtc gctaccgttt cctgtggcgt ctctagtgcg acatccgaag taacagtaac 1440

gtccggcatg gaacgccgac gcgggtgttc cagtcgcctg gctccttcta ctcgcacttc 1500

gatgttacgt tccttattgg tgcgacgcgg ttctcgtgtt gctagacgtc gcaccggctg 1560

aaagctgtag aaaatttagt tattttcctg tcagctagct tgcaggagtg cgtttttgtg 1620

tgttggtttc gtctcacatg gctgctgatc tgttgatgca gctgtgtaca cgtgcctcga 1680

ttctgtagtt gacctagaac ggatttgcaa agatgggcca ggcgttgttt ctcaccgttc 1740

tattgccggt gttatttggc gttgggccag aagcatatgg agaagcgtcg cattctcatt 1800

cgccggcatc gggacgttat atacaacaga tgcttgacca acgctgccaa gagattgctg 1860

cagaactctg ccaaggcgga cttcgtaaaa tgtgtgtgcc ctctagccgg atagtagctc 1920

gaaacgccgt gggcattact catcaaaata cacttgaatg gagatgcttt gatacagcct 1980

ctttgctgga gagcaatcaa gaaaacaacg gtgttaattg cgtggacgac tgtggccaca 2040

cgataccgtg tcctggcggc gtacaccggc aaaacagtaa tcacgcaacg cgccatgaga 2100

tactgtccaa attggtcgaa gaaggagtac aacggttctg cagtccttat caagcatctg 2160

ccaacaagta ctgtaacgac aaatttccag ggaccattgc gaggaggtcg aagggcttcg 2220

gaaacaatgt cgaggttgcg tggaggtgtt acgagaaggc cagcttgctg tactcggttt 2280

atgctgagtg tgcgagcaac tgcggaacaa cgtggtactg ccctggagga cgacgaggga 2340

cgtcgacaga actagacaag cggcattata cagaagagga aggaattcgc caggcaatcg 2400

gatccgtcga cagcccatgt tctgaagttg aagtctgcct accgaaggat gagaatcccc 2460

cggtgtgttt agatgaaagt ggccagattt cacgaactgg tggtgggcca ccgtcacaac 2520

cgcctgagat gcaacagccc gccgatcgtt cggacgagag aggtggcggt aaggaacagt 2580

cgcctggagg agaagctcag ccggaccatc caacgaaggg tggtaacata gacctgcctg 2640

agaaatcaac atctcccgag aagacgccga aaaccgagat ccatggtgac agcacgaaag 2700

cgacgctcga agaggggcag caactaacgc tcacgtttat ctccactaaa ctggatgttg 2760

ctgtaggctc gtgtcattca ctcgtcgcga atttccttga tggatttttg aagtttcaga 2820

cgggctcaaa ttcggcgttc gatgtggtag aagtggaaga gccagcagga cccgcagtgc 2880

ttacgatagg tctgggacac aaaggccgtc tcgctgttgt cctcgactac accaggctca 2940

atgctgcttt aggatcagct gcttacgtgg tcgaagattc tggatgcagc tcaagtgaag 3000

aggttagttt ccaaggagtg ggtagtggag cgacgctcgt ggtgacgacg cttggcgaga 3060

gtcctacggc cgtctctgct tgatttatag tactctttgg agcatgcttg tggaggaacg 3120

ggacaatctc ggcaaaatca ggatgaagtt tgtgagatac agatcgttcc tgaacagtgg 3180

aagatgcgtc actattacac ctatatgcgt cctggttctt gtagagttgg agttcttgca 3240

ggtgtaatga ctatgacata cggatataac ttcatacggg gaactgtggc tttctcgaga 3300

ttccgccctc agtgtttctg ttgcatgccg tcccaccgta tttcggggcc ttgtattgaa 3360

tctactttct gaggttcttg cttatctctt taatgcagca tgttgcccga attcttgtta 3420

cgcggtcaga tgtttcttga gtagtgaatc aaaatgtatt atggtgtaat cctgtcagtt 3480

ttatacgtat tgtcatacgt ccacgcatct cacgtacggg cgcgaacgca gcaagtgacg 3540

agagatcatc ccactcgttt ggtgacgctg caaaatacaa gtgtattata cggtcagtcg 3600

gctctacaac attcaaaacg agttgtctcg cttcaaccac aaagcgccac actacgcaga 3660

ggaccgacgg aaggcgttaa tgcttgtcgg cgatagtcat gtcctgttta gtcgtcaaat 3720

tgcttctccc caccgggcga atcaggagtt actcgctatg tgaatagttg gagatagtgt 3780

ttcgtgagta gtaaacgggc tgttcaatgc aggtaaattc tatagccggg tcaagctcaa 3840

gcttggtggt acaacaacat ctctatgtaa aagttatttg atacgagatg ccgcgatcac 3900

atttttggag agatctgcaa catgggactt ctggtagaag gcaataaata actgc 3955

<210> 2

<211> 432

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ala Ser His Ser His Ser Pro Ala Ser Gly Arg Tyr Ile Gln Gln Met

1 5 10 15

Leu Asp Gln Arg Cys Gln Glu Ile Ala Ala Glu Leu Cys Gln Gly Gly

20 25 30

Leu Arg Lys Met Cys Val Pro Ser Ser Arg Ile Val Ala Arg Asn Ala

35 40 45

Val Gly Ile Thr His Gln Asn Thr Leu Glu Trp Arg Cys Phe Asp Thr

50 55 60

Ala Ser Leu Leu Glu Ser Asn Gln Glu Asn Asn Gly Val Asn Cys Val

65 70 75 80

Asp Asp Cys Gly His Thr Ile Pro Cys Pro Gly Gly Val His Arg Gln

85 90 95

Asn Ser Asn His Ala Thr Arg His Glu Ile Leu Ser Lys Leu Val Glu

100 105 110

Glu Gly Val Gln Arg Phe Cys Ser Pro Tyr Gln Ala Ser Ala Asn Lys

115 120 125

Tyr Cys Asn Asp Lys Phe Pro Gly Thr Ile Ala Arg Arg Ser Lys Gly

130 135 140

Phe Gly Asn Asn Val Glu Val Ala Trp Arg Cys Tyr Glu Lys Ala Ser

145 150 155 160

Leu Leu Tyr Ser Val Tyr Ala Glu Cys Ala Ser Asn Cys Gly Thr Thr

165 170 175

Trp Tyr Cys Pro Gly Gly Arg Arg Gly Thr Ser Thr Glu Leu Asp Lys

180 185 190

Arg His Tyr Thr Glu Glu Glu Gly Ile Arg Gln Ala Ile Gly Ser Val

195 200 205

Asp Ser Pro Cys Ser Glu Val Glu Val Cys Leu Pro Lys Asp Glu Asn

210 215 220

Pro Pro Val Cys Leu Asp Glu Ser Gly Gln Ile Ser Arg Thr Gly Gly

225 230 235 240

Gly Pro Pro Ser Gln Pro Pro Glu Met Gln Gln Pro Ala Asp Arg Ser

245 250 255

Asp Glu Arg Gly Gly Gly Lys Glu Gln Ser Pro Gly Gly Glu Ala Gln

260 265 270

Pro Asp His Pro Thr Lys Gly Gly Asn Ile Asp Leu Pro Glu Lys Ser

275 280 285

Thr Ser Pro Glu Lys Thr Pro Lys Thr Glu Ile His Gly Asp Ser Thr

290 295 300

Lys Ala Thr Leu Glu Glu Gly Gln Gln Leu Thr Leu Thr Phe Ile Ser

305 310 315 320

Thr Lys Leu Asp Val Ala Val Gly Ser Cys His Ser Leu Val Ala Asn

325 330 335

Phe Leu Asp Gly Phe Leu Lys Phe Gln Thr Gly Ser Asn Ser Ala Phe

340 345 350

Asp Val Val Glu Val Glu Glu Pro Ala Gly Pro Ala Val Leu Thr Ile

355 360 365

Gly Leu Gly His Lys Gly Arg Leu Ala Val Val Leu Asp Tyr Thr Arg

370 375 380

Leu Asn Ala Ala Leu Gly Ser Ala Ala Tyr Val Val Glu Asp Ser Gly

385 390 395 400

Cys Ser Ser Ser Glu Glu Val Ser Phe Gln Gly Val Gly Ser Gly Ala

405 410 415

Thr Leu Val Val Thr Thr Leu Gly Glu Ser Pro Thr Ala Val Ser Ala

420 425 430