FABP3在大动脉炎血管纤维化中的应用

技术领域

本发明涉及FABP3在大动脉炎血管纤维化中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

大动脉炎是一种慢性非特异性、炎症性大血管病，主要累及主动脉及其一级分支，胸主动脉、肺动脉及其分支、眼底动脉和颅内动脉同样可以受累。炎症驱动的血管壁纤维化是大动脉炎的主要病理特征，纤维化是最终导致重要脏器缺血、器官功能衰竭的主要原因。

临床上大动脉炎的常规治疗中采用30～40mg/天糖皮质激素(Glucocorticoid)加免疫抑制剂等，如加甲氨蝶10-15mg/周或来氟米特20mg/天或环磷酰胺 600-800mg/月等，这些药物通过直接或间接抑制机体免疫系统，激活发挥抑制炎症的作用，从而有效的控制病情，然而当糖皮质激素减量至10mg/天及以下时，仅28％的患者能够持续缓解。炎症的反复发作最终导致受累血管的破坏、重塑、增厚、狭窄甚至闭塞，常规治疗后仍有30％的患者出现影像学进展。近年来生物制剂IL-6受体单抗用于大动脉炎治疗，虽然表现出令人满意的疗效和安全性，但仍有病例报告血管病变进展，而且昂贵的价格也导致很多患者无法承担。

关于大动脉炎纤维化发生发展的机制是研究热点，但是一直没有被突破，在治疗上也是束手无策。糖皮质激素已被证实可导致总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平的升高，且大量研究证实了其与代谢综合征发生的密切关系。因此，长期依赖大剂量糖皮质激素治疗，会导致血脂异常，这会加重了血管壁的动脉硬化和血管的损害。糖皮质激素对血脂的影响与每日剂量和累计剂量有关，小剂量可导致总胆固醇含量升高，增加心血管疾病发生风险；而大剂量可导致甘油三酯含量增加，并诱发骨质疏松、心血管相关并发症。此外，糖皮质激素联合免疫抑制剂造成的各种感染，如疱疹病毒感染、曲霉菌感染、肺炎等，以及免疫抑制剂的细胞毒性作用，也是治疗中的棘手问题。

姜黄素具有很强的亲脂性，因而具有与生物膜相互作用的能力，可以通过直接插入细胞膜被细胞摄取，也可以通过与细胞膜上的受体结合进一步发挥效应。姜黄素具有较强的安全性，随机对照研究证实口服高剂量姜黄素纯品(12g)安全可耐受。

临床上，姜黄素已被用于各种慢性炎症性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、系统性红斑狼疮。2017年一项临床研究发现姜黄素能够提高大动脉炎的治疗应答，降低患者炎症指标。然而姜黄素对大动脉炎血管纤维化的调控作用及相关靶点机制尚未揭示。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：大动脉炎的常规治疗中长期采用大剂量糖皮质激素治疗会导致血脂异常、引发心血管相关并发症以及糖皮质激素联合免疫抑制剂会造成各种感染等问题。

为了解决上述技术问题，本发明公开了FABP3拮抗剂在制备治疗和预防大动脉炎血管纤维化的药物中的应用。

优选地，所述应用包括FABP3拮抗剂在制备治疗和预防大动脉炎血管纤维化的辅助药物中的应用。

优选地，所述的FABP3拮抗剂包括姜黄素纯品和/或含有姜黄素的制剂。

优选地，所述的含有姜黄素的制剂包括姜黄颗粒。

本发明还公开了抑制FABP3表达的物质在制备抑制细胞外基质蛋白的表达的试剂和/或主动脉外膜成纤维细胞增殖的试剂和/或抑制动脉外膜成纤维细胞合成大动脉炎血管纤维化标志物的试剂中的应用。

优选地，所述的抑制FABP3表达的物质包括FABP3的特异性siRNA和/或姜黄素。

优选地，所述的细胞外基质蛋白包括蛋白FN1、COL1、MMP9和MMP3中的至少一种。

优选地，所述的大动脉炎血管纤维化标志物包括FN1、COL11A、COL1、 MMP9和MMP3中的至少一种。

优选地，所述的FABP3的特异性siRNA包括序列为 5’-GGGACAUUCUCACCCUAAA-3’的siRNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明通过加用姜黄颗粒可在6个月内有效控制大动脉炎患者血管纤维化进展，并一定程度降低血清中促纤维化因子FN1和MMP9的水平；

2.姜黄素具有安全、不良反应小的优点，与糖皮质激素和/或免疫抑制剂联用，可将其他两种药物维持在较小或较安全的剂量，可降低严重不良反应的发生率，尤其是通过调节脂质代谢平衡，减少远期心血管不良事件的发生，增加治疗的安全性；

3.姜黄素与传统中药方剂相比，具有服用方便的优势，只需温水泡饮，免去了煎服的复杂工序，且姜黄素价格经济，有利于提高患者的依从性，保证治疗的可持续性。

附图说明

图1：一位40岁男性大动脉炎患者，接受姜黄颗粒60克/天辅助治疗，基线和6个月全身血管MRA结果，其中，左图为该患者基线图，右图为该患者6个月全身血管MRA图；

图2：18例大动脉炎患者加用姜黄颗粒治疗6个月后血清FABP3水平变化；

图3：转录组测序差异表达前10基因的PCR验证；其中，FABP3在HSP65 刺激后上调最为显著，且姜黄素处理后下调最为明显；

图4：大动脉炎患者与健康人动脉外膜FABP3表达情况，其中，****表示 p<0.0001；

图5：FABP3的表达与FN1，COL1，MMP3和MMP9的表达均呈正相关关系；

图6：AAF中FABP3下调对细胞增殖的影响；A：AAF中FABP3敲减成功； B：FABP3下调对AAF细胞活力的影响；C：FABP3下调对细胞核内Ki67表达的影响，图中Merge组圈出的是Ki67染色细胞；

图7：AAF中FABP3过表达对细胞增殖的影响；A：AAF中FABP3表达成功上调；B：FABP3过表达对AAF细胞活力的影响；C：FABP3过表达对细胞核内Ki67表达的影响，图中Merge组圈出的是Ki67染色细胞；

图8：AAF中FABP3表达对ECMs合成的影响；A：FABP3下调对AAF合成FN1，COL11A，COL1，MMP9及MMP3的影响；B：FABP3过表达对AAF 合成FN1，COL11A，COL1，MMP9及MMP3的影响；

图9：姜黄素对FABP3-OE-AAF增殖的影响；A：姜黄素降低FABP3-OE-AAF 中FABP3的表达；B：姜黄素对FABP3-OE-AAF细胞中ATP合成的影响；C：姜黄素对FABP3-OE-AAF细胞存活率的影响；D：姜黄素对FABP3-OE-AAF中增殖相关分子Ki67表达的影响，图中Merge组圈出的是Ki67染色细胞。

其中，以上附图中的符号*表示显著性水平，*表示P<0.05，**表示P<0.01， *****表示P<0.001，****表示P<0.0001。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

本发明的一个实施例中，提供了姜黄素在制备治疗大动脉炎血管纤维化的药物中的应用。姜黄素，结构式为

本发明的又一实施例中，采用mRNA转录组测序(RNA-SEQ)筛选姜黄素干预后显著下调的分子，结果提示FABP3是姜黄素的重要靶分子，回顾文献 FABP3与脂质代谢密切相关，血脂紊乱可导致FABP3表达异常。FABPs参与脂肪酸的摄取、转运、代谢和储存，被认为是脂质代谢、炎症和能量平衡的中枢调节剂。其中FABP3广泛存在于全身各器官组织中，参与细胞摄取长链脂肪酸，和随后的胞内转运和氧化过程。

本发明的又一实施例中，采用免疫组化检测大动脉炎患者和健康人血管壁 FABP3的表达情况，同时分析FABP3的表达与细胞外基质蛋白ECMs(细胞外基质蛋白如COL1、FN1、MMP9、MMP3在血管壁的沉积是大动脉炎血管纤维化的标志)表达的相关性。发现大动脉炎患者动脉壁中FABP3的表达显著高于健康人，且血管局部FABP3的表达与ECMs的表达呈显著的正相关关系。

本发明的又一实施例中，用小干扰RNA和过表达质粒转染主动脉外膜成纤维细胞(AAF)，分别使得细胞内FABP3下调(siFABP3)和过表达(FABP3-OE)，检测细胞的增殖和产生ECMs的能力变化。下调或过表达AAF中的FABP3可分别抑制或促进细胞内增殖相关基因Ki67的表达及细胞活力，同时可抑制或促进 AAF合成FN1、COL11A、COL1、MMP9和MMP3。

本发明的又一实施例中，用5μM姜黄素纯品体外干预FABP3-OE-AAF，姜黄素抑制FABP3-OE-AAF中FABP3的表达，同时抑制细胞增殖和FN1，COL11A， COL1，MMP9和MMP3合成。

以下各实施例中，通用实验方法如下：

1.Ki67荧光染色实验检测细胞增殖：

①固定：用1×PBS洗涤细胞2次，每孔加入500ml 4％多聚甲醛固定15min；

②洗涤：弃去甲醛，1×PBS洗涤3次，每次5min；

③穿孔：用500ml/孔0.5％Triton-X-100室温通透20min；

④重复②；

⑤封闭：用5％BSA(1×PBS配置)室温封闭30min；

⑥一抗孵育：用1×PBS配置含0.5％Triton-X-100，2％BSA的一抗稀释液，按1：400的比例稀释Ki67抗体，每孔加入300ml，放入湿盒中，4℃孵育过夜；

⑦重复②；

⑧二抗孵育：在避光条件下，用1×PBS按照1：200稀释荧光二抗，每孔加入300ml，放入湿盒中，室温孵育2h；

⑨重复②；

⑩封片：将10μl含DAPI的防荧光淬灭封片剂滴在洗净干燥的载玻片上，使爬片有细胞的一面接触封片剂，进行封片；

荧光显微镜下观察染色结果并进行拍照。

2.CCK-8实验检测细胞活性

①将10

②用不同浓度姜黄素(1、10、20、30、40、50、60μM)处理12h，每个浓度设置6个复孔；

③配置CCK8工作液：按照培养基和CCK8原液体积比10：1配置工作液；

④PBS洗涤细胞，每孔加入110μl CCK8工作液，置于37℃，5％CO

实施例1

采用姜黄颗粒(广东一方制药有限公司)对大动脉炎患者进行辅助治疗，6 月后患者影像学稳定，部分好转：

入组18例患者联合姜黄颗粒辅助治疗(糖皮质激素平均剂量10mg/天+甲氨蝶呤10-15mg/周+姜黄颗粒60g/天)，基线临床特征如表1所示，将6个月时全身血管MRA图像和基线比较，发现14例(78％)稳定；3例(17％)改善，其中一位40岁男性大动脉炎患者的基线和6个月全身血管MRA结果如图1所示，显示右锁骨下动脉狭窄明显改善；仅1例(6％)出现轻微进展，说明加用姜黄颗粒对大动脉炎患者血管病变和纤维化具有良好的控制效果。治疗6个月时血清促纤维化因子水平发生不同程度的变化，其中11人(61％)血清FN1水平降低， 9人(50％)血清MMP9水平降低，6人(33％)血清MMP3水平降低，血清 FN1(0.86±0.10vs.0.68±0.10ng/ml,p＝0.05)、MMP9(174.9±19.0vs. 152.2±16.6ng/ml,p＝0.07)均数分别不同程度下调。18例大动脉炎患者，经60克 /天姜黄颗粒辅助治疗6个月后，血清FABP3水平降低(p<0.05)，如图2所示。

表1联用姜黄颗粒治疗的大动脉炎患者基线资料

表1中的IQR代表四分位距，ESR代表红细胞沉降率，CRP代表C反应蛋白，IL-6代表白细胞介素-6，GC dose代表糖皮质激素剂量。

实施例2

RNA-SEQ筛选验证得到差异表达基因FABP3：

为了探索姜黄素控制大动脉炎血管纤维化的潜在分子靶标，将AAF分为① NC对照组②HSP65刺激③HSP65+姜黄素三组，对每组细胞的总mRNA进行转录组测序，①②组比较筛选出812个差异表达基因，②③比较筛选出3355个差异表达基因，将两部分差异基因取交集，得到215个差异表达基因，对其中排名前10的基因进行PCR验证，结果显示FABP3在HSP65刺激后上调最为显著，且姜黄素处理后下调最为明显，如图3所示。

实施例3

血管外膜FABP3表达与大动脉炎血管纤维化密切相关：

通过检测12例大动脉炎患者和8例健康对照主动脉标本中FABP3的表达，发现大动脉炎患者受累动脉壁中FABP3的表达高于健康人，尤其在纤维化增厚严重的外膜表达更为丰富，如图4所示。为了探究FABP3与血管纤维化的关系，我们检测了大动脉炎患者及健康人动脉壁ECMs的表达，并进一步对每例患者的片子在高倍视野下随机选择3张图片，用imageJ软件计算分析阳性面积(％)，取平均值，进行相关性分析，结果显示，在大动脉炎血管外膜中，FABP3的表达与FN1，COL1，MMP3和MMP9的表达均呈正相关关系(p<0.05)，如图5 所示。因此大动脉炎受累血管外膜FABP3的表达与血管纤维化密切相关。

实施例4

FABP3促进AAF促纤维化因子表型：

为了验证成纤维细胞中FABP3的表达与细胞增殖的关系，采用FABP3特异性的小干扰RNA(SEQ ID NO:1：5’-GGGACAUUCUCACCCUAAA-3’)构建 FABP3下调的AAF，同时设置小干扰RNA对照组(siNC对照组)，并在此基础上用HSP65刺激细胞，分别通过CCK8实验检测细胞活性和通过Ki67荧光染色实验检测细胞增殖能力，结果显示FABP3下调的AAF在72h小时后存活率显著降低；FABP3下调还抑制了细胞核内Ki67的表达，如图6所示。为进一步证实FABP3的表达与细胞增殖的关系，我们用过表达质粒上调AAF中FABP3的表达，发现FABP3-OE-AAF在72h的存活率显著增加，细胞核中Ki67的表达也显著上调，如图7所示。此外，通过检测AAF中FABP3的表达变化对其产生ECMs的影响，结果显示，下调FABP3降低了细胞内FN1，COL11A，COL1， MMP9及MMP3的合成，而过表达FABP3后，FN1，COL11A，COL1，MMP9 及MMP3的表达也随之上调，如图8所示。

实施例5

姜黄素抑制FABP3的表达，从而抑制AAF的促纤维化表型：

用5μM姜黄素纯品处理转染了FABP3-FLAG质粒的AAF，细胞中FABP3 的表达和ATP水平显著下调，分别通过CCK8实验检测细胞活性和通过Ki67免疫组化染色实验检测细胞增殖能力，结果显示72h时的细胞存活率及胞核内Ki67 的表达均显著下调。用姜黄素处理转染了FABP3-FLAG质粒的AAF，细胞中 FN1，COL11A，COL1，MMP9，MMP3的表达显著下调，如图9所示。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> FABP3在大动脉炎血管纤维化中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggacauucu cacccuaaa 19