本申请要求于2018年12月27日提交的美国临时专利申请号62/785,643的权利，其名称为“保留空间邻近连续性信息的制备核酸的方法和组合物(METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR PREPARING NUCLEIC ACIDS THAT PRESERVE SPATIAL-PROXIMALCONTIGUITY INFORMATION)”，指派Anthony Schmitt、Catherine Tan、Derek Reid、ChrisDe La Torre和Siddarth Selvaraj是发明人，并分配了代理人案号AMG-1003-PV2。本申请还要求于2018年11月20日提交的美国临时专利申请号62/770,135的权利，其名称为“保留空间邻近连续性信息的核酸制备方法(METHODS FOR PREPARING NUCLEIC ACIDS THATPRESERVE SPATIAL-PROXIMAL CONTIGUITY INFORMATION)”，指派Anthony Schmitt、Catherine Tan、Derek Reid、Chris De La Torre和Siddarth Selvaraj是发明人，并分配了代理人案号AMG-1003-PV。本申请还涉及于2017年11月21日提交的美国临时专利申请号62/589,505，其名称为“保留核酸模板中的空间邻近连续性和分子连续性(PRESERVINGSPATIAL-PROXIMAL CONTIGUITY AND MOLECULAR CONTIGUITY IN NUCLEIC ACIDTEMPLATES)”，指派Siddarth Selvaraj、Anthony Schmitt和Bret Reid是发明人，并分配了代理人案号AMG-1002-PV。本专利申请还涉及于2018年11月20日提交的PCT申请号PCT/US18/62005，其名称为“保留核酸模板中的空间邻近连续性和分子连续性(PRESERVINGSPATIAL-PROXIMAL CONTIGUITY AND MOLECULAR CONTIGUITY IN NUCLEIC ACIDTEMPLATES)”，指派Siddarth Selvaraj、Anthony Schmitt和Bret Reid是发明人，并分配了代理人案号AMG-1002-PC。前述专利申请的全部内容通过引用并入本文，包括所有文本、表格和附图。
技术领域
此项技术涉及核酸测序。
背景技术
下一代测序(NGS)已成为确定可用于众多研究和临床应用的核酸序列的主要方法集合。NGS的典型工作流程如下：从核酸源中分离出通常组织成染色体的天然基因组DNA，导致其片段化，以产生核酸模板，随后由测序仪器读取以产生序列数据。
发明内容
该技术涉及用于制备核酸的方法，该方法可保留DNA空间邻近连续性序列信息，从而能够检测空间邻近核酸(例如HiC)，从而为受益于长距离序列连续性信息的应用(例如单体型分型、基因组重排检测以及其他由长距离序列连续性信息实现的应用)提供服务。
在从目的样品制备DNA期间保留空间邻近连续性信息允许保留从其获得的测序数据中的连续性。保留连续性的测序数据可以通过鉴定基因组变异体、确定连续性信息以从头通知基因组组装、单体型期信息的解卷积、基因组重排检测(它们一起是理解遗传学在生命系统中的作用的基础)来全面确定核酸序列，如保留连续性的核酸模板所表现的。
使用为细胞(即，非福尔马林固定石蜡包埋的细胞)设计的标准方案的初始步骤，通常不能成功制备福尔马林固定石蜡包埋的样品(参见实施例18)。
在某些方面提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；d)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；e)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和f)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
在某些方面还提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；d)使所述脱蜡/再水化的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和e)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
在某些方面还提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，所述样品尚未进行脱蜡/再水化；b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述样品与细胞外基质蛋白酶接触。
在某些方面还提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，所述样品尚未进行脱蜡/再水化；b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述样品与细胞外基质蛋白酶接触。
在某些方面还提供了一种从深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供深度福尔马林固定的样品；b)使所述深度福尔马林固定的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述深度福尔马林固定的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
在某些方面还提供了一种从深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供深度福尔马林固定的样品；b)使所述深度福尔马林固定的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述深度福尔马林固定的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
在某些方面还提供了一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；d)使所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触，从而产生解离的样品；e)将所述解离的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；f)将所述裂解的样品与十二烷基硫酸钠(SDS)在74℃的温度下接触40分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和g)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂原位产生邻近连接的核酸分子，从而保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供细胞的福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；d)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；e)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和f)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供细胞的福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；d)使所述脱蜡/再水化的样品与变性洗涤剂在62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和e)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从细胞的深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供细胞的深度福尔马林固定的样品；b)使所述深度福尔马林固定的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从细胞的深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供细胞的深度福尔马林固定的样品；b)使所述深度福尔马林固定的样品与变性洗涤剂在62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供细胞的福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：a)提供细胞的福尔马林固定石蜡包埋的样品；b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与变性洗涤剂在62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从包含蛋白质:cfDNA复合物的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供包含蛋白质:cfDNA复合物的样品；b)使所述蛋白质:cfDNA复合物与相邻的蛋白质:cfDNA复合物交联；和c)使交联的蛋白质:cfDNA复合物与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了一种从包含蛋白质:cfDNA复合物的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供包含蛋白质:cfDNA复合物的样品；b)使所述样品与固相接触，从而产生与固相结合的蛋白质:cfDNA复合物；
c)使所述蛋白质:cfDNA复合物与相邻的蛋白质:cfDNA复合物或所述固相交联；和d)使交联的蛋白质:cfDNA复合物与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息。
在某些方面还提供了用于保留空间邻近连续性信息的方法，包括使用邻近连接、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)、使用或不使用固体基质的区室化、或使用Tn5四聚体。
在某些方面还提供了方法，其中对具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。在某些方面，在基于使用长距离序列连续性信息的应用中利用序列读数。
在某些方面还提供了方法，其中对具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理，以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
在某些方面还提供了方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
在某些方面还提供了包括用于执行本文所述方法的试剂的试剂盒。
在某些方面还提供了用于使为了保留空间邻近连续性信息而交联的样品中的交联快速逆转的方法。
在以下描述、实施例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方案。
附图说明
附图示出了本技术的某些实施方案，并且不是限制性的。为了清楚和便于说明，附图未按比例绘制，并且在一些情况下，可夸大或放大地示出各个方面以便于理解特定实施方案。
图1A-D显示延长染色质增溶和解压缩反应改善了福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品中空间邻近连续性信号的捕获。图1A显示了利用10μm切片以及10分钟和40分钟的反应时间的实验结果。图1B显示了利用10μm切片以及40分钟、60分钟和80分钟的反应时间的实验结果。图1C显示了利用10μm切片以及40分钟、80分钟、120分钟和180分钟的反应时间的实验结果。图1D显示了利用5μm切片以及40分钟、80分钟、120分钟和180分钟的反应时间的实验结果。
图2A和2B显示增加染色质增溶和解压缩的温度改善了对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品中空间邻近连续性信号的捕获。图2A显示了三种温度(50℃、62℃和74℃)下的5μm切片以及10分钟、40分钟和80分钟的反应时间的实验结果。图2B显示了74℃的温度下的10μm切片的10分钟、40分钟和80分钟的反应时间的实验结果。
图3显示了在74℃下染色质增溶和解压缩40分钟最佳地捕获临床人类FFPE肿瘤样品中的空间邻近连续性信号。
图4显示了不需要细胞裂解来最佳地捕获FFPE样品中的空间邻近连续性信号。
图5A和5B显示了SDS反应的时间和温度对于为了最佳地从FFPE样品捕获空间邻近连续性而进行脱蜡和再水化的需求的影响。图5A显示了当SDS反应处于62℃时，需要脱蜡和再水化以从FFPE样品中捕获空间邻近连续性信号。图5B显示了当SDS反应处于74℃和更长的持续时间时，不需要脱蜡和再水化以从FFPE样品中捕获空间邻近连续性信号。
图6显示了细胞外基质蛋白的酶促解离提高了样品使用的便利性，而不损害从FFPE样品中最佳地捕获空间邻近连续性信号。
图7说明了结合至羧化固相元素和蛋白质:cfDNA交联之后的蛋白质:cfDNA复合物。
图8说明了在交联至涂有核酸交联试剂的固相元素之后的蛋白质:cfDNA复合物。
图9说明了通过邻近连接从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。
图10说明了使用Tn5四聚体捕获以从交联的蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。
图11说明了使用Tn5四聚体来捕获交联至固相元素(例如，通过补骨脂素)的细胞游离核酸的空间邻近连续性信息。
图12说明了通过区室化和用区室特异性分子条形码进行标记而从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。
图13说明了通过用固相元素进行区室化并用区室特异性分子条形码进行标记而从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。
图14说明了使用携带虚拟区室特异性分子条形码的珠联转座体，通过虚拟区室化从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。
图15说明了通过邻近连接从FFPE样品捕获空间邻近连续性信息。
图16说明了通过SSPC方法从FFPE样品捕获空间邻近连续性信息。
图17说明了通过区室化和用区室特异性分子条形码进行标记而从FFPE样品物捕获空间邻近连续性信息。
图18显示了FFPE细胞中的染色质消化失败。
图19显示了FFPE组织上的自动化HiC。
图20显示了FFPE组织中的快速反向交联。
图21显示了使用来自FFPE细胞的全基因组HiC数据，作为突变等位基因频率和测序深度的函数的已知易位的高灵敏度发现。
图22显示了由来自FFPE细胞的靶向HiC数据实现的已知易位的高灵敏度发现。
图23A-D显示了FFPE GIST肿瘤中的易位的发现和验证。图23A显示了浅测序分析(0.75X)。图23B显示了10X下的序列分析。图23C显示了跨易位断点的扩增。图23D显示了PCR结果。
图24A-C显示了FFPE小儿室管膜肿瘤中的易位的发现。图24A显示了来自PFE细胞系的HiC数据。图24B显示了浅测序分析(0.25X)。图24C显示了PFE肿瘤的FFPE-HiC分析。
图25A-D显示了跨越存档期，在FFPE肿瘤中的易位的发现。图25A显示了浅测序分析(0.05X)。图25B显示了染色体内易位。图25C显示了chr3；chr18之间的染色体间易位。图25D显示了chr3；chr7易位之间的染色体间易位。
图26显示了来自低输入FFPE组织的高质量FFPE-HiC。
具体实施方式
本文提供了用于从特定类型的样品制备核酸的方法，所述方法保留核酸序列中的空间邻近连续性信息。可以使用短读段长测序方法(例如Illumina，长度约为500bp的核酸片段)对保留空间邻近连续性信息的核酸分子进行片段化和测序，或者可以使用长读段测序(例如，Pacific Bioscience(现为Illumina)、Oxford Nanopore或其他，长度约为30Kbp或更长的核酸片段)对保留空间邻近连续性信息的完整分子进行测序。
在某些实施方案中，样品可以是包埋在诸如石蜡(蜡)的材料中的固定样品。在一些实施方案中，样品可以是福尔马林固定样品。在某些实施方案中，样品是福尔马林固定石蜡包埋的样品。在一些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋的样品可以是组织样品或细胞培养样品。在一些实施方案中，组织样品已从患者身上切除并且可能患病或受损。在一些实施方案中，不知道组织样品患病或受损。在某些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋的样品可以是福尔马林固定石蜡包埋的切片、块、卷轴(scroll)或载玻片。在某些实施方案中，样品可以是如下文所述的深度福尔马林固定的样品。
在某些实施方案中，在固体表面上提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，并且在固体表面上进行制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法。在一些实施方案中，固体表面是病理玻片。在一些实施方案中，还在固体表面上进行额外的下游反应。
本领域技术人员熟悉可替代需要离心的步骤并获得可比较的结果但在固体表面上进行的方法。
通常很难从FFPE样品中获得质量允许进行空间邻近分析(例如HiC分析)的少量的DNA(输入DNA)。在某些实施方案中，利用本文描述的优化方案，从FFPE样品或深度福尔马林固定的样品中提取DNA，即使是少量的，其产生可用于稳健的空间邻近分析和用于其他应用的足够的长距离顺式读数(参见图26)。在某些实施方案中，从样品中提取的输入DNA小于200ng。在某些实施方案中，从样品中提取的输入DNA的量小于160ng、小于120ng、小于80ng、小于40ng、小于20ng、小于10ng、小于5ng、小于2ng或小于1ng。
已知延长的FFPE存档期或延长的深度福尔马林固定存档期会降解DNA，并使基因组分析在技术上更具挑战性，因此在为FFPE样品和深度福尔马林固定的样品开发稳健的基因组分析方法时，这是用于评估的关键参数。在某些方面，利用本文描述的优化方案，从长存档期中获得DNA，其产生可用于稳健的空间邻近分析和用于其他应用的足够的长距离顺式读数(参见图25A-D)。在一些实施方案中，延长的存档期大于约1年、大于约4年、大于约10年、大于约20年、大于约30年、大于约40年、大于约50年、大于约60年或大于约70年，或有时约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80年。在某些实施方案中，样品具有约4年至约20年的存档期。在某些实施方案中，样品具有约20年至约70年的存档期。在一些实施方案中，如果样品质量低，那么存档期可以小于约4年、小于约3年、小于约2年或小于约1年，即样品的DNA被降解到在更长存档期的样品中经常观察到的程度。
在某些实施方案中，将福尔马林固定石蜡包埋的样品脱蜡。脱蜡可以通过将福尔马林固定石蜡包埋的样品与任何已知的溶解蜡的试剂接触来进行。在一些实施方案中，试剂是溶剂。在一些实施方案中，溶剂是有机溶剂。在一些实施方案中，溶剂是二甲苯。在一些实施方案中，溶剂是甲苯、苯或任何其他合适的溶剂。在一些实施方案中，试剂是无毒试剂，包括但不限于矿物油，或具有低毒性的试剂，包括但不限于柠檬烯。
在某些实施方案中，将脱蜡的福尔马林固定石蜡包埋的样品再水化。在某些实施方案中，脱蜡的样品通过与乙醇(或可用于从样品中除去溶剂的任何试剂)接触而再水化，并重悬浮在水或合适的缓冲液中。
在一些实施方案中，脱蜡/再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品在与变性洗涤剂接触之前与裂解缓冲液接触。如本文所用，术语“裂解缓冲液”是指能够裂解细胞膜的缓冲溶液。裂解缓冲液通常包含盐、蛋白酶抑制剂和非离子非变性洗涤剂，并且是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，裂解缓冲液是低渗的。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含非离子非变性洗涤剂。在一些实施方案中，非离子非变性洗涤剂是IGEPAL或等效的洗涤剂。在某些实施方案中，裂解缓冲液不包含蛋白酶。
在某些实施方案中，脱蜡/再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品在与变性洗涤剂接触之前不与裂解缓冲液接触。不受理论的束缚，是否需要裂解缓冲液可能取决于福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的厚度。在某些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的厚度为约5至约10μm。在某些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的厚度为约5μm或更小。厚度约5μm的组织切片小于细胞核的厚度。不受理论的束缚，厚度约5μm的组织切片切过细胞核并提供进入细胞核内部的直接通路，因此可能不需要细胞裂解。当在高温(例如，高于65℃)和/或超过10分钟的情况下与变性洗涤剂接触时，也可能不需要裂解缓冲液。
在某些实施方案中，没有专门用于解离或分解样品组织的试剂。例如，没有用蛋白酶进行酶促解离。
在某些实施方案中，将脱蜡/再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品与蛋白酶接触。在某些实施方案中，脱蜡/再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品在与其他试剂(例如裂解缓冲液、变性洗涤剂)接触之前与蛋白酶接触。在一些实施方案中，蛋白酶是解离样品组织的细胞外基质(ECM)蛋白酶。在一些实施方案中，细胞外基质蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。在某些实施方案中，胶原酶是Coll、ColIII或ColIV。在一些实施方案中，分散酶是分散酶I(中性蛋白酶I)。不受理论的束缚，蛋白酶可以解离样品中的细胞外基质蛋白，从而提高样品的处理和转移的便利性。
在一些实施方案中，将脱蜡/再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品与变性洗涤剂接触。如本文所用，术语“变性洗涤剂”是指阴离子或阳离子洗涤剂。在某些实施方案中，洗涤剂可以是十二烷基硫酸钠(SDS)。
如本文所用，术语“增溶和解压缩的样品”是指与变性洗涤剂接触并具有以下一种或多种特征的样品：透化核、去凝聚的染色质(解压缩的)和/或具有保留的空间邻近连续性信息的增溶的染色质。
在一些实施方案中，与变性洗涤剂接触超过约10分钟、或约15至约80分钟、约20至约60分钟、超过10分钟至约40分钟、约30至约50分钟、约35分钟至约45分钟，或有时约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80分钟。在一些实施方案中，与变性洗涤剂接触约40分钟。在一些实施方案中，与变性洗涤剂接触40分钟。
在一些实施方案中，与变性洗涤剂的接触在约65℃至约90℃、约70℃至约80℃或有时约65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90℃的温度下。在某些实施方案中，温度为74℃。在一些实施方案中，与洗涤剂的接触是在高于65℃的温度、高于65℃且低于80℃的温度、在70℃和80℃之间的温度、或在约74℃的温度下。在一些实施方案中，样品是组织样品。
在一些实施方案中，样品包含细胞，并且与变性洗涤剂的接触是在约62℃的温度下超过10分钟。在一些实施方案中，样品包含细胞，并且与变性洗涤剂的接触是在约62℃的温度下持续40分钟。
在某些实施方案中，样品包含组织，并且与变性洗涤剂的接触是在约74℃的温度下持续40分钟。
在某些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋的样品未经过脱蜡和再水化。在一些实施方案中，未经过脱蜡和再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品与裂解缓冲液接触，并且裂解的样品与变性洗涤剂接触。在一些实施方案中，未经过脱蜡和再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品不与裂解缓冲液接触，而是直接与变性洗涤剂接触。在某些实施方案中，未经过脱蜡和再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品是组织样品，其在高于65℃的温度下与变性洗涤剂接触。在一些实施方案中，温度为74℃。在某些实施方案中，未经过脱蜡和再水化的福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的厚度为约5至约10μm。在某些实施方案中，未经过脱蜡和再水化的福尔马林固定石蜡包埋的组织切片的厚度为约5μm或更小。
在某些实施方案中，未经过脱蜡和再水化的福尔马林固定石蜡包埋的样品设置在固体表面上。在一些实施方案中，固体表面是病理玻片。
在一些实施方案中，使用福尔马林深度固定样品，但没有进行石蜡包埋。例如，一些手术样品用福尔马林固定并保存在液体溶液中。
因此，此类深度福尔马林固定的样品不需要脱蜡和/或再水化，但通常与FFPE样品一样处理。
在一些实施方案中，将深度福尔马林固定的样品与裂解缓冲液(如本文所述)接触并且将裂解的样品与变性洗涤剂接触。在一些实施方案中，深度福尔马林固定的样品不与裂解缓冲液(如本文所述)接触并且样品与变性洗涤剂接触。在一些实施方案中，将深度福尔马林固定的样品与蛋白酶接触。
在某些实施方案中，使用所描述的方法处理经过和不经过脱蜡/再水化的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品和深度福尔马林固定的样品，以产生增溶和解压缩的样品，其与一种或多种保留样品核酸中的空间邻近连续性信息的试剂接触。在某些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品和深度福尔马林固定的样品是组织样品。在某些实施方案中，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品和深度福尔马林固定的样品是细胞样品。无论样品类型如何，都使用了相同的保留空间邻近连续性信息的试剂。
如本文所用，术语“保留空间邻近连续性信息的试剂”是指当与染色质中的和/或作为核基质的一部分的蛋白质结合时，捕获并保留核酸表现出的天然空间构象的试剂及其使用方法。空间邻近连续性信息可以通过邻近连接、通过固体基质介导的邻近捕获(SSPC)、通过使用或不使用固体基质的区室化或通过使用Tn5四聚体来保留。
在一些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的试剂是产生邻近连接的核酸分子的试剂，所述邻近连接的核酸分子在包括邻近连接的方法中使用。邻近连接法是通过连接以产生连接产物从而捕获天然存在的空间邻近核酸分子的方法。在一些实施方案中，产生邻近连接的核酸分子的试剂可包括限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。在某些实施方案中，有两种限制性核酸内切酶。
图15显示了通过PL(邻近连接)方法从FFPE样品捕获空间邻近连续性信息。PL方法从(i)核酸源(例如FFPE样品)内的天然空间邻近核酸(nSPNA)开始，然后是(ii)消化(例如通过RE)和连接以产生连接产物(LP)。请注意，对于已经高度片段化的FFPE样品，可能不需要DNA消化。从广义上讲，PL方法分为基于3C和基于HiC，尽管PL有许多特定的变体。在3C(iii)中，将多个LP片段化，制备为短核酸模板并准备好用于测序。在HiC(iv)中，将消化的核酸末端标记(例如生物素化)，然后连接以产生经标记的连接产物(MLP，MLP是LP的一种表现)，所述连接产物在连接接头(ligation junction，LJ)处带有亲和纯化标记物。在将多个MLP片段化后，使用亲和纯化来富集包含LJ的MLP片段，并且将此类片段制备为核酸模板并准备好用于测序——即，富集来自MLP的包含至少一个LJ的片段化核酸并制备为模板并在HiC中测序，以消耗uMLP(通常不表现LJ的未连接MLP)。
进行邻近连接的方法是本领域已知的。例如，在HiC方法中，步骤通常包括：(1)用限制酶消化增溶和解压缩的样品的染色质(或片段化)；(2)通过用生物素化核苷酸填充5'-突出端来标记消化的末端；和(3)连接空间邻近的消化的末端，从而保留空间邻近连续性信息。一旦空间邻近连续性信息被保留，HiC方法的进一步的步骤包括：纯化和富集经生物素标记的连接接合片段，从富集的片段中制备文库并对文库进行测序。(参见Lieberman-Aiden等人,US2017/0362649,Lieberman-Aiden等人,Science 326,289-293(2009),Dekker等人,(美国专利号9434985))。(参见图15)。邻近连接方法的另一个实例通常包括以下步骤：(1)用限制酶消化增溶和解压缩的样品的染色质(或片段化)；(2)钝化经消化或片段化的末端或省略钝化程序；和(3)连接空间邻近的的末端，从而保留空间邻近连续性信息。一旦空间邻近连续性信息被保留，进一步的步骤可包括：使用尺寸选择来纯化和富集连接的片段(其代表连接接合片段)，从富集的片段中制备文库并对文库进行测序。
在一些实施方案中，邻近连接的核酸分子是原位产生的。如本文所用，术语“原位”是指核内(参见美国申请US2017/0362649)。
邻近连接方法包括但不限于3C(Dekker等人,Science 295,1306-1311(2002))、4C(Simonis等人,Nature Genetics 38,1348-1354(2006),De Laat等人,(U.S.8642295))、5C(Dostie等人,Genome Research 16,1299-1309(2006),Dekker等人,(US 9273309))、HiC(Lieberman-Aiden等人,US2017/0362649,Lieberman-Aiden等人,Science 326,289-293(2009),Dekker等人,(美国专利号9434985))、TCC(Kalhor等人,Nature Biotechnology30,90-98(2012),Chen等人,(US20110287947))、4C-seq(Van de Werken等人,NatMethods.(2012))、ChIA-PET(Ruan等人,US 8071296)、HiChIP(Mumbach等人,Nat Methods.(2016))、PLAC-seq(Fang等人,Cell Research(2016))、Capture-C(Hughes等人,NatureGenetics(2014))、Capture-HiC(Jager等人,Nature Communications,2015)或其他方法或方法组合。
不管具体的PL方法如何，所有PL方法都以连接产物的形式捕获空间邻近连续性信息，从而在两个天然空间邻近的核酸之间形成连接接头。一旦形成LP，就使用下一代测序来检测空间邻近连续性信息，从而对一个或多个连接接头(来自整个LP或LP的片段)进行测序(如本文所述)。借助这些序列信息，可以得知来自给定连接产物(或连接接头)的核酸分子是天然的空间邻近核酸。
在一些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的试剂是包含固体基质的试剂，所述固体基质与增溶和解压缩的样品的核酸形成复合物并且用于包括固体基质介导的邻近捕获(SSPC)的方法中。SSPC方法包括引入用表面分子官能化的外源固体基质，所述表面分子通过与天然存在的空间邻近核酸分子结合来捕获它们。在固体基质介导的邻近捕获(SSPC)的一些实施方案中，在样品被增溶和解压缩之前，样品与固体基质接触，所述固体基质与样品的核酸形成复合物。
图16说明了通过SSPC方法从FFPE样品捕获空间邻近连续性信息。SSPC方法包括引入用表面分子官能化的外源固体基质，所述表面分子通过结合nSPNA来捕获它们。在所有情况下，都将固体基质引入核酸源(例如FFPE样品)中，并且在(i)中，将固体基质用核酸交联剂官能化，使得固体基质的表面化学结合到与其物理接触的nSPNA。在(ii)中，首先用亲和纯化标记物标记核酸源的核酸，然后引入用亲和纯化分子官能化的固体基质，使得固体基质的表面化学结合到与其物理接触的经标记的nSPNA。在(iii)中，固体基质用带有条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化，使得每个固体基质都有自己的一组独特条形码化的寡核苷酸，并且使得当固体基质的表面与nSPNA物理接触时，条形码化的寡核苷酸被整合到nSPNA中。
如本文所用，术语“固体基质”是指例如珠子或其他小的固相颗粒或表面。
在某些实施方案中，固体基质是用核酸交联剂官能化(例如，涂覆)的固体基质(参见图16，左图)。固体基质的表面化学结合至与其物理接触的天然存在的空间邻近核酸分子。交联剂是本领域已知的。在一些实施方案中，交联试剂是补骨脂素。空间邻近连续性信息通过区室化(见下文)和用独特的区室特异性分子条形码对与常见固相基质结合的分子进行标记(见下文)来保留。
在一些实施方案中，首先用亲和纯化标记物(例如生物素)标记核酸，并用能够结合亲和纯化标记物(例如链霉亲和素)的亲和纯化分子对固体基质进行官能化(参见图16，中图)。与上述基于交联的SSPC方法类似，空间邻近连续性信息通过区室化和用独特的区室特异性分子条形码对与常见固相基质结合的分子进行标记(见下文)来保留。
在某些实施方案中，固体基质用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶(例如，Tn5)官能化。每个固体基质自己都有一组独特条形码化的寡核苷酸，使得当固体基质的表面与增溶和解压缩的样品中的核酸分子发生物理接触时，条形码化的寡核苷酸会整合到核酸分子中，从而保留空间邻近连续性信息(参见图16，右图)。这是“虚拟”区室化的一个实例，因为固定在固体基质上的独特条形码化的转座酶可以被认为代表它自己的“虚拟”区室，转座酶中有一组代表空间邻近连续性信息的独特条形码化的核酸分子(例如在CPT-seqV2中(Zhang等人,Nature biotechnology 35,852-857(2017))。进行标记完成后，转座体蛋白通常会变性，因此将从连接珠子的转座体中释放出条形码化的空间邻近核酸分子。在一些实施方案中，变性是通过与洗涤剂(例如，0.2％SDS，在约55℃下持续15-30分钟)接触或与离液盐(例如，盐酸胍)接触。在一些实施方案中，在释放条形码化的空间邻近核酸分子之后，去除珠子并纯化核酸(见下文)。
如本文所用，术语“区室化”是指将保留空间邻近连续性信息的多个核酸划分成多个离散区室使得每个区室被分配有亚单倍体数量的核酸的行为。在“物理”区室化的情况下，可以将多个核酸划分成离散的物理空间(即区室)，这些物理空间被禁止与其他区室混合。此类物理区室可能是微量滴定板的孔(例如，像在CPT-Seq中那样(Adey等人,GenomeResearch 24,2041-2049(2014)和Amini等人,Nature Genetics 46 1343-1349(2014)))、微流体液滴(例如，像在10XGenomics中那样(Zheng等人,Nature Biotechnology 34,303-311(2016)))或其他区室化试剂。通过亲和纯化分子和亲和纯化标记物的相互作用交联至固体基质或结合至固体基质的天然存在的空间邻近核酸分子可以用来进行区室化。交联或结合至常见固相基质上的空间邻近核酸分子可以被捕获在液滴中(因此被区室化)。在一些实施方案中，区室化不需要空间邻近核酸分子与固体基质结合。
如本文所用，术语“进行标记”是指物理整合独特的分子标识符(即分子条形码，定义如下)作为保留空间邻近连续性信息的核酸的一部分(或在其扩增子中)。如本文所述，分子条形码可以使用将独特条形码化的寡核苷酸整合到核酸分子中的转座酶或者通过诸如引物延伸聚合(PEP)的技术整合到目的核酸中，在引物延伸聚合中聚合酶和包含分子条形码的引物与核酸分子粘接并沿着核酸分子延伸，从而产生与条形码化的引物核酸连续的核酸分子扩增子。还描述了进行标记的替代形式，包括将包含分子条形码的寡核苷酸连接到核酸分子的末端。空间邻近核酸分子的进行标记可以用与固体基质结合的空间邻近核酸分子来进行。
如本文所用，术语“分子条形码”是指独特可识别的核酸序列，其独特地告知引入分子条形码的环境。例如，当分子条形码被整合到核酸分子中并随后被测序时，在测序读数中表现出的分子条形码告知与核酸分子结合的区室或虚拟区室，因此包含空间邻近连续性信息。
通常，在区室化和进行标记之后，区室(例如，液滴)会合并在一起(例如，液滴会破裂并组合成单个混合样品)，并且任何蛋白质都可以变性(例如ProK处理)以从固体基质释放空间邻近核酸分子。如果珠子是磁性的，则固体基质(例如珠子)可以通过磁性去除，或者如果珠子不是磁性的，则固体基质可以粒化。空间邻近核酸分子将使用标准方法(例如乙醇沉淀、SPRI珠、Qiagen柱等)进行纯化。
无论具体的SSPC方法如何，所有SSPC方法都捕获区室特异性或虚拟区室特异性的分子条形码中的空间邻近连续性信息。一旦形成SSPC产物，就使用DNA测序检测空间邻近连续性信息，由此对两个或更多个共同的分子条形码序列和连续邻接的核酸进行测序(如本文所述)。借助这些序列信息，可以得知与共同的分子条形码连接的核酸分子是天然的空间邻近核酸。
在一些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的试剂是在不存在固体基质的情况下进行区室化通过附着区室特异性分子条形码(如前所述)和进行标记的试剂。在一些实施方案中，区室特异性的条形码化的寡核苷酸通过连接而附着于天然的空间邻近核酸分子上。在一些实施方案中，区室特异性的条形码化的寡核苷酸通过引物延伸反应而附着于天然的空间邻近核酸分子上。
图17说明了通过区室化和用区室特异性分子条形码进行标记而从FFPE样品物捕获空间邻近连续性信息。在所述方法的一个实施方案中，所述方法开始于(i)天然空间邻近核酸(nSPNA)，然后是(ii)将交联的nSPNA区室化并引入区室特异性分子条形码，例如连接区室特异性的条形码化的寡核苷酸。最后(iii)，将条形码化的模板分子纯化并制备为核酸模板，并准备好用于测序，由此分子条形码是nSPNA在空间上接近的分子标识符。
类似于SSPC方法，使用DNA测序检测空间邻近连续性信息，由此对两个或更多个共同的分子条形码序列和连续邻接的核酸进行测序(如本文所述)。借助这些序列信息，可以得知与共同的分子条形码连接的核酸分子是天然的空间邻近核酸。
在某些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的试剂包含Tn5四聚体(参见Lai等人,Nature Methods.第15卷,2018年9月,741-747)。涉及使用Tn5四聚体(如本文所述)的方法以Tn5介导的成环产物的形式捕获空间邻近连续性信息，由此在两个天然空间邻近核酸之间形成由Tn5接头寡核苷酸介导的物理连接。一旦形成Tn5介导的成环产物，就从Tn5中释放核酸(参见以上讨论)，使用DNA测序检测空间邻近连续性信息，从而对给定Tn5接头寡核苷酸两侧的核酸进行测序(如本文所述)。借助这些序列信息，可以得知来自给定的Tn5介导的成环产物的核酸分子是天然的空间邻近核酸(参见下文的详细说明)。
在某些实施方案中，本文所述方法的一个或多个步骤使用自动化设备进行(参见实施例19)。在一些实施方案中，本文所述方法的基本上所有步骤均使用自动化设备进行。
在某些实施方案中，如本文所述，对来自福尔马林固定石蜡包埋或深度福尔马林固定的样品的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。在一些实施方案中，测序是处于30X或更小的深度。在一些实施方案中，测序是处于15X或更小、10X或更小、5X或更小、1X或更小、0.75X或更小、0.5X或更小、0.1X或更小、0.05X或更小或0.01X更小的深度。
当通过保留空间邻近连续性信息的方法(例如，邻近连接方法，如HiC)进一步分析时，使用本文所述的方法从FFPE样品或深度福尔马林固定的样品制备的DNA模板的质量的一种度量是长距离顺式读数(长距离)读数的百分比。在一些实施方案中，用于评估质量的标准是>40％的映射去重复读数代表至少15kb的长距离读数。在一些实施方案中，取决于样品的特性，例如存档期的范围，标准可能低于大于40％，例如约20％至25％的长距离读数(参见图25A)。此类读数能够在低测序深度下鉴定易位(参见图25B-D)。在一些实施方案中，标准是大于15kb的大于35％、30％、25％、20％或15％的长距离读数。在某些实施方案中，长距离读数被定义为长度为100kb-1Mb、>20kb、>10kb、>5kb或>1kb，并且长距离读数的相应百分比将根据长距离读数的定义而改变。使用本文所述的方法从FFPE样品或深度福尔马林固定的样品制备的DNA模板的长距离读数百分比大于不使用所述方法进行增溶和解压缩(例如，在高于65℃的温度下与变性洗涤剂接触，在高于65℃的温度下与变性洗涤剂接触超过10分钟，在74℃的温度下与变性洗涤剂接触40分钟，在约62℃的温度下与变性洗涤剂接触超过10分钟，在62℃的温度下与变性洗涤剂接触40分钟)而制备的样品。
在某些实施方案中，用于测量DNA模板质量的其他度量包括频率、灵敏度、特异性、假阳性率等的测量值，例如当鉴定易位时。
在某些实施方案中，通过在降低的温度下与蛋白酶K(ProK)一起孵育缩短的时间段来逆转交联。在一些实施方案中，温度低于68℃且时间为约30分钟。在一些实施方案中，温度为约55℃。在一些实施方案中，温度为55℃(参见实施例20)。
在某些实施方案中，通过在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育样品约1小时来逆转交联。在一些实施方案中，通过在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育样品1小时来逆转交联。
在一些实施方案中，样品包含溶液形式的蛋白质:cfDNA(蛋白质:细胞游离DNA)复合物。如本文所用，术语“蛋白质:cfDNA复合物”是指非原位的，即不在细胞或细胞核中的蛋白质:DNA复合物。蛋白质:cfDNA复合物包括但不限于包裹在例如核小体(DNA包裹在组蛋白核心周围)、染色体、转录因子或其他核蛋白的核蛋白周围或与核蛋白结合的DNA。在一些实施方案中，包含蛋白质:cfDNA复合物的样品可以是血清、血浆、尿液或其他体液。
在一些实施方案中，将包含蛋白质:cfDNA复合物的样品与固相接触。固相或固相元素可以是可以与蛋白质:cfDNA复合物结合或可以被官能化以与蛋白质:cfDNA复合物结合的任何固相。在一些实施方案中，固相是微板或珠子。
在某些实施方案中，固相的表面被官能化以结合蛋白质。在一些实施方案中，固相被羧化。固相可以用能够与蛋白质结合的其他合适的试剂进行官能化。在某些实施方案中，固相是羧化珠或羧化微板。与固相元素共结合的蛋白质:cfDNA形式的天然空间邻近核酸分子发生交联。在某些实施方案中，与羧化固相结合的蛋白质:cfDNA复合物通过与交联剂接触而交联到空间和邻近结合的蛋白质:cfDNA复合物。在某些实施方案中，交联试剂是甲醛。可以使用其他合适的交联试剂。在一些实施方案中，与固相元素共结合的交联蛋白质:cfDNA形式的天然空间邻近核酸分子从固相释放(例如，通过酰胺水解反应)。
图7显示了结合至羧化固相元素和经历蛋白质:DNA交联之后的蛋白质:cfDNA复合物。在一个实施方案中，将来自血浆的共结合循环蛋白质:cfDNA复合物固定到结合蛋白质的羧化表面(例如COOH-NH2)，然后彼此交联以保持nSPNA(天然存在的空间邻近核酸分子)在空间上接近。如果进行标准交联，则在交联之前与固相元素结合可通过在溶液中随机碰撞来减少非nSPNA相互交联的机会。这种方法还可以洗掉未与蛋白质结合的自由漂浮的cfDNA，因为羧化表面仅结合蛋白质。
在某些实施方案中，蛋白质:cfDNA复合物与涂有交联试剂的固相结合并与固相交联。在一些实施方案中，交联试剂是补骨脂素。可以使用其他核酸交联剂。
图8显示了在交联至涂有核酸交联剂的固相元素之后的蛋白质:cfDNA复合物。在一个实施方案中，来自血浆的共结合的蛋白质:cfDNA复合物通过核酸交联被固定到固相元素上，其将蛋白质:cfDNA复合物的DNA结合到其表面上。如果进行标准交联，则通过与固相结合介导的交联可减少非nSPNA在溶液中随机发生交联的机会。这种方法还可以去除蛋白质，因为蛋白质可以降解(例如蛋白酶K处理)，同时留下与固相元素结合的DNA。
在一些实施方案中，使彼此交联或与固相交联的蛋白质:cfDNA复合物与一种或多种保留样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息的试剂接触。
在某些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。在一些实施方案中，亲和纯化标记物被掺入交联的蛋白质:cfDNA复合物中。在某些实施方案中，亲和纯化标记物是生物素化的核苷酸。在一些实施方案中，连接蛋白质:cfDNA复合物的空间邻近的细胞游离DNA以产生连接产物。在一些实施方案中，分离出连接产物。在一些实施方案中，通过亲和纯化分离出连接产物。在一些实施方案中，亲和纯化是连接接头的生物素:链霉亲和素富集。在某些实施方案中，连接产物不包含亲和纯化标记物(例如，生物素化核苷酸)并且通过尺寸选择被分离。尺寸选择包括但不限于SPRI珠子和凝胶纯化。在某些实施方案中，产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。在一些实施方案中，有两种限制性核酸内切酶。
图9显示了通过邻近连接从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。在所述方法的一个实施方案中，(i)来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)与固相元素共结合并交联。然后是(ii)邻近连接以产生连接产物(LP)，其在连接接头处可能具有亲和纯化标记物(例如掺入的生物素化核苷酸)。当描述HiC时，PL方法细分为基于3C和基于HiC，并且PL有许多特定的变体(如本文所述)。在HiC(iv)中，将细胞游离的核酸末端标记(例如生物素化)，然后连接以产生经标记的连接产物(MLP，MLP是LP的一种表现)，所述连接产物在LJ处带有亲和纯化标记物。在MLP产生之后，使用亲和纯化来富集包含LJ的MLP，并且将此类片段制备为核酸模板并准备好用于测序—即，富集来自包含至少一个LJ的MLP的核酸并制备为模板并在HiC中测序，以消耗uMLP(通常不表现LJ的未连接MLP)。
当蛋白质:cfDNA复合物与固相交联时，邻近连接也可用于保留空间邻近连续性信息。
在某些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包含Tn5四聚体(参见Lai等人,Nature Methods.第15卷,2018年9月,741-747)。在一些实施方案中，Tn5四聚体具有生物素化的接头序列。在一些实施方案中，通过亲和纯化分离经标记的Tn5介导的环。在一些实施方案中，亲和纯化是经标记的Tn5介导的环的生物素:链霉亲和素富集。在某些实施方案中，通过尺寸选择分离Tn5介导的环。尺寸选择包括但不限于SPRI珠子和凝胶纯化。
图10显示了通过Tn5介导的环化从结合至固相的蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。在一个实施方案中，(i)来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)与固相元素共结合并交联。随后是(ii)引入Tn5四聚体，其包含通过接头序列连接的两个Tn5二聚体，所述接头序列包含面向内的镶嵌末端(mosaic end，ME)序列。然后(iii)，通过Tn5四聚体在两个共结合的蛋白质:cfDNA复合物上进行标记，在nSPNA之间建立寡核苷酸连接，其中生物素标记成功的共标记事件。最后(iv)，一旦片段与Tn5分离，就使用亲和纯化来富集经标记的Tn5介导的环，并将片段制备为核酸模板并准备好用于测序。
图11显示了通过Tn5介导的环化从交联至固相元素的蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。在一个实施方案中，(i)来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)与固相元素交联。然后是(ii)降解蛋白质，留下与固相元素交联的cfDNA。随后是(iii)引入Tn5四聚体，其包含通过接头序列连接的两个Tn5二聚体，所述接头序列包含面向内的镶嵌末端(ME)序列。然后(iv)，通过Tn5四聚体在两个共交联的cfDNA分子上进行标记，在nSPNA之间建立寡核苷酸连接，其中生物素标记成功的共标记事件。最后(v)，使用亲和纯化来富集经标记的Tn5介导的环，并将此类片段制备为核酸模板并准备好用于测序。
在一些实施方案中，保留样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息的一种或多种试剂与其中来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)结合至固相元素(而不是交联至固相元素)的方法一起使用。试剂可包括以下一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸、连接酶和具有生物素化接头序列的Tn5四聚体。
在一些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括将从固体载体释放的细胞游离DNA蛋白质复合物区室化并用区室特异性的条形码化寡核苷酸对区室化的细胞游离DNA蛋白质复合物进行标记的试剂。在一些实施方案中，进行标记是通过在区室特异性的条形码化测序接头上连接进行的。在一些实施方案中，进行标记是通过使用区室特异性的条形码化引物退火和延伸进行的。在一些实施方案中，进行标记是通过携带区室特异性分子条形码的转座体进行的。试剂可以包括液滴发生器、条形码化的寡核苷酸、连接酶、DNA聚合酶和核苷酸中的一种或多种。
图12显示了通过区室化和用区室特异性分子条形码进行标记而从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。在一个实施方案中，(i)来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)与固相元素共结合并交联。随后(ii)从固相元素中分离交联的蛋白质:cfDNA复合物。然后(iii)对交联的蛋白质:cfDNA复合物进行区室化并引入区室特异性分子条形码，例如连接区室特异性的条形码化寡核苷酸。最后(v)，将条形码化的模板分子纯化并制备为核酸模板，并准备好用于测序，由此分子条形码是nSPNA在空间上接近的分子标识符。
在一些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括亲和纯化蛋白质:cfDNA复合物、区室化经亲和纯化的蛋白质:cfDNA复合物并用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂。在一些实施方案中，进行标记是通过在区室特异性的条形码化测序接头上连接进行的。在一些实施方案中，进行标记是通过将区室特异性的条形码化PCR引物退火并延伸引物进行的。在一些实施方案中，进行标记是通过携带区室特异性分子条形码的转座体进行的。
图13显示了通过用固相元素进行区室化并用区室特异性分子条形码进行标记而从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。在一个实施方案中，(i)来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)与固相元素共结合并交联。随后(ii)从固相元素中分离交联的蛋白质:cfDNA复合物。然后是(iii)亲和纯化，例如使用链霉亲和素包被的珠子，然后对结合至固相元素的交联的蛋白质:cfDNA复合物进行区室化，从而将区室特异性分子条形码标记到cfDNA。最后(iv)，将条形码化的模板分子纯化并制备为核酸模板，并准备好用于测序，由此分子条形码是nSPNA在空间上接近的分子标识符。
在一些实施方案中，保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括结合至固相的Tn5。在一些实施方案中，固相是珠子。在某些实施方案中，Tn5包括虚拟区室特异性分子条形码。
图14显示了使用携带虚拟区室特异性分子条形码的珠联转座体，通过虚拟区室化从蛋白质:cfDNA复合物捕获空间邻近连续性信息。在一个实施方案中，(i)来自细胞游离核酸来源(例如血浆)的天然空间邻近核酸(nSPNA)与固相元素共结合并交联。随后(ii)从固相元素中分离交联的蛋白质:cfDNA复合物。然后(iii)用携带独特分子条形码的珠联转座体进行标记，从而创建虚拟区室。最后(iv)，将条形码化的模板分子纯化并制备为核酸模板，并准备好用于测序，由此分子条形码是nSPNA在空间上接近的分子标识符。
通过本文所述方法从FFPE样品、深度福尔马林固定的样品或包含蛋白质:cfDNA复合物的样品制备的核酸结合邻近连接方法(例如HiC、3C、4C、5C)或其他捕获空间邻近连续性信息的方法产生了关于例如单体型分型和基因组重排检测的应用的保留连续性的测序数据。例如，Selvaraj等人,BMC Genomics(2015)、Selvaraj等人,Nature Biotechnol(2013)和PCT/US2014/047243描述了单体型分型的HiC数据，并且Engreitz等人,(PLOS ONE2012年9月/第7卷/第9期/e44196)描述了人类疾病的基因组重排分析的HiC数据。其他几篇论文描述了使用HiC数据进行基因组重排检测(Dixon等人,Nature Genetics(2018)；Chakraborty和Ay,Bioinformatics(2018)；Harewood等人,Genome Biology(2017))。这样的一种用于重排检测的分析工具是Dixon等人,Nature Genetics,2018的HiC-Breakfinder工具(https://github.com/dixonlab/hic_breakfinder)。例如，如实施例21中所述，FFPE-HiC数据可用于鉴定在不同测序深度(15X、5X和1X)下表现出一系列突变等位基因频率(50％至10％)的样品中的易位。此外，如实施例22中所述，可以通过将Capture-HiC应用于其断点未被捕获测序探针捕获的处理过的FFPE样品来检测易位。其他实现连续性保留的分析和应用包括但不限于基因组和宏基因组从头组装、结构变异检测等。
在实施例23和实施例24中描述了实验，所述实验证明了制备FFPE肿瘤组织样品的所述方案结合用于发现肿瘤组织样品中的易位的HiC的价值。
在一些实施方案中，在PCR和测序之前，通过本文所述的方法产生的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸与亚硫酸氢盐试剂接触，以使得能够以碱基分辨率同时分析空间邻近性和DNA甲基化。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐试剂是亚硫酸氢钠。
在一些实施方案中，使用如前所述的HiC方案产生HiC连接产物(Rao等人,Cell,2014,Li等人,Biorxiv 2018)。将DNA剪切成大约400bp的长度，并使用链霉亲和素珠子富集连接接头。如前所述(Rao等人,Cell,2014)，当DNA附着至链霉亲和素珠子时，随后构建Illumina文库构建。紧接着接头连接之后，使用本领域已知的方法对DNA进行亚硫酸氢盐转化。在亚硫酸氢盐转化之前，以0.5％的浓度掺入未甲基化的λDNA以估算转化率。将经过亚硫酸氢盐转化的DNA纯化，扩增和测序。
在一些实施方案中，剪切的HiC连接产物用亚硫酸氢盐试剂处理并纯化(Stamenova,Biorxiv,2018)。然后使用链霉亲和素珠子富集连接接头。然后从珠子上分离DNA，并使用本领域已知的将ssDNA转化为dsDNA测序文库的技术制备为测序文库。然后对接头连接的分子进行文库扩增和测序。
亚硫酸氢盐转化方法或这些方法的衍生物可以应用于包含使用本文所述的方法(例如，邻近连接、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)、区室化和进行标记以及使用Tn5四聚体)从FFPE、深度固定或蛋白质:cfDNA样品获得的空间邻近连续性信息的核酸分子。
测序后，可以使用本领域已知的方法在空间邻近性和长距离序列连续性的背景下分析数据，例如但不限于使用告知基因组折叠模式的空间邻近连续性信息(Lieberman-Aiden,Science,2009)和基因组重排分析(Dixon等人,Nature Genetics,2018)。类似地，本领域已知的方法也可用于分析DNA甲基化状态(Lister等人,Nature,2009；Shultz等人,Nature,2015)。此外，本领域已知的方法也可用于同时分析与3D基因组折叠相关的DNA甲基化状态(Li等人,Biorxiv2018；Stamenova,Biorxiv,2018)，从而并行地揭示DNA化学修饰特性和DNA折叠模式。特别是在将这种方法应用于蛋白质:cfDNA复合物的情况下，本领域众所周知，细胞游离核酸的DNA甲基化状态可以为来源组织分析以及其他几种cfDNA分析提供信息，所述其他几种cfDNA分析包括但不限于肿瘤DNA的无创检测、产前诊断和器官移植监测(Zeng等人,Journal of Genetics and Genomics,2018；Lehmann-Werman等人,PNAS,2016)。此外，与DNA甲基化状态类似，DNA折叠模式也是组织类型特异性的，因此从cfDNA:蛋白质复合物获得的HiC信号也可能有助于此类无创cfDNA分析，例如癌症诊断和器官移植监测。此外，由于已知HiC信号独特地捕获长距离序列连续性信息以显著增强基因组重排分析(Dixon等人,Nature Genetics,2018)，因此应用于cfDNA:蛋白质复合物的HiC可以从液体活检样品中富集此类基因组重排信号，并极大地有益于早期无创癌症诊断。最后，DNA甲基化以及DNA空间邻近性和长距离连续性的组合和并行分析将协同作用以更好地实现本文所述的分析。
在一些实施方案中，提供了用于实施本文所述方法的试剂盒。试剂盒通常包括一个或多个容器，其中包含一种或多种本文所述的组分。试剂盒包括处于任何数量的单独容器、小包、管、小瓶、多孔板等中的一种或多种组分，或者组分可以在这类容器中以各种组合形式组合。试剂盒组分和试剂如本文所述。
例如，一种或多种以下组分可被包括在试剂盒中：(i)一种或多种脱蜡试剂(例如二甲苯、矿物油等)；(ii)一种或多种裂解缓冲液(例如，含有一种或多种盐、蛋白酶抑制剂和非离子非变性洗涤剂等的裂解缓冲液)；(iii)一种或多种变性洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠等)；(iv)一种或多种用于淬灭变性洗涤剂的试剂(例如TritonX-100等)；(v)一种或多种细胞外基质蛋白酶(例如胶原酶和/或分散酶、ColI、ColIII、ColIV、分散酶I等)；(vi)保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂和(vii)印刷品(例如说明书、标签等)。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂产生邻近连接的核酸分子(例如，一种限制性核酸内切酶或两种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶等)。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂包括固相元素，例如，珠子、用例如补骨脂素的核酸交联试剂官能化的固相基质、用例如链霉亲和素的亲和纯化分子和例如生物素的亲和纯化标记物官能化的固相基质、用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶(例如Tn5)官能化的固相基质。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂包括区室化试剂和区室特异性分子条形码。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂包括Tn5四聚体(例如，包含生物素化接头序列的Tn5四聚体)。在一些实施方案中，试剂盒包括表面，在所述表面上整体或部分地执行本文所述的方法(例如，病理玻片等)。
在一些实施方案中，试剂盒不包括一种或多种脱蜡试剂。
例如，一种或多种以下组分可被包括在试剂盒中：(i)固相，和(ii)保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂。在一些实施方案中，试剂盒包括固相，所述固相包括羧化表面(例如，微板、珠子等)。在一些实施方案中，试剂盒包括涂有交联试剂(例如补骨脂素等)的固相(例如，磁珠等)。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂产生邻近连接的核酸分子(例如，一种限制性核酸内切酶或两种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、有时包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶等)。在一些实施方案中，试剂盒包括区室化试剂(例如，产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔)、区室特异性分子条形码和一种或多种用于附着条形码以保留空间邻近连续性信息的试剂(例如，用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶)。
在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种用于在区室化之前亲和纯化呈蛋白质:cfDNA复合物形式的天然空间邻近核酸的试剂(例如，亲和纯化标记物，如生物素化核苷酸，和亲和纯化分子，如链霉亲和素)。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂包括Tn5四聚体(例如，包含生物素化接头序列的Tn5四聚体)。在一些实施方案中，试剂盒包括保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂，所述试剂包括包含区室特异性的条形码化寡核苷酸的珠联转座体(例如Tn5等)。
在一些实施方案中，试剂盒包括亚硫酸氢盐试剂。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐试剂是亚硫酸氢钠。
试剂盒有时与过程结合使用，并且可以包括用于执行一种或多种过程的说明和/或一种或多种组合物的描述。可以使用试剂盒来进行本文所述的过程。说明和/或描述可以是有形形式(例如，纸张等)或电子形式(例如，缠结介质(tangle medium)(例如，光盘)等上的计算机可读文件)并且可以被包括在试剂盒插页中。试剂盒还可以包括提供这些说明或描述的互联网位置的书面说明。
以下阐述的实施例说明了某些实施方案，并且不限制该技术。
实施例1：制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品
1.从FFPE块或FFPE载玻片中收集FFPE组织切片(例如，厚度为5-10μm)。将FFPE切片转移到干净的1.5ml管中。
2.加入1mL二甲苯溶液，并在室温下孵育10分钟。
3.在室温下以17,860xg(15,000rpm)离心5分钟。
4.将脱蜡组织重悬浮在1mL的100％乙醇中并在室温下孵育10分钟。
5.在室温下以17,860xg离心5分钟。
6.将脱蜡组织重悬浮在1mL水中并在室温下孵育10分钟。
7.在室温下以17,860xg离心5分钟。
示例性组织解离缓冲液(均在1X PBS，pH＝7.4中稀释)：
缓冲液1：0.05％胶原酶III
缓冲液2：0.05％胶原酶IV
缓冲液3：0.025％胶原酶IV+0.025％分散酶I(中性蛋白酶I)
缓冲液4：0.1％胶原酶I+0.025％分散酶I(中性蛋白酶I)
缓冲液5：0.05％分散酶I(中性蛋白酶)
8.加入1mL酶促组织解离缓冲液(见上文)并在37℃下孵育约20分钟。
9.在室温下以1,000xg离心并移出上清液。
10.如本文所述加入200μL裂解缓冲液，并在4℃下孵育20分钟，并在整个孵育过程中每4分钟涡旋一次。
11.以1000xg快速离心并移出上清液。
12.将样品重悬浮在1X Tris中。
13.加入SDS直到最终浓度为0.5％，并在74℃下孵育40分钟。
14.加入TritonX-100直到最终浓度相对于SDS为10:1v/v，并在37℃下孵育15分钟。
制备邻近连接产物、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)产物、区室化和标记的产物或Tn5四聚体产物，它们用于本文所述的DNA测序。
实施例2：用于制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品的替代性方法(没有脱蜡和再水化)
1.从FFPE块或FFPE载玻片中收集FFPE组织切片(例如，厚度为5-10μm)。将FFPE切片转移到干净的1.5ml管中。
2.如本文所述加入200μL裂解缓冲液，并在4℃下孵育20分钟，并在整个孵育过程中每4分钟涡旋一次。
3.以1000xg快速离心并倾倒上清液。
4.将样品重悬浮在1X Tris中。
5.加入SDS直到最终浓度为0.5％，并在74℃下孵育40分钟。
6.加入TritonX-100直到最终浓度相对于SDS为10:1v/v，并在37℃下孵育15分钟。
制备邻近连接产物、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)产物、区室化和进行标记的产物或Tn5四聚体产物，它们用于本文所述的DNA测序。
实施例3：FFPE-脱蜡/再水化，无细胞裂解，SDS步骤，有/无酶促组织解离。
1.从FFPE块或FFPE载玻片中收集FFPE组织切片(例如厚度为5-10μm)。将FFPE切片转移到干净的1.5ml管中。
2.加入1mL二甲苯溶液，并在室温下孵育10分钟。
3.在室温下以17,860xg(15,000rpm)离心5分钟。
4.将脱蜡组织重悬浮在1mL的100％乙醇中并在室温下孵育10分钟。
5.在室温下以17,860xg离心5分钟。
6.将脱蜡组织重悬浮在1mL水中并在室温下孵育10分钟。
7.在室温下以17,860xg离心5分钟。
示例性组织解离缓冲液(均在1X PBS，pH＝7.4中稀释)：
缓冲液1：0.05％胶原酶III
缓冲液2：0.05％胶原酶IV
缓冲液3：0.025％胶原酶IV+0.025％分散酶I(中性蛋白酶I)
缓冲液4：0.1％胶原酶I+0.025％分散酶I(中性蛋白酶I)
缓冲液5：0.05％分散酶I(中性蛋白酶)
8.加入1mL酶促组织解离缓冲液(见上文)并在37℃下孵育约20分钟。
9.在室温下以1,000xg离心10分钟并移出上清液。
10.将样品重悬浮在1X Tris中。
11.加入SDS直到最终浓度为0.5％，并在74℃下孵育40分钟。
12.加入TritonX-100直到最终浓度相对于SDS为10:1v/v，并在37℃下孵育15分钟。
制备邻近连接产物、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)产物、区室化和标记的产物或Tn5四聚体产物，它们用于本文所述的DNA测序。
实施例4-FFPE-(没有脱蜡/再水化)，无细胞裂解，SDS步骤，无酶促组织解离
1.从FFPE块或FFPE载玻片中收集FFPE组织切片(例如厚度为5-10μm)。将FFPE切片转移到干净的1.5ml管中。
2.将样品重悬浮在1X Tris中。
3.加入SDS直到最终浓度为0.5％，并在74℃下孵育40分钟。
4.加入TritonX-100直到最终浓度相对于SDS为10:1v/v，并在37℃下孵育15分钟。
制备邻近连接产物、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)产物、区室化和标记的产物或Tn5四聚体产物，它们用于本文所述的DNA测序。
实施例5：深度福尔马林固定的样品(磨碎，有/无酶促解离，裂解，SDS)
1.用液氮、研钵和杵在干冰上磨碎组织。
2.将组织转移到干净的1.5mL微量离心管中。
示例性组织解离缓冲液(均在1X PBS，pH＝7.4中稀释)：
缓冲液1：0.05％胶原酶III
缓冲液2：0.05％胶原酶IV
缓冲液3：0.025％胶原酶IV+0.025％分散酶I(中性蛋白酶I)
缓冲液4：0.1％胶原酶I+0.025％分散酶I(中性蛋白酶I)
缓冲液5：0.05％分散酶I(中性蛋白酶)
3.加入1mL酶促组织解离缓冲液(见上文)并在37℃下孵育约20分钟。
4.在室温下以1,000xg离心10分钟并去除上清液。
5.如本文所述加入200μL裂解缓冲液，并在4℃下孵育20分钟，并在整个孵育过程中每4分钟涡旋一次。
6.以1000xg快速离心并倾倒上清液。
7.将样品重悬浮在1X Tris中。
8.加入SDS直到最终浓度为0.5％，并在74℃下孵育40分钟。
9.加入TritonX-100直到最终浓度相对于SDS为10:1v/v，并在37℃下孵育15分钟。
制备邻近连接产物、固体基质介导的邻近捕获(SSPC)产物、区室化和标记的产物或Tn5四聚体产物，它们用于本文所述的DNA测序。
实施例6：蛋白质:cfDNA空间邻近连续性保留
1.将血液收集到采血管(BCT)中。
2.分离血浆，其含有蛋白质/cfDNA复合物。
1.将蛋白质:cfDNA复合物的蛋白质结合到羧化表面，例如羧化珠或羧化微板表面。
2.洗去自由漂浮的cfDNA，只留下结合到羧化表面的蛋白质:cfDNA复合物。
3.将蛋白质与cfDNA交联，例如使用甲醛。
1.将蛋白质:cfDNA复合物交联至涂有交联试剂的固相元素，例如涂有核酸交联试剂(如补骨脂素)的磁珠。
2.任选的：例如使用蛋白酶K降解蛋白质，留下与固相元素交联的cfDNA。
1.钝化cfDNA的末端
a.任选地掺入亲和纯化标记物，例如生物素化核苷酸。
2.连接空间邻近cfDNA，产生连接产物。
3.通过以下任一方式分离连接产物：
a.亲和纯化(例如连接接头的生物素:链霉亲和素富集)
b.尺寸选择-未连接的cfDNA片段为100-240bp，因此任何邻近连接的cfDNA分子都必须>240bp，并且可以通过SPRI珠子、凝胶纯化等进行纯化。
1.加入Tn5四聚体以对空间邻近cfDNA进行标记，由此通过寡核苷酸接头序列在两个空间邻近cfDNA片段之间创建物理连接
(或“环”)，从而产生Tn5介导的环产物。
a.任选地使用生物素化的接头序列。
2.通过以下任一方式分离空间连接产物：
a.亲和纯化(例如生物素化接头的生物素:链霉亲和素富集)
b.尺寸选择-典型的cfDNA片段为100-240bp，因此任何Tn5介导的环产物都必须>240bp，并且可以通过SPRI珠子、凝胶纯化等进行纯化。
1.释放(即解除结合)交联的蛋白质:cfDNA复合物，例如从羧化表面释放。
2.物理区室化蛋白质:cfDNA复合物，例如在液滴中。
3.使用区室特异性分子条形码对每个区室内的cfDNA进行标记。
a.例如，连接区室特异性的条形码化测序接头，或退火区室特异性的条形码化PCR引物。
1.钝化cfDNA的末端并掺入亲和纯化标记物，例如生物素化核苷酸。
2.释放(即解除结合)交联的蛋白质:cfDNA复合物，例如从羧化表面释放。
3.亲和纯化蛋白质:cfDNA复合物，例如使用链霉亲和素包被的珠子。
4.物理区室化结合至固相元素的蛋白质:cfDNA复合物，例如在液滴中。
5.使用区室特异性分子条形码对每个区室内的cfDNA进行标记。
a.例如，连接区室特异性的条形码化测序接头，或退火区室特异性的条形码化PCR引物。
1.释放(即解除结合)交联的蛋白质:cfDNA复合物，例如从羧化表面释放。
2.加入独特条形码化的珠联转座体。
3.使用来自珠联转座体的标记作用用相同分子条形码对相同蛋白质:cfDNA复合物的cfDNA进行标记。
实施例7：延长染色质增溶和解压缩反应改善了来自FFPE样品的空间邻近连续性信号。
用两种4切点限制酶的组合由10μm FFPE切片制备LP，但在消化前使用公布的10分钟SDS处理时间或40分钟延长处理，一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。公布的10分钟SDS处理时间仅包含约1.65％的长顺式模板，而40分钟的SDS处理将该分数增加到约7.75％，增加了近5倍(参见图1A)，但仍低于捕获空间邻近连续性的最先进水平(约40％长顺式读数)。这些结果表明，染色质溶解度和解压缩优化可以改善空间邻近连续性信号。
实施例8：染色质增溶和解压缩反应延长至80分钟改善了来自FFPE样品的空间邻近连续性信号。
使用两种4切点限制酶的组合由10μm FFPE切片制备LP，但在消化前使用先前优化的40分钟(参见图1A)，或60或80分钟的延长处理持续时间，一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。先前的40分钟延长SDS处理时间仅包含约18％的长顺式模板，而60分钟的SDS处理将该分数增加到约25％，并且80分钟的SDS处理将该分数增加到约37％长顺式(参见图1B)。来自80分钟SDS持续时间的长顺式表明相对于10分钟SDS增加了>20倍(参见图1A)，但仍低于捕获空间邻近连续性的最先进水平(约40％长顺式读数)。这些结果表明，染色质溶解度和解压缩优化可以改善空间邻近连续性信号。
实施例9：染色质增溶和解压缩反应延长至180分钟改善了来自10μm FFPE样品的空间邻近连续性信号。
使用两种4切点限制酶的组合由10μm FFPE切片制备LP，但在消化前使用40分钟，或80、120或180分钟的延长处理持续时间，一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。40分钟的SDS处理时间仅包含约16％的长顺式模板，而80、120和180分钟的SDS处理将该分数平均增加到约16％、28％和37％(参见图1C)。来自180分钟SDS持续时间的长顺式表明相对于10分钟SDS增加了>20倍(参见图1A)，但仍低于捕获空间邻近连续性的最先进水平(约40％长顺式读数)。
实施例10：染色质增溶和解压缩反应延长至180分钟不显著改善来自5μmFFPE样品的空间邻近连续性信号。
使用两种4切点限制酶的组合由5μm FFPE切片制备LP，但在消化前使用40分钟，或80、120或180分钟的延长处理持续时间，一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。40分钟的SDS处理时间仅包含约26％的长顺式模板，而80、120和180分钟的SDS处理将该分数平均增加到约30.5％、31％和32％(参见图1D)。虽然相对于10分钟的SDS，长顺式仍然有显著改善(参见图1D)，但其仍低于捕获空间邻近连续性的最先进水平(约40％长顺式读数)。这些结果表明，对于5μm切片，将SDS反应延长到80分钟以上没有明显的好处，并且SDS持续时间优化平台似乎低于长顺式读数的期望水平。
实施例11：将染色质增溶和解压缩的温度增加到极端高温意外地改善了来自5μmFFPE样品的空间邻近连续性信号。
为了探索染色质增溶和解压缩反应的温度和持续时间的影响，使用两种4切点限制酶的组合由5μm FFPE切片制备LP，但在消化之前根据说明在50℃、62℃或74℃下使用10、40或80分钟增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。10-80分钟的50℃SDS处理产生了约2.8-10.2％的长顺式模板，而10-80分钟的62℃SDS处理产生了约6.8-39％的长顺式模板。令人惊讶的是，10-40分钟的74℃SDS处理产生了约31.7-54.2％的长顺式模板(参见图2A)，与常规的62℃处理相比显著改善，达到了卓越的空间邻近连续性信号水平。这一结果令人惊讶，因为极高的热量可以开始使富含AT的dsDNA变性并逆转福尔马林交联，福尔马林交联对于将3D染色质结构保持在一起至关重要，并且是通过邻近连接或其他需要交联的方法捕获空间邻近连续性所必需的。
实施例12：将染色质增溶和解压缩的温度增加到极热意外地改善了来自10μmFFPE样品的空间邻近连续性信号。
为了确定染色质增溶和解压缩反应过程中的极端高温是否会改善较厚(10μm)FFPE切片中的长顺式，我们使用两种4切点限制酶的组合从10μm FFPE切片制备LP，但在消化之前在74℃下使用10、40或80分钟一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。10分钟的74℃SDS处理几乎不产生(约0.5％)长顺式模板，而40和80分钟分别平均产生约53.5％和55.5％的长顺式模板(参见图2B)。这一令人惊讶的结果也表明74℃下40分钟的方案对5和10μm FFPE样品的稳健性。
实施例13：在74℃下染色质增溶和解压缩40分钟最佳地从临床人类FFPE肿瘤样品中捕获空间邻近连续性信号。
为了检查染色质增溶和解压缩反应过程中的极端高温是否会改善来源于患者的FFPE肿瘤样品中的长顺式，使用细胞裂解步骤和使用两种4切点限制酶的组合从7-8μmFFPE切片制备LP，但在消化之前根据说明在62℃或74℃下使用40或80分钟一式两份地增溶染色质。选择62℃下持续80分钟是因为80分钟是在5μm切片上进一步延长时间没有产生长顺式改善的时间，而选择74℃下持续40分钟则是基于在不同切片厚度下的最佳性能和稳健性(图2A和2B)。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。80分钟的62℃SDS处理产生了38％的长顺式模板，而40分钟的74℃SDS处理产生了53.5％的长顺式模板(图3)。这一令人惊讶的结果表明了在来源于患者的FFPE组织中，74℃下40分钟的方案的空间邻近连续性的最佳捕获和稳健性。
实施例14：细胞裂解并不是从FFPE样品中捕获最佳的空间邻近连续性信号所必需的。
为了检查染色质增溶和解压缩反应过程中的极端高温是否消除了对FFPE样品进行细胞裂解的需要，通过包括根据本文所述的优化方案的细胞裂解步骤(参见图1至3)或在不进行细胞裂解的情况下从5μm FFPE切片制备LP。使用了两种4切点限制酶的组合，但在消化之前使用74℃下40分钟一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。经历细胞裂解的FFPE样品产生59％的长顺式模板，而已经放弃细胞裂解的FFPE样品平均产生57.5％的长顺式模板(参见图4)。这一令人惊讶的结果表明了74℃下40分钟的方案的空间邻近连续性的最佳捕获和稳健性，这也消除了对细胞裂解的需要。
实施例15：当SDS反应处于62℃时，需要脱蜡和再水化以从FFPE样品中捕获空间邻近连续性信号。
为了检查是否可以从FFPE样品中捕获空间邻近连续性信号而不必对组织进行脱蜡和再水化，通过根据本文所述的优化方案进行标准的脱蜡和再水化(参见图1-4)，或者在不对FFPE样品进行脱蜡或再水化(与用于从FFPE样品进行下一代测序的标准程序相反)的情况下，从10μm FFPE切片制备LP。使用了两种4切点限制酶的组合，但在消化之前使用62℃下10或40分钟一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。未脱蜡和再水化的FFPE样品产生0.8-1.4％的长顺式模板，而接受脱蜡和再水化的FFPE样品平均产生1.5-8.5％的长顺式模板，其中更长SDS反应持续时间下的长顺式模板的比例更大(参见图5A)。这些结果表明，当FFPE样品放弃脱蜡和再水化以及62℃染色质增溶和解压缩反应时，空间邻近连续性信号的捕获是最小的。
实施例16：当SDS反应在74℃下持续40分钟时，从FFPE样品中捕获最佳的空间邻近连续性信号不需要脱蜡和再水化。
为了检查是否可以从FFPE样品中捕获最佳的空间邻近连续性信号而不必对组织进行脱蜡和再水化，通过根据本文所述的优化方案进行标准的脱蜡和再水化(参见图1-4)，或者在不对FFPE样品进行脱蜡或再水化(与用于从FFPE样品进行下一代测序的标准程序相反)的情况下，从5和10μm FFPE切片制备LP。使用了两种4切点限制酶的组合，但在消化之前使用74℃下40分钟的SDS一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。未脱蜡和再水化的FFPE样品产生53-60％的长顺式模板，而接受脱蜡和再水化的FFPE样品平均产生52.4-59％的长顺式模板(参见图5B)。这些结果令人惊讶地表明从放弃了脱蜡和再水化并经历了74℃染色质增溶和解压缩反应的FFPE样品中最佳地捕获了空间邻近连续性。
实施例17：细胞外基质蛋白的酶促解离提高了用户友好性，而不损害从FFPE样品中最佳地捕获空间邻近连续性信号。
为了检查是否可以酶促解离FFPE样品以提高用户友好性(例如，提高移液的简便性)而不牺牲空间邻近连续性的最佳捕获，通过包括酶促解离步骤(使用胶原酶III、胶原酶IV、胶原酶I、分散酶或如所示的组合)，或不按照本文所述的优化方案进行酶促解离，从5和10μm FFPE切片制备LP(参见图1-5)。使用了两种4切点限制酶的组合，但在消化之前使用74℃下40分钟的SDS一式两份地增溶和解压缩染色质。产生LP后，该方案将通过片段化、生物素富集和制备为模板和短读段测序继续进行。长顺式测序读数的分数被用作保留空间邻近连续性的代理。所有FFPE样品平均产生50-60％的长顺式模板(参见图6)。这些结果表明，即使在使用ECM蛋白酶预处理样品以提高工作流程的用户友好性时，也能从FFPE样品中最佳地捕获空间邻近连续性。
实施例18：使用针对交联细胞的标准方案处理的FFPE细胞中染色质消化失败
由人类细胞系制备10μm FFPE切片。对样品进行脱蜡和再水化，然后使用针对哺乳动物细胞的标准HiC方案的初始步骤进行处理(用裂解缓冲液处理，然后在62℃下增溶和解压缩10分钟)，然后使用1000U的4切点限制酶(DpnII)进行消化。使用过量的限制酶来预测从FFPE样品产生的过度固定的染色质。作为对照，对冷冻固定细胞(非FFPE)执行针对哺乳动物细胞的标准HiC方案，只使用50U的DpnII。消化后，逆转交联并纯化DNA，并通过凝胶电泳和Agilent TapeStation仪器(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)分析大小。凝胶电泳分析表明冷冻细胞中的染色质被有效消化，而FFPE细胞中几乎没有消化，尽管限制酶单位多20倍(参见图18)。平均片段大小的TapeStation分析(参见“Frag Size(bp)”行)支持凝胶分析，并提供消化后DNA平均大小的更精确定量。
实施例19：FFPE组织上的自动化HiC。
将小鼠肝脏组织的5μm FFPE切片脱蜡和再水化，然后按照本文所述进行针对FFPE样品优化的方案(无组织解离(细胞外基质蛋白酶)，用裂解缓冲液处理和74℃下增溶和解压缩40分钟)，并使用2种4切点限制酶进行HiC。然而，从裂解到反向交联和DNA纯化的整个HiC方案都是在Agilent Bravo自动化液体处理平台(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)上进行的。使用
实施例20：FFPE组织中的快速反向交联。
对5μm FFPE切片执行HiC方案。将小鼠肝脏组织脱蜡和再水化，然后按照本文所述进行针对FFPE样品优化的方案(无组织解离(细胞外基质蛋白酶)，用裂解缓冲液处理和74℃下增溶和解压缩40分钟)。然后使用2种4切点限制酶对样品进行HiC。然而，反向交联程序不同，使得组织接受标准处理(蛋白酶K(ProK)在55℃下30分钟，然后在68℃下90分钟)，只是较低温度的处理(ProK在55℃下30分钟)，或者根本没有反向交联以作为阴性对照。浅层测序和分析表明来自减少的反向交联方案的长距离顺式读数很高，与完全反向交联方案相当，并且明显优于没有反向交联的情况(参见图20)。也参见实施例17和图6，它们使用55℃方案下的30分钟ProK逆转了交联。
在另一组实验中，反向交联程序在不存在蛋白酶K的情况下在95℃下孵育60分钟。纯化的DNA量大约相当于使用完全反向交联方案获得的量。长顺式值约为48-50％长距离顺式，与使用完全反向交联方案获得的值相当。
实施例21：使用全基因组FFPE-HiC数据高灵敏度发现，已知易位作为突变等位基因频率和测序深度的函数。
在每个细胞(50％突变等位基因频率(MAF))或核型正常细胞系(GM24385)中含有杂合ROS1-SLC34A2易位的细胞的FFPE块是从Horizon Discovery(英国沃特比奇)获得的。将10μm FFPE切片脱蜡，再水化，用裂解缓冲液处理，然后在62℃下增溶和解压缩40分钟，并使用2种4切点限制酶消化来进行HiC。在对每个样品进行深度测序分析(约30X)之后，原始读数在以下癌症:正常比例下计算混合：100:0、80:20、60:40、40:60、20:80和0:100，因此代表ROS1:SLC34A2易位的50％、40％、30％、20％、10％和0％突变等位基因频率(行)。这种读数混合也以总深度固定为15X、5X或1X的方式进行(列)。然后使用HiC-Breakfinder鉴定易位，该方法在所有深度和MAF组合中都发现了ROS1-SLC34A2易位，除了1X深度下的10％MAF和所有阴性对照条件(0％MAF)。在HiC-Breakfinder进行易位调用的情况下，黑色箭头覆盖在ROS1-SLC34A2基因周围的HiC接触图上(参见图21)。
实施例22：由靶向FFPE-HiC数据实现的已知易位的高灵敏度发现。
将在每个细胞(50％突变等位基因频率(MAF))中含有杂合ROS1-SLC34A2易位的细胞的10μm FFPE切片脱蜡，再水化，用裂解缓冲液处理，然后在62℃下增溶和解压缩40分钟，并使用2种4切点限制酶消化来进行HiC。在对每个样品进行深度测序分析(约30X)之后，通过捕获源自基因组中真正ROS1-SLC34A2断点下游约50kb的一个基因座的所有HiC信号来模拟靶向HiC(“Capture-HiC”)的影响。仅在30X深度(显著低于通常的肿瘤基因小组测序)下产生的HiC信号绘制在顶部。在SLC34A2上的断点上游观察到几乎为零的HiC信号。观察到HiC信号在SLC34A2中的断点处达到峰值，然后随着从SLC34A2向下游移动的基因座而降低(参见图22)。断点的位置在SLC34A2中，基于峰值HiC信号(和基础序列信息)和远离断点(在这种情况下为下游)的距离依赖衰减信号。
实施例23：FFPE GIST肿瘤中的易位的发现和验证。
将胃肠道间质瘤(GIST)的7-8μm FFPE切片脱蜡和再水化，然后按照本文所述进行针对FFPE样品优化的方案(无组织解离(细胞外基质蛋白酶)，用裂解缓冲液处理和74℃下增溶和解压缩40分钟)。然后使用2种4切点限制酶对样品进行HiC。浅层测序分析显示了很高的长距离顺式读数(参见图23A)。此外，全基因组浅层测序分析(0.75X测序；约30美元成本)鉴定了19个易位，其中若干断点涉及与癌症相关但通常不被基因小组靶向的基因。例如，该分析发现了POLA2-PIGU易位。POLA2在癌症数据库(即COSMIC、Quiver、TCGA)中至少有10个报告的配偶体，并且在GIST中反复易位。PIGU有超过13个报告的配偶体，但POLA2和PIGU都不被肿瘤基因分型小组(例如Agilent ClearSeq(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉))靶向，强调了HiC发现混杂和配偶体不可知易位的能力。为了获得用于PCR验证的亚Kb断点分辨率，进行高达～10X的测序(参见图23B)。选择涉及UQCC1(>12个报告的配偶体)的一个染色体间易位和ARHGAP20(在B-CLL中1个报告的易位)用于PCR验证。测试引物对(和对照引物对，未显示)被设计为跨越易位断点进行扩增(参见图23C)。PCR结果证实了单个PCR扩增子(参见图23D)，验证了优化的FFPE-HiC方案和FFPE肿瘤组织中的易位发现分析。
实施例24：FFPE小儿室管膜肿瘤中的易位的发现。
将颅后窝室管膜瘤(PFE)肿瘤的5μm FFPE切片脱蜡和再水化，然后按照本文所述进行针对FFPE样品优化的方案(无组织解离(细胞外基质蛋白酶)，用裂解缓冲液处理和74℃下增溶和解压缩40分钟)。然后使用2种4切点限制酶对样品进行HiC。全基因组浅层测序分析(0.25X测序；约10美元成本)揭示存在若干易位(参见图24B)，类似于先前在来自PFE细胞系的HiC数据中观察到的(参见图24A；与UCSD的Lukas Chavez博士的个人交流)。事实上，该PFE肿瘤的FFPE-HiC分析鉴定了chr1；chr3易位(参见图24C)，其中chr1配偶体是参与先前从源自不同个体的PFE细胞系鉴定的chr1；chr8易位的相同基因，表明FFPE-HiC在鉴定肿瘤组织中先前未被充分认识的、配偶体不可知的和反复发生的易位方面的潜力。同样值得注意的是，该FFPE PFE肿瘤以前曾使用常规的WGS和RNA-seq进行过分析，但未发现体细胞突变或易位，因此与最先进的全基因组(WGS)和靶向(RNA-seq)方法进行易位分析相比，FFPE-HiC的分析灵敏度更高。
实施例25：跨越存档期在FFPE肿瘤中的易位的发现。
包含来自胃、肺、甲状腺或肝的肿瘤组织的FFPE块的5μm切片是从BioChainInstitute Inc.(新西兰纽瓦克)获得。每个肿瘤块的存档期分别为4、5、10或18年(参见图25A)。将FFPE切片脱蜡和再水化，然后按照本文所述进行针对FFPE样品优化的方案(无组织解离(细胞外基质蛋白酶)，用裂解缓冲液处理和74℃下增溶和解压缩40分钟)。然后使用2种4切点限制酶对处理过的切片进行HiC。浅层测序分析表明，在整个存档期范围内，甚至长达18年都有中等高但一致的长距离顺式读数(参见图25A)，而对数据中的长距离信息的质量没有负面影响。从肺肿瘤中这种极低的测序深度(0.05X测序；约2美元的成本)，鉴定了7个易位的证据，包括染色体内易位(参见图25B)、chr3；chr18(参见图25C)和chr3；chr7(参见图25D)之间的染色体间易位。
实施例26：来自低输入FFPE组织的高质量FFPE-HiC。
5-10μm FFPE切片是从小鼠肝组织或人GIST、PFE、肺、肝、胃和甲状腺肿瘤获得。将每个肿瘤切片脱蜡和再水化，然后按照本文所述进行针对FFPE样品优化的方案(无组织解离(细胞外基质蛋白酶)，用裂解缓冲液处理和74℃下增溶和解压缩40分钟)。然后使用2种4切点限制酶对处理过的切片进行HiC。浅层测序分析表明有中到高的长距离顺式读数，即使在从FFPE组织切片中提取的DNA总量被认为是低输入(此处定义为<200ng)的情况下也是如此。
实施例27：实施方案的非限制性实施例
以下列出的是该技术的某些实施方案的非限制性实施例。
A1.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
e)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
f)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
A1.1.实施方案A1的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
A1.2.实施方案A1或A1.1的方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
A1.3.实施方案A1.2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
A1.4.实施方案A1.3的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
A2.实施方案A1至A1.4中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
A3.实施方案A2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
A3.1.实施方案A3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
A4.实施方案A3.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
A4.1实施方案A4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
A5.实施方案A1-A4.1中任一项的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
A6.实施方案A5的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
A7.实施方案A6的方法，其中所述温度是约74℃。
A7.1实施方案A7的方法，其中所述温度是74℃。
A7.2.实施方案A1-A1.4中任一项的方法，其中与变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
A8.实施方案A1-A7.2中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
A9.实施方案A1-A8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
A9.1.实施方案A9的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
A9.2.实施方案A9.1的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
A10.实施方案A9至A9.2中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
A11.实施方案A1-A8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
A12.实施方案A11的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
A13.实施方案A11的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
A13.1.实施方案A11至A13中任一项的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种进行区室化和用分子条形码标记的试剂接触。
A13.2.实施方案A13.1的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
A13.3.实施方案A13.1或A13.2的方法，其中用分子条形码记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
A14.实施方案A11的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
A14.1.实施方案A14的方法，其中所述转座酶是Tn5。
A15.实施方案A1至A14.1中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品设置在固体表面上。
A15.1.实施方案A15.1的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
A16.实施方案A1至A8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和通过将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸进行标记的试剂。
A16.1.实施方案A16的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
A16.2.实施方案A16或A16.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
A17.实施方案A1至A16.2中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片设置。
A18.实施方案A1至A8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
A19.实施方案A1至A18中任一项的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
A20.实施方案A19的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
A21.实施方案A1至A18中任一项的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
A22.实施方案A21的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
A23.实施方案A21或A22的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
A24.实施方案A23的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
A25.实施方案A1至A18中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
A26.实施方案A1至A18中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
A27.实施方案A25或A26的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
A28.实施方案A27的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
A29.实施方案A27或A28的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
A30.实施方案A1至A18中任一项的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
A31.实施方案A30的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
A32.实施方案A31的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
A33.实施方案A31或A32的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
A34.实施方案A33的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
A35.实施方案A1至A34中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
A36.实施方案A1至A35中任一项的方法，其中在步骤(f)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
A37.实施方案A36的方法，其中所述温度是约55℃。
A37.1.实施方案A37的方法，其中所述温度是55℃。
A38.实施方案A1至A35中任一项的方法，其中在步骤(f)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
A38.1.实施方案A38的方法，其中在步骤(f)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
B1.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
e)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
B1.1.实施方案B1的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
B1.2.实施方案B1或B1.1的方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
B1.3.实施方案B1.2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
B1.4.实施方案B1.3的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
B2.实施方案B1至B1.4中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
B3.实施方案B2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
B4.实施方案B3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
B4.1.实施方案B4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
B4.2.实施方案B4.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
B5.实施方案B1-B4.2中任一项的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
B6.实施方案B5的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
B7.实施方案B6的方法，其中所述温度是约74℃。
B7.1实施方案B7的方法，其中所述温度是74℃。
B7.2.实施方案B1-B1.4中任一项的方法，其中与变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
B8.实施方案B1-B7.2中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
B9.实施方案B1-B8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
B9.1.实施方案B9的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
B9.2.实施方案B9.1的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
B10.实施方案B9至B9.2中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
B11.实施方案B1-B8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
B12.实施方案B11的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
B13.实施方案B11的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
B13.1.实施方案B11至B13中任一项的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
B13.2.实施方案B13.1的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
B13.3.实施方案B13.1或B13.2的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
B14.实施方案B11的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
B14.1.实施方案B14的方法，其中所述转座酶是Tn5。
B15.实施方案B1至B14.1中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品设置在固体表面上。
B15.1.实施方案B15的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
B16.实施方案B1至B8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
B16.1.实施方案B16的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
B16.2.实施方案B16或B16.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
B17.实施方案B1至B16.2中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片提供。
B18.实施方案B17的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm的组织切片提供。
B19.实施方案B1至B8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
B20.实施方案B1至B19中任一项的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
B21.实施方案B20的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
B22.实施方案B1至B19中任一项的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
B23.实施方案B22的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
B24.实施方案B22或B23的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
B25.实施方案B24的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
B26.实施方案B1至B19中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
B27.实施方案B1至B19中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
B28.实施方案B26或B27的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
B29.实施方案B28的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
B30.实施方案B28或B29的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
B31.实施方案B1至B19中任一项的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
B32.实施方案B31的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
B33.实施方案B32的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
B34.实施方案B32或B33的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
B35.实施方案B34的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
B36.实施方案B1至B35中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
B37.实施方案B1至B36中任一项的方法，其中在步骤(e)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
B38.实施方案B37的方法，其中所述温度是约55℃。
B38.1.实施方案B38的方法，其中所述温度是55℃。
B39.实施方案B1至B36中任一项的方法，其中在步骤(e)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
B39.1.实施方案B39的方法，其中在步骤(e)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
C1.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，所述样品尚未进行脱蜡/再水化；
b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
C1.1.实施方案C1的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
C1.2.实施方案C1或C1.1的方法，其中在与所述裂解缓冲液接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
C1.3.实施方案C1.2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
C1.4.实施方案C1.3的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
C2.实施方案C1至C1.4中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
C3.实施方案C2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
C3.1实施方案C3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
C4.实施方案C3.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
C4.1.实施方案C4的方法，其中与所述变性剂的接触是40分钟。
C5.实施方案C1至C4.1中任一项的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
C6.实施方案C5的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
C7.实施方案C6的方法，其中所述温度是约74℃。
C7.1.实施方案C7的方法，其中所述温度是74℃。
C7.2.实施方案C1-C1.4中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
C8.实施方案C1-C7.2中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
C9.实施方案C1-C8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
C9.1.实施方案C9的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
C9.2.实施方案C9.1的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
C10.实施方案C9至C9.2中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
C11.实施方案C1-C8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
C12.实施方案C11的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
C13.实施方案C11的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
C13.1.实施方案C11至C13中任一项的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
C13.2.实施方案C13.1的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
C13.3.实施方案C13.1或C13.2的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
C14.实施方案C11的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
C14.1.实施方案C14的方法，其中所述转座酶是Tn5。
C15.实施方案C1至C14.1中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品设置在固体表面上。
C15.1.实施方案C15的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
C16.实施方案C1至C8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
C16.1.实施方案C16的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
C16.2.实施方案C16或C16.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
C17.实施方案C1至C16.2中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片提供。
C18.实施方案C1至C8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
C19.实施方案C1至C18中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
C20.实施方案C19的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
C21.实施方案C1至C18中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
C22.实施方案C21的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
C23.实施方案C21或C22的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
C24.实施方案C23的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
C25.实施方案C1至C18中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
C26.实施方案C1至C18中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
C27.实施方案C25或C26的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
C28.实施方案C27的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
C29.实施方案C27或C28的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
C30.实施方案C1至C18中任一项的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
C31.实施方案C30的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
C32.实施方案C31的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
C33.实施方案C31或C32的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
C34.实施方案C33的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
C35.实施方案C1至C34中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
C36.实施方案C1至C35中任一项的方法，其中在步骤(d)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
C37.实施方案C36的方法，其中所述温度是约55℃。
C37.1.实施方案C37的方法，其中所述温度是55℃。
C38.实施方案C1至C35中任一项的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
C38.1.实施方案C38的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
D1.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，所述样品尚未进行脱蜡/再水化；
b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
D1.1.实施方案D1的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
D1.2.实施方案D1或D1.1的方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
D1.3.实施方案D1.2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
D1.4.实施方案D1.3的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
D2.实施方案D1至D1.4中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
D3.实施方案D2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
D3.1.实施方案D3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
D4.实施方案D3.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
D4.1.实施方案D4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
D5.实施方案D1-D4.1中任一项的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
D6.实施方案D5的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
D7.实施方案D6的方法，其中所述温度是约74℃。
D7.1.实施方案D7的方法，其中所述温度是74℃。
D7.2.实施方案D1至D1.4中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
D8.实施方案D1-D7.2中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
D9.实施方案D1-D8中任一项的方法，其中一种或多种保留空间邻近连续性信息的试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
D9.1.实施方案D9的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
D9.2.实施方案D9.1的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
D10.实施方案D9至D9.2中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
D11.实施方案D1-D8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
D12.实施方案D11的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
D13.实施方案D11的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
D13.1.实施方案D11至D13中任一项的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
D13.2.实施方案D13.1的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
D13.3.实施方案D13.1或D13.2的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
D14.实施方案D11的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
D14.1.实施方案D14的方法，其中所述转座酶是Tn5。
D15.实施方案D1至D14.1中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品设置在固体表面上。
D15.1.实施方案D15.1的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
D16.实施方案D1至D8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
D16.1.实施方案D16的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
D16.2.实施方案D16或D16.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
D17.实施方案D1至D16.2中任一项的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片设置。
D18.实施方案D17的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm的组织切片设置。
D19.实施方案D1至D8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
D20.实施方案D1至D19中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
D21.实施方案D20的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
D22.实施方案D1至D19中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
D23.实施方案D22的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
D24.实施方案D22或D23的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
D25.实施方案D24的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
D26.实施方案D1至D19中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
D27.实施方案D1至D19中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
D28.实施方案D26或D27的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
D29.实施方案D28的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
D30.实施方案D28或D29的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
D31.实施方案D1至D19中任一项的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
D32.实施方案D31的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
D33.实施方案D32的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
D34.实施方案D32或D33的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
D35.实施方案D34的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
D36.实施方案D1至D35中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
D37.实施方案D1至D36中任一项的方法，其中在步骤(c)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
D37.1.实施方案D37的方法，其中所述温度是约55℃。
D37.2.实施方案D37.1的方法，其中所述温度是55℃。
D38.实施方案D1至D36中任一项的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
D38.1.实施方案D38的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
E1.一种从深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供深度福尔马林固定的样品；
b)使所述深度福尔马林固定的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
E1.1.实施方案E1的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品是组织样品。
E1.2.实施方案E1或E1.1的方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述深度福尔马林固定的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
E1.3.实施方案E1.2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
E1.4.实施方案E1.3的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
E1.5.实施方案E1至E1.4中任一项的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品是磨碎的。
E2.实施方案E1至E1.5中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
E3.实施方案E2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
E3.1.实施方案E3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
E4.实施方案E3.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
E4.1.实施方案E4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
E5.实施方案E1至E4.1中任一项的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
E6.实施方案E5的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
E7.实施方案E6的方法，其中所述温度是约74℃。
E7.1.实施方案E7的方法，其中所述温度是74℃。
E7.2.实施方案E1-E1.5中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
E8.实施方案E1至E7.2中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
E9.实施方案E1-E8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
E9.1.实施方案E9的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
E9.2.实施方案E9.1的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
E10.实施方案E9至E9.2中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
E11.实施方案E1-E8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
E12.实施方案E11的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
E13.实施方案E11的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
E13.1.实施方案E11至E13中任一项的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
E13.2.实施方案E13.1的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
E13.3.实施方案E13.1或E13.2的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
E14.实施方案E11的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
E14.1.实施方案E14的方法，其中所述转座酶是Tn5。
E15.实施方案E1至E14.1中任一项的方法，其中将所述深度福尔马林固定的样品设置在固体表面上。
E15.1.实施方案E15.1的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
E16.实施方案E1至E8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
E16.1.实施方案E16的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
E16.2.实施方案E16或E16.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
E17.实施方案E1至E8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
E18.实施方案E1至E17中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
E19.实施方案E18的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
E20.实施方案E1至E17中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
E21.实施方案E20的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
E22.实施方案E20或E21的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
E23.实施方案E22的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
E24.实施方案E1至E17中任一项的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品具有约4年至约20年的存档期。
E25.实施方案E1至E17中任一项的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品具有约20年至约70年的存档期。
E26.实施方案E24或E25的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
E27.实施方案E26的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
E28.实施方案E26或E27的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
E29.实施方案E1至E17中任一项的方法，其中从所述深度福尔马林固定的样品获得的核酸小于200ng。
E30.实施方案E29的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
E31.实施方案E30的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
E32.实施方案E30或E31的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
E33.实施方案E32的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
E34.实施方案E1至E33中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
E35.实施方案E1至E34中任一项的方法，其中在步骤(d)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
E36.实施方案E35的方法，其中所述温度是约55℃。
E37.实施方案E36的方法，其中所述温度是55℃。
E38.实施方案E1至E34中任一项的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
E38.1.实施方案E38的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
F1.一种从包含蛋白质:cfDNA复合物的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供包含蛋白质:cfDNA复合物的样品；
b)使所述蛋白质:cfDNA复合物与相邻的蛋白质:cfDNA复合物交联；和
c)使交联的蛋白质:cfDNA复合物与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息。
F2.实施方案F1的方法，其中所述样品是血清、血浆或尿。
F2.1.实施方案F1或F2的方法，其中所述蛋白质:cfDNA复合物是核小体复合物或染色体复合物。
F2.2.实施方案F1至F2.1中任一项的方法，其中在交联之前将所述样品中的蛋白质:cfDNA复合物与固相接触，从而产生与固相结合的蛋白质:cfDNA复合物。
F3.实施方案F2.2的方法，其中所述固相结合所述蛋白质:cfDNA复合物。
F3.1.实施方案F2.2或F3的方法，其中所述交联剂是甲醛。
F4.实施方案F1至F3.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
F5.实施方案F4的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下一种或多种：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
F6.实施方案F1至F3.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
F7.实施方案F1至F3.1中任一项的方法，其中所述蛋白质:cfDNA复合物从所述固体载体释放，并且所述保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化从所述固体载体释放的所述蛋白质:cfDNA复合物并用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂。
F7.1.实施方案F7的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
F7.2.实施方案F7或F7.1的方法，其中一种或多种用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
F8.实施方案F7至F7.2中任一项的方法，进一步包括一种或多种试剂以亲和纯化所述蛋白质:cfDNA复合物。
F9.实施方案F1至F3.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括结合至固相的Tn5。
F9.1.实施方案F9的方法，其中所述Tn5包括虚拟区室特异性分子条形码。
F10.实施方案F1至F9.1中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA。
F11.实施方案F10的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA进行测序，以确定具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA的甲基化状态。
F12.实施方案F1至F9.1中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
F13.实施方案F12的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
F14.实施方案F1至F13中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
F15.实施方案F1至F14中任一项的方法，其中在步骤(c)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
F16.实施方案F15的方法，其中所述温度是约55℃。
F17.实施方案F16的方法，其中所述温度是55℃。
F18.实施方案F1至F14中任一项的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
F19.实施方案F18的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
G1.一种从包含蛋白质:cfDNA复合物的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供包含蛋白质:cfDNA复合物的样品；
b)使所述样品与固相接触，从而产生与固相结合的蛋白质:cfDNA复合物；
c)使所述蛋白质:cfDNA复合物与相邻的蛋白质:cfDNA复合物或所述固相交联；和
d)使交联的蛋白质:cfDNA复合物与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息。
G2.实施方案G1的方法，其中所述样品是血清、血浆或尿。
G2.1.实施方案G1或G2的方法，其中所述蛋白质:cfDNA复合物是核小体复合物或染色体复合物。
G3.实施方案G1至G2.1中任一项的方法，其中所述固相结合所述蛋白质:cfDNA复合物，并且将结合至所述固相的所述蛋白质:cfDNA复合物与交联试剂接触。
G3.1.实施方案G3的方法，其中所述交联剂是甲醛。
G4.实施方案G1至G2.1中任一项的方法，其中所述固相用交联剂包被，并且所述蛋白质:cfDNA复合物与所述固相交联。
G4.1.实施方案G4的方法，其中所述交联试剂是补骨脂素。
G5.实施方案G1至G4.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
G5.1.实施方案G5的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下一种或多种：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
G6.实施方案G1至G4.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
G7.实施方案G1至G4.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化从所述固体载体释放的所述蛋白质:cfDNA复合物并用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂。
G7.1.实施方案G7的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
G7.2.实施方案G7或G7.1的方法，其中一种或多种用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
G8.实施方案G7至G7.2中任一项的方法，进一步包括一种或多种试剂以在区室化之前亲和纯化所述蛋白质:cfDNA复合物。
G9.实施方案G1-G4.1中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括结合至固相的Tn5。
G9.1.实施方案G9的方法，其中所述Tn5包括虚拟区室特异性分子条形码。
G10.实施方案G1至G9.1中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA。
G11.实施方案G10的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA进行测序，以确定具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA的甲基化状态。
G12.实施方案G1至G9.1中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
G13.实施方案G12的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
G14.实施方案G1至G13中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
G15.实施方案G1至G14中任一项的方法，其中在步骤(d)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
G16.实施方案G15的方法，其中所述温度是约55℃。
G17.实施方案G16的方法，其中所述温度是55℃。
G18.实施方案G1至G14中任一项的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
G19.实施方案G18的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
H1一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
e)将所述裂解的样品与十二烷基硫酸钠(SDS)在74℃的温度下接触40分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和
f)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂原位产生邻近连接的核酸分子，从而保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
H1.1.实施方案H1的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
H2.实施方案H1或H1.1的方法，其中在与所述裂解缓冲液接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
H2.1.实施方案H2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
H2.2.实施方案H2.1的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
H3.实施方案H1至H2.2中任一项的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
H4.实施方案H3的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
H5.实施方案H1至H2.2中任一项的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
H6.实施方案H5的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
H7.实施方案H5或H6的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于没有在74℃的温度下与变性洗涤剂接触40分钟而产生的长距离顺式读数的百分比。
H8.实施方案H7的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
H9.实施方案H1至H2.2中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
H10.实施方案H1至H2.2中任一项的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
H11.实施方案H9或H10的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
H12.实施方案H11的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
H13.实施方案H11或H12的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于没有在74℃的温度下与变性洗涤剂接触40分钟而产生的长距离顺式读数的百分比。
H14.实施方案H1至H2.2中任一项的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
H15.实施方案H14的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
H16.实施方案H15的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
H17.实施方案H15或H16的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于没有在74℃的温度下与变性洗涤剂接触40分钟而产生的长距离顺式读数的百分比。
H18.实施方案H17的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
H19.实施方案H1至H18中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
H20.实施方案H1至H19中任一项的方法，其中在步骤(f)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
H21.实施方案H20的方法，其中所述温度是约55℃。
H22.实施方案H21的方法，其中所述温度是55℃。
H23.实施方案H1至H19中任一项的方法，其中在步骤(f)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
H24.实施方案H23的方法，其中在步骤(f)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
I1.一种从深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供深度福尔马林固定的样品；
b)使所述深度福尔马林固定的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
I1.1.实施方案I1的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品是组织样品。
I1.2.实施方案I1或I1.1的方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述深度福尔马林固定的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
I1.3.实施方案I1.2的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
I1.4.实施方案I1.3的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
I1.5.实施方案I1至I1.4中任一项的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品是磨碎的。
I2.实施方案I1至I1.5中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
I3.实施方案I2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
I3.1.实施方案I3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
I4.实施方案I3.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
I4.1.实施方案I4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
I5.实施方案I1至I4.1中任一项的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
I6.实施方案I5的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
I7.实施方案I6的方法，其中所述温度是约74℃。
I7.1.实施方案I7的方法，其中所述温度是74℃。
I7.2.实施方案I1-I1.5中任一项的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
I8.实施方案I1至I7.2中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
I9.实施方案I1-I8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
I9.1.实施方案I9的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
I9.2.实施方案I9.1的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
I10.实施方案I9至I9.2中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
I11.实施方案I1-I8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
I12.实施方案I11的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
I13.实施方案I11的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
I13.1.实施方案I11至I13中任一项的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
I13.2.实施方案I13.1的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
I13.3.实施方案I13.1或I13.2的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
II4.实施方案I11的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
I14.1.实施方案I14的方法，其中所述转座酶是Tn5。
I15.实施方案I1至I14.1中任一项的方法，其中将所述深度福尔马林固定的样品设置在固体表面上。
I15.1.实施方案I15.1的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
I16.实施方案I1至I8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
I16.1.实施方案I16的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
I16.2.实施方案I16或I16.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
I17.实施方案I1至I8中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
I18.实施方案I1至I17中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
I19.实施方案I18的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
I20.实施方案I1至I17中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
I21.实施方案I20的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
I22.实施方案I20或I21的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
I23.实施方案I22的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
I24.实施方案I1至I17中任一项的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品具有约4年至约20年的存档期。
I25.实施方案I1至I17中任一项的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品具有约20年至约70年的存档期。
I26.实施方案I24或I25的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
I27.实施方案I26的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
I28.实施方案I26或I27的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
I29.实施方案I1至I17中任一项的方法，其中从所述深度福尔马林固定的样品获得的核酸小于200ng。
I30.实施方案I29的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
I31.实施方案I30的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
I32.实施方案I30或I31的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
I33.实施方案I32的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
I34.实施方案I1至I33中任一项的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
I35.实施方案I1至I34中任一项的方法，其中在步骤(c)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
I36.实施方案I35的方法，其中所述温度是约55℃。
I37.实施方案I36的方法，其中所述温度是55℃。
I38.实施方案I1至I34中任一项的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
I39.实施方案I38的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
J1.一种试剂盒，包括：
脱蜡试剂；
裂解缓冲液；
变性洗涤剂；和
保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂。
J1.1.实施方案J1的试剂盒，其中所述脱蜡试剂是二甲苯或矿物油。
J1.2.实施方案J1或J1.1的试剂盒，其中所述裂解缓冲液包括一种或多种盐、蛋白酶抑制剂和非离子非变性洗涤剂。
J1.3.实施方案J1至J1.2中任一项的试剂盒，其中所述变性洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
J1.4.实施方案J1至J1.3中任一项的试剂盒，包括用于淬灭所述变性洗涤剂的试剂。
J1.5.实施方案J1.4的试剂盒，其中所述试剂是TritonX-100。
J1.6.实施方案J1至J1.5中任一项的试剂盒，包括细胞外基质蛋白酶。
J1.7.实施方案J1.6的试剂盒，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
J1.8.实施方案J1.7的试剂盒，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
J1.9.实施方案J1至J1.8中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
J1.9.1.实施方案J1.9的试剂盒，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
J1.9.2.实施方案J1.9.1的试剂盒，包括两种限制性核酸内切酶。
J1.10.实施方案J1至J1.8中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素。
J1.10.1.实施方案J1.10的试剂盒，其中所述固相元素是珠子。
J1.11.实施方案J1.10或J1.10.1的试剂盒，其中所述固相元素是用核酸交联试剂官能化的固相基质。
J1.12.实施方案J1.11的试剂盒，其中所述交联试剂是补骨脂素。
J1.13.实施方案J1.10或J1.10.1的试剂盒，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质。
J1.13.1.实施方案J1.13的试剂盒，其中所述亲和纯化分子是链霉亲和素。
J1.13.2.实施方案J1.13或J1.13.1的试剂盒，包括亲和纯化标记物。
J1.13.3.实施方案J1.13.2的试剂盒，其中所述亲和纯化标记物是生物素。
J1.14.实施方案J1.10或J1.10.1的试剂盒，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质。
J1.15.实施方案J1.14的试剂盒，其中所述转座酶是Tn5。
J1.16.实施方案J1至J1.8中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室特异性分子条形码、通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂和/或进行区室化的试剂。
J1.16.1.实施方案J1.16的试剂盒，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
J1.16.2.实施方案J1.16或J1.16.1的试剂盒，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
J1.17.实施方案J1至J1.8中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
J1.17.1.实施方案J1.17的试剂盒，其中所述Tn5四聚体包含生物素化的接头序列。
J1.18.实施方案J1至J1.17.1中任一项的试剂盒，包括病理玻片。
J1.19.实施方案J1至J1.18中任一项的试剂盒，包括亚硫酸氢盐试剂。
J2.一种试剂盒，包括：
脱蜡试剂；
变性洗涤剂；和
保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂。
J2.1.实施方案J2的试剂盒，其中所述脱蜡试剂是二甲苯或矿物油。
J2.2.实施方案J2或J2.1的试剂盒，其中所述变性洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
J2.3.实施方案J2至J2.2中任一项的试剂盒，包括用于淬灭所述变性洗涤剂的试剂。
J2.4.实施方案J2.3的试剂盒，其中所述试剂是TritonX-100。
J2.5.实施方案J2至J2.4中任一项的试剂盒，包括细胞外基质蛋白酶。
J2.6.实施方案J2.5的试剂盒，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
J2.7.实施方案J2.6的试剂盒，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
J2.8.实施方案J2至J2.7中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
J2.8.1.实施方案J2.8的试剂盒，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
J2.8.2.实施方案J2.8.1的试剂盒，包括两种限制性核酸内切酶。
J2.9.实施方案J2至J2.7中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素。
J2.9.1.实施方案J2.9的试剂盒，其中所述固相元素是珠子。
J2.10.实施方案J2.9或J2.9.1的试剂盒，其中所述固相元素是用核酸交联试剂官能化的固相基质。
J2.11.实施方案J2.10的试剂盒，其中所述交联试剂是补骨脂素。
J2.12.实施方案J2.9或J2.9.1的试剂盒，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质。
J2.12.1.实施方案J2.12的试剂盒，其中所述亲和纯化分子是链霉亲和素。
J2.12.2.实施方案J2.12或J2.12.1的试剂盒，包括亲和纯化标记物。
J2.12.3.实施方案J2.12.2的试剂盒，其中所述亲和纯化标记物是生物素。
J2.13.实施方案J2.9或J2.9.1的试剂盒，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质。
J2.14.实施方案J2.13的试剂盒，其中所述转座酶是Tn5。
J2.15.实施方案J2至J2.7中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室特异性分子条形码、通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂和/或进行区室化的试剂。
J2.15.1.实施方案J2.15的试剂盒，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
J2.15.2.实施方案J2.15或J2.15.1的试剂盒，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
J2.16.实施方案J2至J2.7中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
J2.16.1.实施方案J2.16的试剂盒，其中所述Tn5四聚体包含生物素化的接头序列。
J2.17.实施方案J2至J2.16.1中任一项的试剂盒，包括病理玻片。
J2.18.实施方案J2至J2.17中任一项的试剂盒，包括亚硫酸氢盐试剂。
J3.一种试剂盒，包括：
裂解缓冲液；
变性洗涤剂；和
保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂。
J3.1.实施方案J3的试剂盒，其中所述裂解缓冲液包括一种或多种盐、蛋白酶抑制剂和非离子非变性洗涤剂。
J3.2.实施方案J3或J3.1的试剂盒，包括用于淬灭所述变性洗涤剂的试剂。
J3.3.实施方案J3.2的试剂盒，其中所述试剂是TritonX-100。
J3.4.实施方案J3至J3.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
J3.5.实施方案J3.4的试剂盒，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
J3.5.1.实施方案J3.5的试剂盒，包括两种限制性核酸内切酶。
J3.6.实施方案J3至J3.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素。
J3.6.1.实施方案J3.6的试剂盒，其中所述固相元素是珠子。
J3.7.实施方案J3.6或J3.6.1的试剂盒，其中所述固相元素是用核酸交联试剂官能化的固相基质。
J3.8.实施方案J3.7的试剂盒，其中所述交联试剂是补骨脂素。
J3.9.实施方案J3.6或J3.6.1的试剂盒，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质。
J3.9.1.实施方案J3.9的试剂盒，其中所述亲和纯化分子是链霉亲和素。
J3.9.2.实施方案J3.9或J3.9.1的试剂盒，包括亲和纯化标记物。
J3.9.3.实施方案J3.9.2的试剂盒，其中所述亲和纯化标记物是生物素。
J3.10.实施方案J3.6或J3.6.1的试剂盒，其中所述固相元素是用包含分子条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质。
J3.11.实施方案J3.10的试剂盒，其中所述转座酶是Tn5。
J3.12.实施方案J3至J3.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室特异性分子条形码、通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂和/或进行区室化的试剂。
J3.12.1.实施方案J3.12的试剂盒，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
J3.12.2.实施方案J3.12或J3.12.1的试剂盒，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
J3.13.实施方案J3至J3.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
J3.13.1.实施方案J3.13的试剂盒，其中所述Tn5四聚体包含生物素化的接头序列。
J3.14.实施方案J3至J3.13.1中任一项的试剂盒，包括病理玻片。
J3.15.实施方案J3至J3.14中任一项的试剂盒，包括亚硫酸氢盐试剂。
J3.16.实施方案J3至J3.15中任一项的试剂盒，包括细胞外基质蛋白酶。
J3.17.实施方案J3.16的试剂盒，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
J3.18.实施方案J3.17的试剂盒，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
J4.一种试剂盒，包括：
变性洗涤剂；和
保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂。
J4.1.实施方案J4的试剂盒，其中所述变性洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
J4.2.实施方案J4或J4.1的试剂盒，包括用于淬灭所述变性洗涤剂的试剂。
J4.3.实施方案J4.2的试剂盒，其中所述试剂是TritonX-100。
J4.4.实施方案J4至J4.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
J4.5.实施方案J4.4的试剂盒，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
J4.5.1.实施方案J4.5的试剂盒，包括两种限制性核酸内切酶。
J4.6.实施方案J4至J4.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素。
J4.7.实施方案J4.6的试剂盒，其中所述固相元素是珠子。
J4.8.实施方案J4.6或J4.7的试剂盒，其中所述固相元素是用核酸交联试剂官能化的固相基质。
J4.9.实施方案J4.8的试剂盒，其中所述交联试剂是补骨脂素。
J4.10.实施方案J4.6或J4.7的试剂盒，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质。
J4.10.1.实施方案J4.10的试剂盒，其中所述亲和纯化分子是链霉亲和素。
J4.10.2.实施方案J4.10或J4.10.1的试剂盒，包括亲和纯化标记物。
J4.10.3.实施方案J4.10.2的试剂盒，其中所述亲和纯化标记物是生物素。
J4.11.实施方案J4.6或J4.7的试剂盒，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质。
J4.12.实施方案J4.11的试剂盒，其中所述转座酶是Tn5。
J4.13.实施方案J4至J4.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室特异性分子条形码、通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂和/或进行区室化的试剂。
J4.13.1.实施方案J4.13的试剂盒，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
J4.13.2.实施方案J4.13或J4.13.1的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
J4.13.3.实施方案J4.13至J4.13.2中任一项的试剂盒，进一步包括一种或多种亲和纯化天然的空间邻近核酸分子的试剂。
J4.14.实施方案J4至J4.3中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
J4.14.1.实施方案J4.14的试剂盒，其中所述Tn5四聚体包含生物素化的接头序列。
J4.15.实施方案J4至J4.14.1中任一项的试剂盒，包括病理玻片。
J4.16.实施方案J4至J4.15中任一项的试剂盒，包括亚硫酸氢盐试剂。
J4.17.实施方案J4至J4.16中任一项的试剂盒，包括细胞外基质蛋白酶。
J4.18.实施方案J4.17的试剂盒，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
J4.19.实施方案J4.18的试剂盒，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
J5.一种试剂盒，包括：
固相；和
保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂。
J5.1.实施方案J5的试剂盒，其中所述固相包括羧化表面。
J5.2.实施方案J5.1的试剂盒，其中所述固相包括微板或珠子。
J5.3.实施方案J5的试剂盒，其中所述固相被交联试剂包被。
J5.4.实施方案J5.3的试剂盒，其中所述交联试剂是补骨脂素。
J5.5.实施方案J5.3或15.4的试剂盒，其中所述固相是磁珠。
J5.6.实施方案J5至J5.2中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
J5.7.实施方案J5.6的试剂盒，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
J5.8.实施方案J5至J5.5中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
J5.9.实施方案J5.8的试剂盒，其中所述Tn5四聚体包含生物素化的接头序列。
J5.10.实施方案J5至J5.4中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室特异性分子条形码、通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂和/或进行区室化的试剂。
J5.11.实施方案J5.10的试剂盒，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
J5.11.1.实施方案J5.10或J5.11的试剂盒，其中一种或多种用区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
J5.11.2.实施方案J5.10至J5.11.1中任一项的试剂盒，进一步包括一种或多种亲和纯化天然的空间邻近核酸分子的试剂。
J5.12.实施方案J5至J5.2中任一项的试剂盒，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括包含区室特异性的条形码化寡核苷酸的转座体，并且所述包含区室特异性的条形码化寡核苷酸的转座体连接至固相元素。
J5.13.实施方案J15.12的试剂盒，其中所述转座体是Tn5。
J5.14.实施方案J5至J5.13中任一项的试剂盒，包括亚硫酸氢盐试剂。
K1.一种用于使为了保留空间邻近连续性信息而交联的样品中的交联逆转的方法，其中通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
K2.实施方案K1的方法，其中所述温度是约55℃。
K3.实施方案K2的方法，其中所述温度是55℃。
L1.一种用于使为了保留空间邻近连续性信息而交联的样品中的交联逆转的方法，其中通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
L2.实施方案L1的方法，其中通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
M1.一种从细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供细胞的福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
e)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在约62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和
f)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
M1.1.实施方案M1的方法，其中所述温度是62℃。
M2.实施方案M1或M1.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
M3.实施方案M2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
M4.实施方案M3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
M5.实施方案M4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
M6.实施方案M1至M5中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
M7.实施方案M1至M6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
M8.实施方案M7的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
M9.实施方案M8的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
M10.实施方案M7至M9中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
M11.实施方案M1至M6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
M12.实施方案M1至M6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和通过将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸进行标记的试剂。
M13.实施方案M1至M6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
M14.实施方案M1至M13中任一项的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
M15.实施方案M1至M14中任一项的方法，其中省略所述样品的脱蜡/再水化。
N1.一种从细胞的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供细胞的福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与变性洗涤剂在约62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和
e)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
N1.1.实施方案N1的方法，其中所述温度是62℃。
N2.实施方案N1或N1.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
N3.实施方案N2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
N4.实施方案N3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
N5.实施方案N4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
N6.实施方案N1至N5中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
N7.实施方案N1至N6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
N8.实施方案N7的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
N9.实施方案N8的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
N10.实施方案N7至N9中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
N11.实施方案N1至N6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
N12.实施方案N1至N6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和通过将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸进行标记的试剂。
N13.实施方案N1至N6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
N14.实施方案N1至N13中任一项的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
N15.实施方案N1至N14中任一项的方法，其中省略所述样品的脱蜡/再水化。
O1.一种从细胞的深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供细胞的深度福尔马林固定的样品；
b)使所述深度福尔马林固定的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在约62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和
d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
O1.1.实施方案O1的方法，其中所述温度是62℃。
O2.实施方案O1或O1.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
O3.实施方案O2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
O4.实施方案O3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
O5.实施方案O4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
O6.实施方案O1至O5中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
O7.实施方案O1至O6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
O8.实施方案O7的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
O9.实施方案O8的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
O10.实施方案O7至O9中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
O11.实施方案O1至O6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
O12.实施方案O1至O6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和通过将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸进行标记的试剂。
O13.实施方案O1至O6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
O14.实施方案O1至O13中任一项的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
P1.一种从细胞的深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供细胞的深度福尔马林固定的样品；
b)使所述深度福尔马林固定的样品与变性洗涤剂在约62℃的温度下接触超过10分钟，从而产生增溶和解压缩的样品；和
c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
P1.1.实施方案P1的方法，其中所述温度是62℃。
P2.实施方案P1或P1.1的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
P3.实施方案P2的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
P4.实施方案P3的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
P5.实施方案P4的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
P6.实施方案P1至P5中任一项的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
P7.实施方案P1至P6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
P8.实施方案P7的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
P9.实施方案P8的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
P10.实施方案P7至P9中任一项的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
P11.实施方案P1至P6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
P12.实施方案P1至P6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括区室化和通过将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸进行标记的试剂。
P13.实施方案P1至P6中任一项的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
P14.实施方案P1至P13中任一项的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
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本文中引用的每个专利、专利申请、出版物和文件的全部内容通过引用并入本文中。引用以上专利、专利申请、出版物和文件并不意味着承认上述任何内容都是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。它们的引用并不表示在搜寻相关公开。关于文件日期或内容的所有声明均基于可用信息，并非承认其准确性或正确性。
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在随后的权利要求中阐述了本技术的某些实施方案。
机译： 保留空间邻近性信息的核酸制备方法和组合物
机译： 保留空间邻近性信息的核酸制备方法和组合物
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