包含YxaL蛋白或其同源蛋白的用于促进植物生长的组合物以及用于大量产生YxaL蛋白的方法

技术领域

本公开内容涉及包含YxaL蛋白或与其同源的蛋白的用于促进植物生长的组合物以及用于大量产生YxaL蛋白的方法。

本公开内容是在由农村振兴厅(

背景技术

植物经常暴露于多种外部应激，并且植物根从土壤吸收必需物质的能力由于这些应激而丧失。由于该原因，因此植物不能产生足够的维生素、氨基酸、激素等，并且在植物的生长、发育和生产力方面出现问题。作为克服这些问题的方法，已开发了用于帮助植物生长的植物生长促进剂。

目前使用的一般植物生长促进剂的主要组分包含植物激素、腐殖酸和海藻提取物。然而，目前市售的植物生长促进剂的问题在于，由于它们由多种化学物质构成，因此它们的作用是不清楚的。

同时，报道与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株中的DNA解旋酶PcrA相互作用的YxaL蛋白在其N端包含用于通过细胞质膜的信号肽。在这方面，预测胞外蛋白YxaL与胞内解旋酶PcrA或DNA之间的相互作用位点仍是一个难题。另外，预测YxaL的从中去除N端信号肽的成熟部分包含形成β-螺旋桨结构的重复吡咯并-喹啉醌(PQQ)结构域，但是从未报道YxaL的胞内定位和功能。

因此，本发明人进行了研究以开发植物生长促进剂以及用于其大量产生的方法，从而完成了本公开内容。

发明内容

技术问题

本公开内容的一个目的是提供包含YxaL蛋白或与其同源的蛋白的用于促进植物生长的组合物。

本公开内容的另一个目的是提供重组表达载体，其包含：由SEQ ID NO：25的核苷酸序列组成的DNA片段；以及与所述DNA片段可操作连接的启动子。

本公开内容的另一个目的是提供用于大量产生YxaL蛋白的转化细胞系，所述转化细胞系包含所述重组表达载体。

本公开内容的又一个目的是提供用于大量产生YxaL蛋白的方法，所述方法包括通过用所述重组表达载体转化大肠杆菌(E.coli)来过表达所述YxaL蛋白的步骤。

技术方案

本公开内容的一个方面提供了包含YxaL蛋白或与其同源的蛋白的用于促进植物生长的组合物。

根据本公开内容的一个实施方案，所述蛋白可来源于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)菌株。

根据本公开内容的一个实施方案，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株可以是贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13。

根据本公开内容的一个实施方案，所述YxaL蛋白可由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。

根据本公开内容的一个实施方案，同源蛋白可包含选自SEQ ID NO：4至19中任一项的氨基酸序列。

根据本公开内容的一个实施方案，所述植物可以是拟南芥或稻。

本公开内容的另一个方面提供了重组表达载体，其包含：由SEQ ID NO：25的核苷酸序列组成的DNA片段；以及与所述DNA片段可操作连接的启动子。

根据本公开内容的一个实施方案，所述DNA片段可来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13。

本公开内容的另一个方面提供了用于大量产生YxaL蛋白的转化细胞系，所述转化细胞系包含所述重组表达载体。

本公开内容的另一个方面提供了用于大量产生YxaL蛋白的方法，所述方法包括通过用所述重组表达载体转化大肠杆菌来过表达所述YxaL蛋白的步骤。

有益效果

根据包含YxaL蛋白的用于促进植物生长的组合物和用于大量产生YxaL蛋白的方法，所述YxaL蛋白可在重组转化细胞系中组成性地表达，并从培养基分离。当将所述YxaL蛋白应用于浸种处理时，提高了根的发育并且提高了参与根生长的植物基因的表达，从而有利于植物生长。因此，YxaL蛋白可有效地用于促进植物生长。

附图说明

图1示出了YxaL同源蛋白序列的系统发生分析的结果。在本公开内容中使用的贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13用红色圆圈指示。

图2示出了使用Ni NTA琼脂糖柱的重组蛋白产生和成熟YxaL蛋白的纯化。图2(a)示出了使用高浓度咪唑(50至250mM)以逐步的方式洗脱具有N-His TEV切割位点的重组YxaL蛋白并对洗脱的YxaL蛋白进行纯化的结果，并且图2(b)示出了尺寸排阻色谱法和SDSPAGE分析的结果，其表明了经纯化的YxaL蛋白的尺寸和纯度。

图3是示出在600nm的光密度(OD 600)下分析贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)菌株GH1-13的生长曲线的结果的图。

图4示出了进行SDS PAGE和Western印迹以确定贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13的培养物上清液中YxaL蛋白的位置的结果。图4(a)示出了表明YxaL蛋白在细胞中组成性地表达并分泌到细胞外的结果，并且图4(b)示出了表明在上清液中产生了约100μg/l的半衰期为约1.6小时的YxaL蛋白的结果。

图5示出了在贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13生长期的不同时间点(5、8、12和24小时)测量yxaL基因相对于16S rRNA基因的相对转录水平的结果。

图6是示出用浸泡溶液中的不同浓度的经纯化的YxaL蛋白处理的拟南芥种子的萌发率的图(每组n＞100)。

图7是示出用浸泡溶液中的不同浓度的经纯化的YxaL蛋白处理的拟南芥1周龄根的长度的图(每组n＞30)。

图8描绘了比较用在浸泡溶液中浓度为1mg/ml的经纯化的YxaL蛋白处理的拟南芥1周龄根结构的照片。

图9示出了评价YxaL蛋白对稻种子发育的作用的结果。图9(a)描绘了示出用浸泡溶液中的不同浓度的经纯化的YxaL蛋白处理的稻1周龄根的外观的照片，图9(b)是示出主根长度的图，并且图9(c)是示出小根长度的图。

图10描绘了示出在用浸泡溶液中的不同浓度的经纯化的YxaL蛋白处理的拟南芥1周龄根中IAA1(a)、GH3.3(b)、ACS11(c)和AFB4(d)的相对表达水平(ΔΔCq)的图。

具体实施方式

本公开内容的一个方面提供了包含YxaL蛋白或与其同源的蛋白的用于促进植物生长的组合物。

在本公开内容中，提供了可用于促进植物生长的YxaL蛋白，以及用于大量产生所述YxaL蛋白的方法。

如本文中使用的，术语“促进植物生长”是指提高植物生长和代谢，并且可包括例如新的植物生长、根发育和细胞扩增。根据本公开内容的包含YxaL蛋白的用于促进植物生长的组合物可提高根发育并且提高参与根生长的植物基因的表达，从而有利于植物生长。因此，所述组合物可有效地用于促进植物生长。

如本文中使用的，术语“同源蛋白”是指具有相似氨基酸序列和三维结构的相同来源的蛋白质。

在本公开内容中，比较了YxaL蛋白的氨基酸序列与β-螺旋桨基序的序列和位置的同源性，从而将YxaL蛋白分类为两种类型：YxaL1和YxaL2共有序列。确定具有高氨基酸序列同源性和高度保守的氨基酸序列的YxaL蛋白类型，如下表1中所示。

[表1]

同时，确定了YxaL型蛋白中包含的β-螺旋桨和基序的序列和位置(表2)，如下表3中所示。

[表2]

[表3]

由于与YxaL蛋白的氨基酸序列具有高同源性并且具有与YxaL蛋白相同的β-螺旋桨基序的YxaL1型蛋白被命名为脓肿分枝杆菌马赛亚种(Mycobacteroides abscessussubsp.massiliense)BamB(NCBI登录no.SLA98061.1)，因此YxaL同源蛋白的名称和YxaL同源蛋白所来源的细菌物种的名称可被不同地指定。

除YxaL蛋白之外，根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物还可包含表现出植物生长促进活性的一种或更多种已知组分。

根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物可根据植物的种类和植物的发育程度以不同的量使用持续不同的时间段以处理植物。对于使用，可在浸种期间将根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物添加至浸泡溶液。在将所述组合物添加至浸种溶液用于使用时，其可以以0.01至100mg/l，优选0.1至10mg/l，最优选0.5至5mg/l的浓度添加。

当将根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物喷洒到植物的幼苗、叶或根或者植物根周围的土壤时，所述组合物可在向植物喷洒肥料或农用化学品之前或之后喷洒，或者可与肥料或农用化学品一起喷洒，或者可单独喷洒。肥料可以是在植物栽培中通常使用的无机或有机肥料，并且可包含例如氮、磷酸、钾、矿物质和/或痕量元素。无机材料可以是选自钙、镁、硫和铁中的任一种或更多种，并且痕量元素可以是选自锰、铜、锌、硼和钼中的任一种或更多种。农用化学品可以是在植物栽培中通常使用的杀菌剂、农药和/或除草剂。

根据本公开内容的一个实施方案，所述蛋白质可来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株。

根据本公开内容的一个实施方案，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株可以是属于与土壤和植物相关的解淀粉芽孢杆菌-暹罗芽孢杆菌-贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusamyloliequefaciens-siamensis-velezensis)组的菌株。

根据本公开内容的一个实施方案，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株可以是贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13。

在本说明书中特别地确定了来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13的YxaL蛋白的植物生长促进作用。因此，根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物中包含的YxaL蛋白优选来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13。

根据本公开内容的一个实施方案，YxaL蛋白可由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成。

SEQ ID NO：20的氨基酸序列来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13，并且由SEQ IDNO：20的氨基酸序列组成的蛋白质是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列中除第1至44位氨基酸残基(构成细胞膜信号序列)之外的第45至415位氨基酸残基组成的蛋白质(表4)。

[表4]

根据本公开内容的一个实施方案，同源蛋白可包含选自SEQ ID NO：4至19中任一项的氨基酸序列。

在与YxaL蛋白同源的蛋白质中，分别包含SEQ ID NO：4至19的氨基酸序列的同源蛋白(其为β-螺旋桨基序)，可像YxaL蛋白一样显示出植物生长促进作用。

根据本公开内容的一个实施方案，植物可以是拟南芥或稻。

在本说明书中特别确定了根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物中包含的YxaL蛋白具有促进拟南芥和稻的根发育的作用以及提高参与根生长的植物基因表达的作用。因此，根据本公开内容的用于促进植物生长的组合物可有效地用于促进植物(例如，拟南芥和稻)的生长。

本公开内容的另一个方面提供了重组表达载体，其包含：由SEQ ID NO：25的核苷酸序列组成的DNA片段；以及与该DNA片段可操作连接的启动子。

本公开内容的重组表达载体包含编码YxaL蛋白的基因，特别是由SEQ ID NO：25的核苷酸序列组成的DNA片段。当将本公开内容的重组表达载体转化到例如大肠杆菌中时，其可诱导yxaL基因的组成型表达。因此，本公开内容的重组表达载体可有效地用于大量产生YxaL蛋白。

对于YxaL(第45至415位氨基酸残基)基因核苷酸序列的PCR扩增和克隆，可使用SEQ ID NO：21和22的引物序列(表5)，并且所述序列还可在加工之后使用(SEQ ID NO：23和24)。

[表5]

如本文中使用的，术语“重组表达载体”是指重组DNA分子，其包含期望的编码序列和在特定的宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的合适核酸序列。已知可在真核细胞中使用的启动子、增强子以及终止信号和聚腺苷酸化信号。

如本文中使用的，术语“可操作连接”是指基因表达控制序列与另一个核苷酸序列之间的功能性连接。基因表达控制序列可以是选自复制起点、启动子和转录终止序列(终止子)中的至少一种。转录终止序列可以是聚腺苷酸化序列(pA)，并且复制起点可以是但不限于f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺复制起点、AAV复制起点或BBV复制起点。

如本文中使用的，术语“启动子”意指结构基因上游的DNA区域，并且是指RNA聚合酶与之结合以起始转录的DNA分子。

根据本公开内容的一个实施方案的启动子是控制特定基因的转录起始的转录控制序列之一，并且可以是长度为约100bp至约2,500bp的多核苷酸片段。例如，启动子可选自巨细胞病毒(CMV)启动子(例如，人或小鼠CMV立即早期启动子)、U6启动子、EF1-α(延伸因子1-a)启动子、EF1-α短(EFS)启动子、SV40启动子、腺病毒启动子(主要晚期启动子)、pL-λ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子、牛痘病毒7.5K启动子、HSV tk启动子、SV40E1启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、泛素C启动子、人白介素-2(IL-2)基因启动子、人淋巴毒素基因启动子和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)基因启动子，但不限于此。

根据本公开内容的一个实施方案的重组表达载体可选自质粒载体、黏粒载体和病毒载体，例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。可用作重组表达载体的载体可基于但不限于以下构建：质粒(例如，pcDNA系列、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)、病毒载体(例如，腺苷相关病毒(AAV)载体等)，等等，其在本领域中使用。

本公开内容的重组表达载体还可包含至少一种可选标志物。标志物通常是具有能够通过常规化学方法选择的特性的核酸序列，并且包含能够区分经转染细胞与未经转染细胞的任何基因。标志物的一些实例包括但不限于对除草剂例如草甘膦、草铵膦或草丁膦具有抗性的基因，以及对抗生素例如氨苄青霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或氯霉素具有抗性的基因。

可使用本领域公知的基因重组技术来构建本公开内容的重组表达载体，并且可使用本领域通常已知的酶来进行位点特异性DNA切割和连接。

根据本公开内容的一个实施方案，贝莱斯芽孢杆菌菌株可以是贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13。

本公开内容的另一个方面提供了用于大量产生YxaL蛋白的转化细胞系，所述转化细胞系包含重组表达载体，所述重组表达载体包含：由SEQ ID NO：25的核苷酸序列组成的DNA片段；以及与该DNA片段可操作连接的启动子。

为了产生包含根据本公开内容的一个实施方案的重组表达载体的转化细胞系，可使用本领域已知的用于将核酸分子引入到生物体、细胞、组织或器官中的方法，并且如本领域中已知的，可进行根据宿主细胞选择的合适的标准技术。该方法的一些实例包括但不限于电穿孔、磷酸钙(CaPO

可用于转化细胞系的细胞可以是大肠杆菌，但不限于此。

本公开内容的又一个方面提供了用于大量产生YxaL蛋白的方法，所述方法包括通过用重组表达载体转化大肠杆菌来过表达YxaL蛋白的步骤，所述重组表达载体包含：由SEQID NO：25的核苷酸序列组成的DNA片段；以及与该DNA片段可操作连接的启动子。

包含本公开内容的重组表达载体的本公开内容的转化细胞系可通过重组表达载体中存在的yxaL基因的组成型表达来产生YxaL蛋白。另外，由于产生的YxaL蛋白被释放到培养基中，因此可从本公开内容的转化细胞系的培养基中纯化YxaL蛋白，并由此可有效地将转化细胞系用于产生大量的YxaL蛋白。

发明实施方式

在下文中，将参考一个或更多个实施例更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例用于通过示例的方式来说明本公开内容，并且本公开内容的范围不限于这些实施例。

实施例1.用于分析YxaL蛋白的促进植物生长作用的方法

在-80℃下，从在50％甘油中的冷冻储液中复苏贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13(图1)并随后在TSB(胰蛋白酶大豆肉汤)(BD，Sparks，USA)板上划线。在通气的情况下在25℃下在TSB中培养单个菌落(180rpm)，并在600nm的光密度(OD 600)下测量菌株的生长。

使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，USA)提取菌株GH1-13的基因组DNA。用以下引物(表6)通过PCR扩增编码成熟YxaL蛋白的DNA片段(第45至415位氨基酸残基)。

[表6]

加下划线的NcoI和XhoI限制性内切酶位点与具有与TEV蛋白酶切割位点连接之N-His标签的pProEX-HTA质粒中的那些相容。在克隆yxaL基因之后，将所得的pProEX-YxaL(N-His-TEV)质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。由该引物扩增的DNA片段的序列在下表7中示出。

[表7]

对于转化，将在37℃下在振荡(200rpm)下培养的在LB培养基中指数生长(在600nm下的浊度＝0.3)的菌株在冰上保持30分钟以使生长停止，并随后在4℃下以4,000rpm离心，并去除上清液。然后，将菌株用50ml TSS培养基中包含的组合物(5g PEG8000、1.5ml 1MMgCl

将经转化的细胞在37℃下在通气的情况下(180rpm)于1L含100mg氨苄青霉素的LB培养基中培养，并且当细胞达到约0.5的光密度时，将细胞用0.2mM IPTG处理1小时来诱导重组YxaL蛋白的过表达。收获细胞，用1mM巯基乙醇和蛋白酶混合物(Roche Diagnostics，Indianapolis，USA)处理，并随后通过在冰水浴中重复的超声来破裂。

蛋白质纯化在4℃下进行。在以21,000×g离心15分钟之后，将上清液转移至新的容器，与20mM咪唑和Ni NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden，Germany)混合，并随后在旋转振荡器上搅拌1小时。将结合蛋白的琼脂糖装载到柱上，用1×PBS(1000mL水中8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na

在使用G25琼脂糖凝胶脱盐柱用1×PBS交换缓冲液之后，将经纯化蛋白与His标记的TEV蛋白酶以100∶1的比例混合以去除重组蛋白的N-His-TEV位点。此时，在用TEV蛋白酶(N-His)进行消化以从重组蛋白去除N-His-TEV位点的过程中，重复进行Ni NTA亲和色谱法以纯化YxaL蛋白。

通过尺寸排阻色谱法和SDS PAGE分析来分析经纯化蛋白的尺寸和纯度。

特别地，对于尺寸排阻色谱法，将2mg通过Ni-NTA柱纯化的蛋白浓缩物装载到Superdex

同时，将显示蛋白质吸光度(280nm)的级分的等分试样(10μl)与相同量的补充有5％巯基乙醇的Laemmli缓冲液(含2％SDS、10％甘油、25mM Tris/HCl和少量溴酚蓝色指示剂，pH 6.8)混合，并通过在95℃下加热15分钟失活。然后，根据Laemmli开发的SDS PAGE法制备10％丙烯酰胺凝胶并用于分析。

使用经纯化的抗YxaL IgG作为一抗(以1∶20,000稀释)，然后使用具有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)缀合物的鸡抗兔IgG二抗(Abcam，Cambridge，UK)和Western印迹检测试剂盒(Advansta，Menlo Park，USA)进行检测。使用ChemiDoc XRS图像分析仪(Bio-Rad，Hercules，USA)获取化学发光图像，并使用分子动力学ImageQuant软件5.2版(GE Healthcare Life Science)处理图像。

使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)合成cDNA，并使用Qiagen QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒和Roche LightCycler Nano仪器进行定量PCR(quantitative PCR，qPCR)。下表8中示出了所使用的qPCR引物。在将qPCR数据归一化至16S和18S rRNA水平之后，通过ΔΔCq法计算相对基因表达。

[表8]

将拟南芥和稻(Oryza sativa)种子在室温(25℃)下用2％次氯酸盐和0.05％Triton-X消毒10分钟。将种子用无菌水洗涤数次，并随后在室温下用浸泡溶液中的YxaL蛋白(在实施例1-1中纯化并且制备的浓度为0至100mg/l)处理2小时。

将经处理的种子种植在0.5％NuSieve GTG琼脂糖(FMC Bioproduct，Rockland，USA)板上，所述板含0.5％MS培养基中的1％蔗糖和0.05％MES缓冲液(pH 5.7)，所述0.5％MS培养基补充或不补充终浓度为0.5μM的吲哚-3-乙酸(Sigma，St Louis，USA)。

在种植之后2天，通过在显微镜下对萌发的种子进行计数来评价拟南芥和稻种子的萌发率。

通过Student’s t检验和ANOVA分析对来自至少三个独立重复的实验数据进行统计分析。结果表示为平均值±标准偏差，并且小于0.05的P值被认为是统计学显著的。

实施例2.确定来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13的YxaL蛋白

通过进行实施例1-2以高产率获得25mg YxaL蛋白。为了确定获得的来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13的蛋白质是否为YxaL蛋白，进行实施例1-3。

作为结果，确定了实施例1-2中获得的蛋白质是分子量为39,784的单体蛋白质(图2)。另外，确定了在YxaL基因重组大肠杆菌系统中过表达并且使用Ni NTA柱和TEV蛋白酶纯化的蛋白质的氨基酸序列与来源于贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13的成熟YxaL蛋白的氨基酸序列(第45至415位氨基酸残基；SEQ ID NO：20)相同。

实施例3.确定yxaL基因在贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13中的组成型表达

为了确定贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13的生长模式，进行了实施例1-1。

作为结果，确定了贝莱斯芽孢杆菌菌株GH1-13以以下生长曲线模式生长：其指示在孵育之后5小时的早期指数生长期、在孵育之后8小时的晚期指数生长期、在孵育之后12小时的早期静止生长期和在孵育之后24小时的静止生长期(图3)。

同时，为了确定yxaL基因在上述各个指示时间的组成型表达和YxaL蛋白的存在位置，进行了实施例1-4和1-5。

从SDS PAGE和Western印迹的结果确定了YxaL蛋白在细胞中组成性地表达并分泌到细胞外(图4a)，并且产生了约100μg/l的在上清液中的半衰期为1.6小时的YxaL蛋白(图4b)。另外，确定了这些结果也与RT-PCR数据一致(图5)。

也就是说，通过具有Fft的信号识别颗粒复合物与Sec蛋白分泌途径之间的合作，确定了YxaL可通过细胞质膜分泌到培养基中。

实施例4.确定YxaL蛋白对植物根生长的促进作用

为了检验YxaL对植物生长的作用，通过进行实施例1-6评价了拟南芥和稻种子的萌发率。

作为结果，确定了当不向培养基添加生长素时，用YxaL蛋白处理的种子的萌发率与未用YxaL蛋白处理的种子的萌发率之间没有显著差异，并且即使当向培养基添加生长素时，用YxaL蛋白处理的种子的萌发率与未用YxaL蛋白处理的种子的萌发率之间也没有显著差异。然而，确定的是，含生长素的培养基中的萌发率比不含生长素的培养基中的萌发率低(图6)。

同时，比较了在实施例1-6中制备的拟南芥和稻种子通过一周培养的根的长度和状态。

作为结果，确定了在用YxaL蛋白处理的种子的情况下，无论培养基中存在或不存在生长素，均形成了具有相似长度的根，并且该根长度比由未用YxaL蛋白处理的种子获得的根长度明显更长(图7)。另外，确定了在用YxaL蛋白处理的种子的情况下，与在未用YxaL蛋白处理的种子的情况下的那些相比，显著增加了侧根和毛根(图8)。在稻种子中也发现了类似于YxaL蛋白对根生长和发育的作用(图9)。

从上述结果，确定了YxaL蛋白可促进植物根的生长而不影响植物种子的萌发率，并且浸泡溶液中YxaL蛋白的最佳浓度为1mg/l。

实施例5.确定YxaL蛋白对植物基因表达变化的作用

为了确定YxaL蛋白对植物基因表达变化的作用，通过对从实施例1-6中制备的拟南芥种子的1周龄根中提取的RNA进行实施例1-5来评价植物基因中IAA1(生长素响应蛋白)、GH3.3(吲哚-3-乙酸氨基合成酶)、ACS11(1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶)和AFB4(脱落酸响应元件结合因子)的表达变化。这些植物基因在种子萌发的早期和晚期对拟南芥根中存在的生长素、乙烯和ABA(脱落酸)做出响应。

作为结果，确定了当使用浓度为10至100μg/l的YxaL蛋白浸泡种子时，无论培养基中存在或不存在生长素，1周龄拟南芥根中ACS11的表达水平与未用YxaL蛋白处理的根中的相比提高了34.5倍，而IAA1、GH3.3和ABF4的表达水平与未用YxaL蛋白处理的根中的相比降低(图10)。然而，当在补充有生长素的培养基中培养经YxaL蛋白处理的种子时，对GH3.3和AFB4表达的抑制强于对IAA1的抑制。

从上述结果中，确定了YxaL蛋白不仅可通过影响生长素信号传导途径，还可通过影响植物生长和发育的其他信号传导途径来促进植物生长。

目前为止，已参考本公开内容的实施方案描述了本公开内容。本公开内容所属领域的普通技术人员将理解，在不脱离本公开内容的本质特征的情况下，本公开内容可以以修改形式实施。因此，应当从说明性的角度而不是限制性的角度考虑所公开的实施方案。本公开内容的范围由权利要求书而不是以上描述来限定，并且与之等同的范围内的所有差异应被解释为包括在本公开内容中。

<110> DAEGU CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATIONFOUNDATION

<120> 包含YxaL蛋白或其同源蛋白的用于促进植物生长的组合物以及用于大量产生YxaL蛋白的方法

<130> PX190044PCT

<160> 39

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)

<400> 1

Met Lys Lys Lys Thr Ala Ser Leu Arg Met Lys Thr Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Ser Val Gly Ala Val Ser Asp Leu Pro

20 25 30

Gly Ala Lys Trp Leu His Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Val

35 40 45

Phe Lys Gln Asn His Ala Ala Ser Gly Phe Leu Ala Gly Arg Tyr Asp

50 55 60

Ala Gln Ala Met Ser Pro Thr Met Phe Asn Trp Ser Arg Glu Ser Arg

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ala Asp Gly Ala Leu Lys Trp Glu Lys Asn Val Pro

85 90 95

Ala Asn Pro Gln Asn Gly Ala Gly Ala Ala Val Asp Gly Asp Gly Thr

100 105 110

Val Phe Ile Gln Ser Lys Asp Gly Lys Leu Thr Ala Tyr His Pro Asp

115 120 125

Gly Thr Val Lys Trp Val Thr Glu Asn Leu Gly Thr Thr Tyr Thr Leu

130 135 140

Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Gly Val Ile Tyr Leu Pro Ser His Asp

145 150 155 160

Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Asn Ile Leu Thr Ser

165 170 175

Val Pro Leu Ser Gly Ala Pro Ser Ser Asp Ala Ala Ile Gly Ser Asp

180 185 190

Gly Thr Leu Tyr Val Ser Thr Leu Asp Asn Tyr Ile Tyr Ala Ile Lys

195 200 205

Pro Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Gln Lys Trp Lys Phe Lys Thr Asn

210 215 220

Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Val Leu Ala Ser Asn Gly Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Thr Ala Thr Tyr Asn Asn Ile Phe Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly

245 250 255

Gln Val Lys Trp Ser Lys Thr Thr Ser Asn Gly Phe Lys Gly Tyr Pro

260 265 270

Val Ile Asp Arg Asp Gly Thr Val Tyr Ala Gly Asn Gln Asp Gly Asn

275 280 285

Leu Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ala Val Lys Trp Thr Phe Pro Leu

290 295 300

Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ile Asp His Asn Gly Asn Val

305 310 315 320

Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Leu Phe Ser Ile Ser Lys Thr Gly

325 330 335

Asn Met Asn Trp Ser Phe Tyr Thr Asp Gly Pro Val Arg Thr Ala Pro

340 345 350

Leu Ile Asp Ala Asp Gly Asn Val Tyr Phe Gly Ser Asp Asp Lys Asn

355 360 365

Val Tyr Ala Val Asp Ala Asp Gly Asn Glu Lys Trp Arg Tyr Gln Thr

370 375 380

Asp Ser Asn Val Ile Ser Ser Pro Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Leu

385 390 395 400

Tyr Val Gly Thr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Phe Gly Ala Lys Lys

405 410 415

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 2

Met Lys Ala Leu Ile Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Ala Val Ser Ala

1 5 10 15

Gly Ala Val Ser Asp Val Pro Ala Ala Lys Val Leu Gln Pro Ala Ala

20 25 30

Ala Tyr Ala Ala Glu Thr Val Phe Ser Gln Asn Asn Glu Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Val Gln Ala Met Ala Pro Ala Met Phe

50 55 60

Asn Trp Ser Arg Glu Ser Arg Phe Ala Gly Asn Thr Asp Gly Thr Leu

65 70 75 80

Lys Trp Gln Asn Asp Ile Arg Thr Thr Pro Gln Asn Gly Ala Gly Ala

85 90 95

Val Ile Asp Gly Asp Gly Thr Val Tyr Leu His Ser Arg Asp Gly Glu

100 105 110

Met Lys Ala Phe Asn Pro Asp Gly Ser Val Lys Trp Val Thr Gly Asn

115 120 125

Leu Gly Lys Thr Phe Thr Gln Ser Pro Val Leu Gly Thr Asn Gly Val

130 135 140

Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Asp Lys Lys Ile Tyr Phe Ile Asp Lys Glu

145 150 155 160

Thr Gly Glu Ile Leu Thr Thr Val Pro Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser

165 170 175

Glu Thr Val Ile Gly Ser Asp Gly Thr Leu Tyr Phe Ser Thr Leu Asp

180 185 190

Asn Tyr Val His Ala Ile Lys Pro Thr Ser Lys Ser Thr Trp Thr Glu

195 200 205

Arg Trp Lys Leu Lys Thr Asn Gly Val Val Ser Ser Val Pro Val Leu

210 215 220

Ala Lys Asn Gly Thr Val Tyr Val Gly Thr Tyr Asn Asn Val Phe Tyr

225 230 235 240

Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gln Val Lys Trp Ser Arg Thr Thr Ser

245 250 255

Asn Ala Phe Lys Gly Tyr Pro Val Ile Asp Lys Asp Gly Thr Val Tyr

260 265 270

Ala Gly Asn Gln Asp Gly Gln Leu Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ser

275 280 285

Leu Lys Trp Thr Phe Pro Leu Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ser Pro Ala

290 295 300

Ile Asp His Asn Gly Asn Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Leu

305 310 315 320

Phe Ser Ile Ser Lys Asn Gly Asp Met Asn Trp Ser Phe Tyr Thr Asp

325 330 335

Gly Pro Val Arg Thr Ala Pro Leu Ile Asp Ala Lys Gly Thr Val Tyr

340 345 350

Phe Gly Ser Asp Asp Met Lys Val Tyr Ala Ala Asp Ala Asn Gly Asn

355 360 365

Glu Leu Trp Ser Tyr Gln Thr Asp Ser Asn Val Val Ser Ser Pro Gln

370 375 380

Leu Ala Glu Asp Gly Thr Leu Tyr Ile Gly

385 390

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 3

Ala Xaa Asp Xaa Xaa Thr Gly Asp Xaa Xaa Trp

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 4

Phe Thr Ser Thr Ala Asp Gly Ala Leu Lys Trp

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 5

Thr Ala Tyr His Pro Asp Gly Thr Val Lys Trp

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 6

Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Asn Ile Leu Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 7

Pro Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Gln Lys Trp

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 8

Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gln Val Lys Trp

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 9

Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ala Val Lys Trp

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 10

Phe Ser Ile Ser Lys Thr Gly Asn Met Asn Trp

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 11

Tyr Ala Val Asp Ala Asp Gly Asn Glu Lys Trp

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 12

Phe Ala Gly Asn Thr Asp Gly Thr Leu Lys Trp

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 13

Lys Ala Phe Asn Pro Asp Gly Ser Val Lys Trp

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 14

Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Ile Leu Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 15

Pro Thr Ser Lys Ser Thr Trp Thr Glu Arg Trp

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 16

Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gln Val Lys Trp

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 17

Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ser Leu Lys Trp

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 18

Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ser Leu Lys Trp

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 19

Tyr Ala Ala Asp Ala Asn Gly Asn Glu Leu Trp

1 5 10

<210> 20

<211> 415

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属

<400> 20

Met Lys Lys Lys Thr Ala Ser Leu Arg Met Lys Thr Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Ser Val Gly Ala Val Ser Asp Leu Pro

20 25 30

Gly Ala Lys Trp Leu His Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Val

35 40 45

Phe Lys Gln Asn His Ala Ala Ser Gly Phe Leu Ala Gly Arg Tyr Asp

50 55 60

Ala Gln Ala Met Ser Pro Thr Met Phe Asn Trp Ser Arg Glu Ser Arg

65 70 75 80

Phe Thr Ser Thr Ala Asp Gly Ala Leu Lys Trp Glu Lys Asn Val Pro

85 90 95

Ala Thr Pro Gln Asn Gly Ala Gly Ala Ala Val Asp Gly Asp Gly Thr

100 105 110

Val Phe Ile Gln Ser Lys Asp Gly Lys Leu Thr Ala Tyr His Pro Asp

115 120 125

Gly Thr Val Lys Trp Val Thr Glu Asn Leu Gly Thr Thr Tyr Thr Leu

130 135 140

Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Gly Val Ile Tyr Leu Pro Ser His Asp

145 150 155 160

Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Asn Ile Leu Thr Ser

165 170 175

Val Pro Leu Ser Gly Ala Pro Ser Ser Asp Ala Ala Ile Gly Ser Asp

180 185 190

Gly Thr Leu Tyr Val Ser Thr Leu Asp Asn Tyr Ile Tyr Ala Ile Lys

195 200 205

Pro Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Gln Lys Trp Lys Phe Lys Thr Asn

210 215 220

Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Val Leu Ala Ser Asn Gly Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Thr Ala Thr Tyr Asn Asn Ile Phe Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly

245 250 255

Gln Val Lys Trp Ser Lys Thr Thr Ser Asn Gly Phe Lys Gly Tyr Pro

260 265 270

Val Ile Asp Arg Asp Gly Thr Val Tyr Ala Gly Asn Gln Asp Gly Asn

275 280 285

Leu Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ala Val Lys Trp Thr Phe Pro Leu

290 295 300

Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ile Asp His Asn Gly Asn Val

305 310 315 320

Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Leu Phe Ser Ile Ser Lys Thr Gly

325 330 335

Asn Met Asn Trp Ser Phe Tyr Thr Asp Gly Pro Val Arg Thr Ala Pro

340 345 350

Leu Ile Asp Ala Asp Gly Asn Val Tyr Phe Gly Ser Asp Asp Lys Asn

355 360 365

Val Tyr Ala Val Asp Ala Asp Gly Asn Glu Lys Trp Arg Tyr Gln Thr

370 375 380

Asp Ser Asn Val Ile Ser Ser Pro Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Leu

385 390 395 400

Tyr Val Gly Thr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Phe Gly Ala Lys Lys

405 410 415

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YxaL_正向

<400> 21

gcggaaacgg tatttaaaca aaat 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YxaL_反向

<400> 22

ttattttttt gccccgaatg cga 23

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YxaL(Nco1)_正向

<400> 23

ggcccatggc ggaaacggta tttaaacaaa at 32

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YxaL(Xho1)_反向

<400> 24

gggctcgagt tatttttttg ccccgaatgc ga 32

<210> 25

<211> 1119

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属

<400> 25

atggcggaaa cggtatttaa acaaaatcat gcggcatccg gtttcttggc gggacggtat 60

gacgcgcagg cgatgtctcc gacgatgttc aactggtcaa gagaaagccg gtttacaagc 120

actgccgatg gcgcattaaa atgggaaaag aatgtcccgg ccacccctca aaacggtgcg 180

ggagccgcgg ttgatgggga cggcaccgta tttattcaat caaaagacgg gaagctgacg 240

gcgtatcatc cggacggtac tgtgaaatgg gtgacggaaa acctcgggac gacctatacg 300

ctgactccgg tgctcggaac aaacggtgtc atttatcttc cttctcacga taaaaaacta 360

tatttcatcg acaaagaaac cggaaacatt ttaacatcgg ttccgttgag cggagcgcct 420

agttccgatg cggctatcgg ctctgacggc acgctgtatg tgtcgacgct ggataactat 480

atctatgcga ttaaaccgac gtcgccttcg acatggacgc aaaagtggaa gtttaaaaca 540

aacggcgtgg tcggctccgc tcccgtgtta gcgtcaaacg gcacgctgta tacggcaacg 600

tacaataata tcttttacgc gatcaattcc ggaacaggcc aagtgaaatg gtcaaaaacg 660

acgtccaacg ggtttaaagg ctatccggtt attgatagag acggcaccgt ttacgccgga 720

aaccaggacg gcaatttata cgcctataca tcaacgggtg ctgtaaagtg gacgttcccg 780

ttaaacggtt tctccagctc ttcattagcg atcgaccata acggcaatgt gtatatcggt 840

tccggaagcg gcgagctgtt ttccatcagc aaaaccggca atatgaactg gtctttctat 900

acggacgggc ctgtgagaac ggcgccgctg attgatgcgg acggcaatgt gtacttcggt 960

tctgacgata aaaatgtcta tgcggttgac gctgacggta atgaaaaatg gcgctatcaa 1020

acagacagca atgtcatttc ctccccggtt ctggctgaag acggcacgct ctatgtcggc 1080

acttatacga aactgctcgc attcggggca aaaaaataa 1119

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YxaL(GH1-13)_正向

<400> 26

gtttcttggc gggacggt 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YxaL(GH1-13)_反向

<400> 27

agcaccggag tcagcgta 18

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S rRNA(GH1-13)_正向

<400> 28

cctacgggag gcagcagtag 20

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S rRNA(GH1-13)_反向

<400> 29

caacagagct ttacgatccg aaa 23

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GH3.3_正向

<400> 30

tcggataaaa ccgatgaagc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GH3.3_反向

<400> 31

tcaacgactc ctccatttcc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IAA1_正向

<400> 32

ggaagtcacc aatgggctta 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IAA1_反向

<400> 33

gagatatgga gctccgtcca 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AFB4_正向

<400> 34

aatcgaggac gaagaagcaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AFB4_反向

<400> 35

tctgcatttc caccatttca 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACS11_正向

<400> 36

cccacttgga acctctacca 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACS11_反向

<400> 37

atcaagccaa cacgaaatcc 20

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 18S rRNA_正向

<400> 38

gcgtttgaga ggatgtggcg gggaat 26

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 18S rRNA_反向

<400> 39

taaatgcgtc ccttccataa gtcggg 26