一种在大肠杆菌表达系统中高效表达外源蛋白的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种在大肠杆菌表达系统中高效表达外源蛋白的方法及其应用。本发明属于大肠杆菌的基因工程改造与应用，属于生物制药领域。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)原核表达系统因操作方便、表达高效和成本低廉等优势，被广泛应用于异源蛋白的表达及相关亚单位疫苗的研究，然而E.coli原核表达系统存在的一些不足，严重制约了该表达系统的效能和进一步应用。E.coli是一种革兰氏阴性细菌，其脂多糖(LPS)结构可在临床上引起较为严重的内毒素反应，以E.coli为宿主表达的蛋白通常面临着内毒素去除的难题，在一定程度上增加了下游蛋白纯化工艺的难度和成本。E.coli自身缺乏蛋白有效折叠所需的酶类以及二硫键形成所需的氧化态细胞内环境，蛋白发生错误折叠后易形成包涵体或降解。此外，E.coli作为一种原核表达宿主菌株，无法合成部分稀有密码子所对应的转运RNA，因此在表达异源蛋白尤其是真核生物来源的蛋白时，存在转录通量低、蛋白表达弱的现象。

目前尚无同时兼具低毒力、高可溶性的高效外源蛋白表达E.coli宿主菌株，开发一种适用于不同外源蛋白的，操作简单的高效表达方法，提高大肠杆菌源亚单位疫苗的生物安全性，具有广阔的市场应用前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种高效表达外源蛋白的大肠杆菌构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)BL21(DE3)lpxM基因的敲除；步骤(2)将tig基因插入步骤(1)得到的BL21(DE3)lpxM基因缺失株；(3)重组载体pET28a-Rcodon的构建；(4)外源蛋白基因克隆至步骤(3)得到的重组载体pET28a-Rcodon；(5)将步骤(4)所得重组载体转化步骤(2)得到的菌株；以及步骤(6)外源蛋白的收获。

在步骤(1)中，以BL21(DE3)菌株的基因组DNA为模板扩增出lpxM基因的左右臂，并通过重叠PCR将左右臂进行重叠；构建pTargetF-sgRNA1和pTargetF-sgRNA2载体，并同左右臂一起电转化BL21(DE3)/pCas感受态细胞；提取转化子基因组DNA作为模板进行PCR扩增；通过RT-PCR对lpxM基因的转录水平进行半定量分析，以便验证lpxM基因缺失成功。

在步骤(2)中，将tig基因合成至pET28a载体，以提供tig基因表达盒；以pET28a-tig载体为模板，扩增出包含T7启动子和终止子的tig-cassette表达盒；以BL21(DE3)ΔlpxM突变株(即BL21(DE3)lpxM基因缺失株)提取的基因组DNA为模板，扩增lpxM基因的左右臂，并通过重叠PCR将lpxM的左右臂连接至tig-cassette片段的两端；重组后的片段同pTargetF-sgRNA1和pTargetF-sgRNA2载体一起电转化BL21(DE3)ΔlpxM/pCas感受态细胞；提取转化子基因组DNA作为模板进行PCR扩增，BL21(DE3)和BL21(DE3)ΔlpxM的基因组DNA为对照；通过RT-PCR对tig基因的转录水平进行半定量分析，以便验证tig基因整合表达成功。

在步骤(3)中，将包含tRNA元件的基因序列合成至pUC57载体以构建pUC57-Rcodon载体；以pET28a为模板扩增ori和Lac I元件区间以外的骨架部分，大小为4300bp左右；以pUC57-Rcodon为模板扩增包含七种tRNA编码基因的序列片段，大小为2800bp左右，片段两端分别带有与pET28a骨架同源的20bp基序；将pET28a的骨架片段与包含tRNA编码基因的片段进行重组，重组体系转化DH5α感受态细胞后进行转化子的筛选；提取转化子质粒，测序以验证重组载体(pET28a-Rcodon)正确。

在步骤(4)中，外源蛋白序列同pET28a-Rcodon重组载体进行双酶切消化，消化产物连接后转化DH5ɑ感受态细胞；提取转化子质粒后，进行双酶切获得目的片段，以验证重组载体pET28a-Rcodon-外源蛋白构建成功。

在步骤(5)中，将重组载体pET28a-Rcodon-外源蛋白转化步骤(2)得到的BL21(DE3)ΔlpxM tig

本发明方法使得外源蛋白高效表达，能较大肠杆菌常规表达显著提高外源蛋白的表达量，内毒素含量大大降低，且本发明方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，可广泛适用于真核生物来源的蛋白在内的多种兽医疫苗蛋白，具有广泛的适用范围。

作为本发明的一种实施方式，本发明的高效表达外源蛋白的大肠杆菌构建方法中，所述步骤(4)中所述外源蛋白包括非洲猪瘟病毒CD2v蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白、日本血吸虫GALE蛋白、日本血吸虫Wnt5蛋白。

本发明还涉及所述的方法制备的高效表达外源蛋白的大肠杆菌。

本发明还涉及一种高效表达外源蛋白的方法，其中，所述方法使用所述的大肠杆菌表达所述外源蛋白。

本发明还涉及所述方法在制备外源蛋白中的应用。

本发明还涉及所述制备的外源蛋白制备的疫苗组合物，使用本发明上述方法制备的外源蛋白，加入药学上可接受的载体，制备亚单位疫苗组合物。

本发明制备方法制备的外源蛋白，在生物安全性上、免疫原性和免疫效力、对动物的生长发育无不良反应，可以制备亚单位疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述制备疫苗的方法中，药学上可接受的载体包括佐剂，所用佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、嵌段共聚物(Block co-polymer)、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

所述佐剂含量为5％-70％V/V。

所述佐剂的含量可以任意选自5％V/V、6％V/V、7％V/V、8％V/V、9％V/V、10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V、55％V/V、60％V/V、65％V/V、66％V/V、67％V/V、70％V/V。

本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)Montanide

尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。

特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明的疫苗组合物优选亚单位疫苗组合物还可以包括由以下试剂组成的组中的一种或多种：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

可以根据本发明的疫苗组合物优选亚单位疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。

优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1高效表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌的构建方法

一、E.coli BL21(DE3)lpxM基因的敲除

1、设计合成引物

根据GeneBank中E.coli BL21(DE3)基因组序列的lpxM的基因组序列(基因编号：CP001509.3)，利用Primer5.0自行设计，由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

sgRNA-1-F：

ATATATACTAGTGGGACGTTTTGCCGGACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

sgRNA-2-F：

ATATATACTAGTGATGGATGATCTGTTAGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

sgRNA-R：ATATATACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAG

lpxM-L-F：TGCACTATGAAGTATGGATA

lpxM-L-R：

CCGCGCAATCGTATGATCATAACGTCCCAGCCGTGCCAGA

lpxM-L-Rt：

ATTTCGCGGGATCGAGATCTAACGTCCCAGCCGTGCCAGA

lpxM-R-F：

TCTGGCACGGCTGGGACGTTATGATCATACGATTGCGCGG

lpxM-R-Ft：

CTGAAAGGAGGAACTATATCATGATCATACGATTGCGCGG

lpxM-R-R：TAATGACGGCGTAGCAGCTG

lpxM-RT-F：GGCAAGGGCTGGAGATCATC

lpxM-RT-R：GTACCGACTG GATGAATGGT

2、构建BL21(DE3)ΔlpxM突变株

以BL21(DE3)菌株的基因组DNA为模板扩增出lpxM基因的左右臂，并通过重叠PCR将左右臂进行重叠；构建pTargetF-sgRNA1和pTargetF-sgRNA2载体，并同左右臂一起电转化BL21(DE3)/pCas感受态细胞；提取转化子基因组DNA作为模板进行PCR扩增。阳性转化子提取的基因组DNA作为模板扩增出的片段大小为950bp左右，较对照条带小640bp左右。通过RT-PCR对lpxM基因的转录水平进行半定量分析，结果lpxM缺失突变株(BL21(DE3)ΔlpxM突变株)未扩增出任何条带，验证lpxM基因缺失成功。

二、tig基因在BL21(DE3)ΔlpxM基因组上的整合表达

1、设计合成引物

由苏州金维智生物科技有限公司将tig基因(Genebank序列编号：ADY57932.1)，合成至pET28a载体，提供tig基因表达盒。

tig-cassette-F：

TCTGGCACGGCTGGGACGTTAGATCTCGATCCCGCGAAAT

tig-cassette-R：

CCGCGCAATCGTATGATCATGATATAGTTCCTCCTTTCAG

tig-RT-F：GAAGCAGAAGACCGCGTAAC

tig-RT-R：CTTCAACTTTCTTCAGGTTG

2、构建BL21(DE3)ΔlpxM tig

以pET28a-tig载体为模板，扩增出包含T7启动子和终止子的tig-cassette表达盒。以BL21(DE3)ΔlpxM突变株提取的基因组DNA为模板，扩增lpxM基因的左右臂，并通过重叠PCR将lpxM的左右臂连接至tig-cassette片段的两端，重组后的片段同pTargetF-sgRNA1和pTargetF-sgRNA2载体一起电转化BL21(DE3)ΔlpxM/pCas感受态细胞。提取转化子基因组DNA作为模板进行PCR扩增，BL21(DE3)和BL21(DE3)ΔlpxM的基因组DNA为对照。结果阳性转化子提取的基因组DNA为模板扩增出的片段大小为2750bp左右，较BL21(DE3)基因组DNA为模板扩增出的条带大1200bp左右，较BL21(DE3)ΔlpxM突变株基因组DNA为模板扩增出的条带大1800bp左右。通过RT-PCR对tig基因的转录水平进行半定量分析，结果显示阳性转化子可扩增出目的条带，验证tig基因整合表达成功。

三、重组载体pET28a-Rcodon的构建

1、设计合成引物

由苏州金维智生物科技有限公司将包含tRNA元件的基因序列(如SEQ.ID NO 1所示)合成至pUC57载体，根据商品化载体pET28a和合成的pUC57-Rcodon载体基因序列进行引物设计。

Rcodon-F：TAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCT

Rcodon-R：ATCATCTTATTAATCAGATAAAATATTTCT

pETbone-F：

AGAAATATTTTATCTGATTAATAAGATGATCAGCTTGTCTGTAAGCGGAT

pETbone-R：

AGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTATCAAGGGCATCGGTCGAGAT

2、构建pET28a-Rcodon重组载体

以pET28a为模板扩增ori和Lac I元件区间以外的骨架部分，大小为4300bp左右；以pUC57-Rcodon为模板扩增包含七种tRNA编码基因的序列片段，大小为2800bp左右，片段两端分别带有与pET28a骨架同源的20bp基序。使用

四、IBDV VP2蛋白的表达

1、设计合成引物

根据GeneBank中IBDV VP2基因的序列(基因编号：KF021490.1)，利用Primer5.0自行设计。

VP2-F：GGGAATTCCATATGATGACCAACCTGCAGGACCA

VP2-R：CCGCTCGAGTTAACGCAGAGCACGGATGA

2、VP2基因序列克隆至pET28a-Rcodon重组表达载体

IBDV的VP2序列同pET28a-Rcodon重组载体利用Nde I和Xho I进行双酶切消化，消化产物连接后转化DH5ɑ感受态细胞。提取转化子质粒后，用Nde I和Xho I进行双酶切验证，可得到大小分别为7100bp和1359bp左右的目的片段，验证重组载体pET28a-Rcodon-VP2构建成功。按照同样方法将VP2序列克隆至pET28a载体，通过Nde I和Xho I进行双酶切验证，可得到大小分别为5369bp和1359bp左右的目的片段。

3、VP2蛋白的表达

重组载体pET28a-Rcodon-VP2转化BL21(DE3)ΔlpxM tig

实施例2鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白亚单位疫苗的制备

分别将实施例1不同宿主表达的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与矿物油佐剂按比例混匀，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表1。

表1鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白亚单位疫苗配比

实施例3鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白亚单位疫苗安全性试验

取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第1组～第2组分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的疫苗1和疫苗2，免疫剂量为0.25ml，第3组皮下注射0.25ml生理盐水，作为空白对照。疫苗2注射后所有个体的免疫部位出现有较轻微的肌肉充血、水肿和硬结，并有轻度的腹泻、精神萎靡和食欲减退等副反应症状，疫苗1注射后所有个体与空白对照组均无明显临床症状出现。结果见表2。

表2鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白亚单位疫苗安全性试验结果

表明本发明方法构建的大肠杆菌表达的外源蛋白内毒素毒力水平显著下降，制备的亚单位疫苗具有较高的安全性。

实施例4非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的制备

参照实施例1方法，构建高效表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的大肠杆菌菌株，非洲猪瘟病毒CD2v蛋白基因序列如SEQ.ID NO 2所示。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为4×10

实施例5猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗的制备

参照实施例1方法，构建高效表达猪伪狂犬病病毒gD蛋白的大肠杆菌菌株，猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因序列如SEQ.ID NO 3所示。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为4×10

将上述大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病毒gD蛋白与206佐剂按比例混匀，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟，4℃保存，即为猪伪狂犬病毒gD蛋白亚单位疫苗组合物。具体配比见表3。

表3猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗配比

实施例6猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗免疫原性试验

将21日龄PRV抗原抗体阴性仔猪12头随机分成3组，4头/组，第4组、第5组分别经肌肉注射实施例5制备的疫苗3和疫苗4，免疫剂量为2ml/头，第6组对照组注射DMEM培养基2ml/头。免疫后28日，用猪伪狂犬病病毒HN1201株(猪伪狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏号为CCTCC NO.V 201311；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日，公开于中国专利申请CN104004774A)病毒液通过肌肉注射攻击，剂量为2×10

表4猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果

结果显示，猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，显示出很好的免疫保护。

实施例7禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗的制备

参照实施例1方法，构建高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的大肠杆菌菌株，禽腺病毒Fiber-2蛋白基因序列如SEQ.ID NO 4所示。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为4×10

将大肠杆菌表达的禽腺病毒Fiber-2蛋白与矿物油佐剂按比例混匀，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表5。

表5禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗配比

实施例8禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第7组～第8组分别经颈部皮下注射免疫实施例7制备的疫苗5和疫苗6，免疫剂量为0.3ml，第9组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowlaviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日，公开于中国专利申请CN107523556A)病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表6。

表6禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果

结果显示，第9组攻毒对照组全部发病死亡，而第7组～第8组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护，免疫效果良好。表明本发明方法制备的禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗可对鸡群提供有效的免疫保护。

实施例9禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗的制备

参照实施例1方法，构建高效表达禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白的大肠杆菌菌株，禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白基因序列如SEQ.ID NO 5所示。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为3×10

将大肠杆菌表达的禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白与矿物油佐剂按比例混匀，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表7。

表7禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗配比

实施例10禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第10组～第11组分别经颈部皮下注射免疫实施例9制备的疫苗7和疫苗8，免疫剂量为0.5ml，第12组皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征HI抗体效价。结果见表8。

表8禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果

上述结果显示，第12组对照组免疫后21日HI抗体效价为0，而第10组～第11组免疫组对免疫鸡均产生了较高的HI抗体效价,免疫效果良好。表明本发明方法制备的禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗可对鸡群提供有效的免疫保护。

实施例11兔瘟病毒VP60蛋白的制备

参照实施例1方法，构建高效表达兔瘟病毒VP60蛋白的大肠杆菌菌株，兔瘟病毒VP60蛋白基因序列如SEQ.ID NO 6所示。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为4×10

实施例12猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗的制备

参照实施例1方法，构建高效表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的大肠杆菌菌株，猪圆环病毒3型Cap蛋白基因序列如SEQ.ID NO 7所示。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为5×10

将上述大肠杆菌表达的猪圆环病毒3型Cap蛋白与水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)按比例混匀，即为猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗组合物。具体配比见表9。

表9猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗配比

实施例13猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫原性试验

将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，免疫实施例12制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗。第13～14组分别免疫疫苗9～10，第15组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，对照组接种生理盐水2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒(猪圆环病毒3型SG株(Porcine Circovirus type 3，strain SG)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学，公开于中国专利申请CN108660115A)10

表10猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果

结果显示，猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后全部发病。表明本发明方法制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗可对猪群提供有效的免疫保护。

实施例14猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备

参照实施例1方法，构建高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的大肠杆菌菌株，猪圆环病毒2型Cap基因序列公开于中国专利申请CN101920012A。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为5×10

实施例15猪细小病毒VP2蛋白的制备

参照实施例1方法，构建高效表达猪细小病毒VP2蛋白的大肠杆菌菌株，猪细小病毒VP2蛋白基因序列公开于中国专利申请CN103908664A。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为4×10

实施例16猪瘟病毒E2蛋白的制备

参照实施例1方法，构建高效表达猪瘟病毒E2蛋白的大肠杆菌菌株，猪瘟病毒E2蛋白基因序列公开于中国专利申请CN105527442A。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为4×10

实施例17日本血吸虫GALE蛋白的制备

参照实施例1方法，构建高效表达日本血吸虫GALE蛋白的大肠杆菌菌株，日本血吸虫GALE蛋白基因序列公开于中国专利申请CN102079783A。

将构建的大肠杆菌菌株，接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。经试剂盒检测内毒素水平为5×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种在大肠杆菌表达系统中高效表达外源蛋白的方法及其应用

<130> 19NAP0459C

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2850

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggttgctacg cctgaataag tgataataag 60

cggatgaatg gcagaaattc gaaagcagat tcgacccggt cgtcggttca gggcagggtc 120

gttaaatagc cgcttatgtc tattgctggt ttaccggttt attgactacc ggaagcagtg 180

tgaccgtgtg cttctcaaat gcctgaggtc tgtttatcga attaattgca gatataaaaa 240

aaccaaccgt aagggttggt tttttcttgg gatttttggt cggcacgaga ggatttgaac 300

ctccgacccc cgacacccca tgacggtgcg ctaccaggct gcgctacgtg ccgactcgtg 360

gctgctaata ctaccgtttt ccacaccgat tgcaagtaag atatttcgct aactgattta 420

taattaatca gttagcgata aaacgcttct cgtacaacgc tttctggtga atggtgcggg 480

aggcgagact tgaactcgca caccttgcgg cgccagaacc taaatctggt gcgtctacca 540

atttcgccac tcccgcaaaa aaagatggtg gctacgacgg gattcgaacc tgtgacccca 600

tcattatgag tgatgtgctc taaccaactg agctacgtag ccatcttttt tttcgcgata 660

ccttatcggc gttgcggggc gcattatgcg tatagagcct tgcagcgtca acctcttttt 720

caaggaaaat tgctcgaaag tgactgtttg gttaggttgc gaacagcgaa ccatgacgaa 780

ctgtaaatct acggaatgct tgatattcag gggatttttg cggactggta cggatgggag 840

cgaactgata aatggtgtcc cctgcaggaa tcgaacctgc aattagccct taggaggggc 900

tcgttatatc catttaacta agaggacaat gcggcatgag tatacccgct aatggagtgc 960

ggggtaagta cgttgccgct cgattgctta aaccctcgcc atttatgccg ggtttttata 1020

atttttctta atgttttccg cacgttctgc tttttggacg tcatcgattg tccctctaag 1080

acacggataa atcggtgata tcaccacatc aaccaggcaa catgcccgac ttgttgaatg 1140

caataaacag aaggaaaaaa cagggaggag aaaagaagtg gtgctgatag gcagattcga 1200

actgccgacc tcacccttac caagggtgcg ctctaccaac tgagctatat cagcacatct 1260

tggagcgggc agcgggaatc gaacccgcat catcagcttg gaaggctgag gtaatagcca 1320

ttatacgatg cccgcatcct ggaactcggc tacctgattt tcattctgca ctgaatatcg 1380

agagaagctc tctttattcg agccggtaag cgaacttatc gtctcgggct acgccatcgc 1440

gtggccgaaa ttggtggtgg gggaaggatt cgaaccttcg aagtctgtga cggcagattt 1500

acagtctgct ccctttggcc gctcgggaac cccaccggac ttgatggtgc cgactaccgg 1560

aatcgaactg gtgacctact gattacaagt cagttgctct acctactgag ccaagtcggc 1620

atcaagtagc gcgcactcta tggagacatg cgagttcatg caactaaaaa attgcataat 1680

ttgttttatt ggtcacattt tatgcgacac gatgaagaaa cagcctaggt acctcatgag 1740

cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac 1800

cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tccgtcacat 1860

accaaggcgg ctaagcgagc agatggaaca tcaacgcctg cggtcaggaa gatgcgcatc 1920

gacagcaaga catcatggct atcagcttgt cgtcgtgcag gaattgaaga tttccgtttc 1980

catgacctca gacacacctg ggcaagctgg ctgattcagt caggcgtccc attatcagtg 2040

cttcaggaaa tgggcggatg ggagtccata gaaatggttc gtaggtatgc tcaccttgcg 2100

cctaatcatt tgacagagca tgcgaggaaa atagacgaca tttttggtga taatgtccca 2160

aatatgtccc actctgaaat tatggaggat ataaagaagg cgtaactgat tgaattgtaa 2220

tggcgcgccc tgcaggattc gaacctgcgg cccacgactt agaaggtcgt tgctctatcc 2280

aactgagcta agggcgcgtt gataccgcaa tgcggtgtaa tcgcgtgaat tatacggtca 2340

acccttgctg agtcaatggc ttttgatctg gttgctgaac aagtgaacga ccgcgtctga 2400

ttttctgatt tatttcgcta tagcggcaaa caaacgcaca ccgctgcgcg tctgaatcaa 2460

gaaaacccgt attttcatgt atcaaagtga cctgcagcca agcttggatt gcgacacgga 2520

gttactttat aatccaatcg attggcccct tagctcagtg gttagagcag gcgactcata 2580

atcgcttggt cgctgcttca agtccagcag gggccaccag cggccgcaaa ggctgacgag 2640

aaatcgtcag cctttttaag ctttaagccg aattccagca cactggcggc cgttactagt 2700

ggatccgagc tcggtaccaa gcttatcgat gataagctgt caaacatgag aattacaact 2760

tatatcgtat ggggctgact tcaggtgcta catttgaaga gataaattgc actgaaatct 2820

agaaatattt tatctgatta ataagatgat 2850

<210> 2

<211> 498

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 2

ggtgtttctt ggaacttctt caacaactct ttcaacaccc tggctacctg cggtaaagct 60

ggtaacttct gcgaatgctc taactactct acctctatct acaacatcac caacaactgc 120

tctctgacca tcttcccgca caacgacgtt ttcgacacca cctaccaggt tgtttggaac 180

cagatcatca actacaccat caaactgctg accccggcta ccccgccgaa catcacctac 240

aactgcacca acttcctgat cacctgcaaa aaaaacaacg gtaccaacac caacatctac 300

ctgaacatca acgacacctt cgttaaatac accaacgaat ctatcctgga atacaactgg 360

aacaactcta acatcaacaa cttcaccgct acctgcatca tcaacaacac catctctacc 420

tctaacgaaa ccaccctgat caactgcacc tacctgaccc tgtcttctaa ctacttctac 480

accttcttca aactgtac 498

<210> 3

<211> 1029

<212> DNA

<213> Pseudorabies virus

<400> 3

gctgatgtgg atgccgtgcc cgctcccacc tttcctcctc ctgcctaccc ctacaccgag 60

agctggcagc tgacactgac cacagtgcct tcccccttcg tgggccctgc cgatgtgtac 120

cacaccaggc ccctggagga tccttgcgga gtggtggctc tcatcagcga ccctcaggtc 180

gacaggctgc tgaacgaggc tgtggcccac aggaggccta catacagggc ccacgtggcc 240

tggtacagga tcgccgacgg ctgtgcccac ctgctgtact ttatcgagta cgctgactgc 300

gaccccaggc agattttcgg caggtgccgg aggaggacca cccctatgtg gtggaccccc 360

tccgccgact acatgttccc caccgaggac gagctgggcc tgctgatggt ggcccctggc 420

aggttcaatg agggccagta caggaggctg gtgtccgtgg acggcgtgaa catcctcacc 480

gacttcatgg tggccctgcc tgagggccag gaatgtcctt tcgcccgggt cgaccagcac 540

cggacctaca agttcggcgc ctgctggtcc gacgactcct tcaagagggg cgtggacgtg 600

atgaggttcc tgaccccctt ctatcagcag cccccccaca gggaggtggt gaactactgg 660

tacaggaaga acggcaggac actgccccgg gcttatgctg ccgccacacc ttacgccatc 720

gaccccgcta ggcccagcgc tggatccccc aggccccgtc cccgtccccg tcctcggccc 780

cgtcctaaac ctgagcctgc ccctgctaca cctgctcccc ctggaaggct gcctgaacct 840

gctacccggg atcacgctgc tggcggaagg cctacaccca ggcctccccg tcctgagacc 900

cctcataggc ctttcgctcc ccctgctgtc gtcccttccg gatggcctca gcctgccgag 960

ccttttcccc ccaggacaac cgccgctcct ggagtctcca ggcataggca tcaccaccat 1020

caccactga 1029

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> avian adenovirus

<400> 4

atgttacgtg ctcctaaacg gcgacatagc gaaaacggtc aaccggaatc ggaagccggc 60

cccagccctg cgccaataaa acgcgccaaa aggatggtac gagcaagcca gctagacctc 120

gtttaccctt ttgactacgt ggctgaccca gttggtggtc tcaacccccc attcctgggc 180

ggctctggtc ctctggtgga tcagggaggc cagttgaccc taaatgttac ggaccctatc 240

ataataaaga atcgctccgt ggacctggca catgacccct ctctagacgt caatgcccag 300

ggacaactag cagttgctgt tgaccctgag ggtgctttgg acatcacacc agatggccta 360

gatgtgaagg tagatggggt caccgtgatg gtgaatgatg actgggaact ggctgtgaag 420

gtggacccca gcggtgggtt ggacagtaca gcagggggcc tgggggtgtc tgtcgatgat 480

actttactcg tggaccaggg cgaactggga gtgcacctga accagcaagg acctatcacc 540

gcagactcca gcgggataga tctagagatc aatcccaaca tgttcaccgt caatacatcc 600

acagggagcg gtgttttaga attaaacctg aaggctcaag gtggcatcca ggctggctct 660

tcgggcgtgg gggttagtgt tgatgaatca cttgaaatcg tgaataatac actagaagtt 720

aagcctgacc cgagtggccc acttactgtg tcagccaacg gacttgggct gaaatatgat 780

tccaacactc tggccgtgac cgccggggcc ttgacggtag tgggcggcgg tagtgtctca 840

actccaattg ccacatttgt gtccggcagt ccctcgctga atacctacaa tgcgactatc 900

gtaaactcct catcccaccc cttctcctgc gcctactacc tccagcagtg gaatgtgcag 960

ggtttattat tcacatcatt atatgtgaaa ctggattcta caacaatggg cacaaggccg 1020

ggggacaaca gcagtgccaa cgccaagtgg tttactttct gggtgtccgc ctatttacaa 1080

cagtgcaacc cttccggtat tcaggccggt actgttagtc catctaccgc ggcgttagcc 1140

gatttcgaac cgatggcgaa ccggagcgta agctccccgt ggacgtactc ggctaacgcg 1200

tattatcaac ctagtagcgg ggagtttcag gttttcacgc ccgtagttac cggcgcatgg 1260

aatccgggca atatcggaat tcgtgtactg cccgtaccgg taactgcatc tggtgatcga 1320

tacacgctac tgtgttattc gttgcaatgt acgaactcgt cgatttttaa cccggcaaat 1380

agcggtacga tgatagttgg gccggttcta tactcgtgtc cggcagcctc tgtaccgtaa 1440

<210> 5

<211> 741

<212> DNA

<213> Eggdrop syndrome-1976 virus

<400> 5

ccgctgtcta tcacctctga cggtgaactg accctggctt acgactctac cgacttccag 60

gttaccgaaa acggtctggc tctgaaagtt tctccgaccc agaccccgct gacccgtatc 120

atctctatgg gtaacaacct gttcgactct ggttacgaaa tcttcgcttc ttgcccgcag 180

aacaaagctg ctaaagttgc tggttacgtt tacctgacct ctgttggtgg tctggttcac 240

ggtaccatcc agatcaaagc taccgctggt tactggttca ccggtggtaa ctctgttcag 300

gaatctatcc gtttcggtct ggttctgtgc ccgttctctg ctcgtgaccc gaccgctaac 360

ctgtctggtt ggccggctcc ggttgtttgg tctggtgact ctaacacccc gctgtacttc 420

gctgctaacg ctatctctta caccaacaac cgtgttaacc tggctgttac cggtaacttc 480

tacaaagaag aaaccgaact gccgggttac acccgtcact ctttctgccc gaccggtacc 540

accggtatga acttcaccgg tggtaacctg tacgtttgcc cgtgcaccgt taacaccggt 600

gctaccaccc tgaacgctat ctacatggtt ttcgttatca cccagtctgc tctgggtacc 660

aacttcttcg cttctaacac cccgccgaac accttcttcc tgaccccgcc gatcccgttc 720

acctacgttg gtgctcagta a 741

<210> 6

<211> 1740

<212> DNA

<213> Rabbit hemorrhagic disease virus

<400> 6

atggaaggca aagcacggac ggccccgcaa ggagaggcag ctgggactgc gacaactgca 60

tcggtccctg gaacaaccac tgatggcatg gatcctggag tcgttgccgc gacgtcagtc 120

gttaccgctg agaacagttc cgcctccgtg gcaacggcgg gcattggcgg tccaccccag 180

caggtcgacc agcaggagac atggagaaca aatttctatt acaatgatgt gttcacctgg 240

tctgtcgcag acgcgccagg tagcatcctt tacacagtgc agcacagccc tcagaacaat 300

cctttcacag ctgtgttgtc gcagatgtat gcaggctggg caggtggtat gcagtttaga 360

tttattgtag ccggaagtgg agtattcgga ggacgattag tggcagcagt tatccccccg 420

ggaattgaga tcggaccggg cctcgaagtg cgtcaattcc cacatgttgt tatcgatgca 480

agatcgttgg aacctgtaac gattactatg ccagacctgc gtccaaatat gtatcatccg 540

acaggagatc caggactagt cccgacattg gttctgagtg tgtacaacaa ccttataaac 600

ccctttggag gttctacgaa cgcgatacaa gtgaccgtgg aaacaagacc tagtgaagac 660

tttgagttcg tgatgatccg agcaccctca tcaaaaaccg tcgacagcat ttctccggct 720

ggacttctca cgacacccgt gctcacgggg gtcggcaacg acaataggtg gaacggccag 780

atcgtgggac tacaaccagt cccgggtggc ttctcgacgt gcaatagaca ctggaacctg 840

aatggctcaa catacggctg gagctcacct aggtttgcag atatagatca ccgccgtggc 900

agtgccagct attctggaaa taattcaact aatgtgctcc agttttggta tgcaaacgcc 960

ggctctgcaa ttgataaccc cattagccaa gttgcacctg atgggtttcc tgacatgtcc 1020

tttgttcctt ttaactcacc gaacatccca acagcaggct gggtgggctt tggcggcatc 1080

tggaatagta acaatggtgc ccctgctgca actactgtcc aagcatatga actgggattc 1140

gccacaggcg ctcccaacaa tctacagcct actacaaaca cttccggcgc tcagaccgtc 1200

gccaagtcta tatatgccgt cgtaactggc accaaccaga atcccacggg gctatttgta 1260

atggcgtcgg gagtcataag cacccccaat gcctcagcag ttacatatac tccacaaccc 1320

gatcgtattg ttaccacccc aggtacacct gctgcagctc cggtgggtaa gaatactcct 1380

atcatgttcg cttctgtcgt aaggagaacg ggtgatgtca atgctgcagc ggggagcacc 1440

aatgggactc agtacggtac tggtagtcag cctttaccag ttaccattgg cctctcgctg 1500

aacaactact cctctgcttt gatgcccggc cagttctttg tgtggcagct cacatttgct 1560

tcgggtttta tggagattgg tctatcggta gatggttatt tttatgccgg tacgggggca 1620

agcacaacat tgatcgatct aaccgagctc atagacgtcc gaccagtcgg tccacgcccg 1680

tcgaaaagta cacttgtttt caacttagga gggacgacaa atggtttcag ctacgtttga 1740

<210> 7

<211> 645

<212> DNA

<213> Porcine circovirus

<400> 7

atgcgtcatc gtgcgatatt tcgtcgacga ccacgaccta ggcgccggcg gcgccatcgt 60

cgccgttacg cgcggcgcaa attatttata cgtagaccga ctgcgggaac gtactacacg 120

aaaaaatatt cgacgatgaa cgtaatctcg gtaggtactc cgcaaaacaa taagccgtgg 180

cacgctaacc attttattac gcggttaaac gaatgggaga ctgcgataac tttcgaatac 240

tacaaaatat taaaaatgaa agtaactcta tctcccgtta tcagtccagc gcaacaaacg 300

aagacgatgt tcgggcatac tgcgatcgat ttggacggag cgtggactac gaatacgtgg 360

ttgcaagacg acccgtacgc cgaatcaagc acacgtaaag taatgacttc gaaaaaaaaa 420

catagccgat attttacgcc aaaaccttta ttggcgggta caacaagcgc gcacccggga 480

caatcgctat tttttttttc acgtccaacc ccgtggttga acacgtacga tccaaccgtt 540

caatggggtg ctttactttg gtcgatatac gtcccggaaa aaactggtat gactgatttt 600

tacggtacga aggaagtatg gatacgttac aaatctgtac tataa 645