一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法

技术领域

本发明涉及植物显微技术领域，具体是一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法。

背景技术

睡莲(学名：Nymphaea)是我国新兴的水生植物，其花色丰富、香味浓郁，具有水体净化的功能，在中国的广西、海南等地区，群体花期可达9个月以上，在城市的水生园林景观、观光农业中的应用日渐广泛，人们对睡莲优良新品种的需求也日益增加。杂交育种是创制睡莲新品种的主要手段，然而在杂交过程中，亲本之间常常因杂交亲和性低的原因而无法结实，导致优势基因难以利用。因此，杂交亲和性的研究对于睡莲的杂交育种至关重要。

观察睡莲花粉管与胚珠的生长情况是研究睡莲杂交亲和性的重要手段之一，对于睡莲杂交育种有重要的指导意义。石蜡制片是常用的微观组织制备技术，将组织切成1至10微米的薄片，多运用于雌蕊细小的植物，而睡莲的雌蕊结构特殊，体型较大，花粉管可横纵生长，通过石蜡制片难以获得完整的花粉管组织。目前常用石蜡切片观察睡莲的胚珠，用扫描电镜观察花粉管(《睡莲品种墨宝自交结实率低的细胞学机理》，孙春青，潘跃平，单延博，孙国胜，戴忠良，江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏农业学报，2017，33)；或者用荧光显微镜观察睡莲花粉管，再用石蜡切片的方法观察睡莲的胚珠。传统的授粉雌蕊荧光显微观察技术是利用苯胺蓝与花粉管壁中的胼胝质结合，在紫外光下花粉管呈现明亮黄绿色荧光，已经广泛应用于植物杂交亲和性检测当中，然而荧光显微镜与普通的光学显微镜相比造价昂贵，使用成本高，不适用于许多小型实验室。

因此，寻找一种在光学显微镜的条件下，也能够快速、完整的观察到睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法是目前的当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的显微方法以及光学显微压片制作方法。

一种睡莲授粉后花粉管与胚珠的光学显微压片制作方法，由对授粉后的睡莲花雌蕊的采样、子房室分离、固定样本、软化组织、组织染色、组织压片、干燥七个步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样：摘下已经授粉的睡莲花花朵，剥离花瓣、花托，仅留下雌蕊；

(2)子房室分离：睡莲的雌蕊中整齐排列10到20个子房室，将子房室一一分离，可以最大限度的减少子房室内膜的损伤，防止内部的胚珠泄露，有效的分离子房室；

(3)固定样本：迅速将样本轻轻放入组织固定液中，杀死细胞，固定24小时以上；

(4)软化组织：在23-27℃条件下，将组织浸泡在4-6mol/L NaOH溶液中静置6-8小时；

(5)组织染色：将完成软化的待检样本置于盛有蒸馏水的培养皿清洗，随后，将样本置于乳酸酚棉蓝染色液中染色，静置8至12分钟；

(6)组织压片：采用“载玻片+材料+载玻片”的方式进行压片处理；

(7)干燥：此时，样本制片已基本完成，但两载玻片之间含有大量的水分、多余的染色液和气泡，影响光学显微观察效果，且不利于样本制片的长期保存，将样本制片置于恒温电烘箱中，33-37℃干燥3至5小时，去除样本中的水分。

进一步的，所述的雌蕊，包括雌蕊中的花粉管。

进一步的，所述步骤(2)，将子房室一一分离的方法，具体是：每个子房室外侧上方有一个雌蕊附属物，沿着雌蕊附属物的边缘进行切片，将子房室一一分离。

进一步的，所述步骤(3)，固定液的配比使用体积分数为80％乙醇、体积分数35％甲醛、体积分数35％冰醋酸混合而成，且体积比为10：1：1。

进一步的，所述步骤(5)的清洗，具体是：轻轻摇晃培养皿，清洗30秒后更换蒸馏水，重复此操作3次。

进一步的，所述步骤(6)的采用“载玻片+材料+载玻片”的方式进行压片处理，具体是：首先，将载玻片A的左右两端边缘处涂抹中性树胶；其次，将样本置于载玻片A的中心处，用另一规格相同的载玻片B轻轻盖在样本上；最后，固定好载玻片A的位置，轻撵载玻片B进行压片处理。本申请的压片方法与传统的“载玻片+材料+盖玻片”方法有所差异，本发明专利中的制片方法采用“载玻片+材料+载玻片”的模式，主要原因有以下两方面：一方面是盖玻片材质较脆，在压片过程中容易碎裂，另一方面在压片的过程中，软化的样本会溢出大量的水分，而盖玻片的面积较小，没有充足的区域用于涂抹封片的中性树胶，溢出的水分极易与中性树胶混合一起，影响显微观察效果。

通过所述的光学显微压片制作方法制作得到睡莲授粉后花粉管与胚珠的光学显微压片，然后在光学显微镜下观察，花粉管呈深蓝色(近似黑色)，能清晰看到花粉管在睡莲雌蕊中的生长情况，包括授粉后花粉管的生长途径与镜检区域的胚珠数量。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

(1)目前针对睡莲花粉管和胚珠的显微观察，通常需要使用荧光显微镜，使用光学显微镜无法清晰的观察。本申请制作得到睡莲授粉后花粉管与胚珠的光学显微压片，可以在光学显微镜下观察，花粉管呈深蓝色(近似黑色)，能清晰看到花粉管在睡莲雌蕊中的生长情况，包括授粉后花粉管的生长途径与镜检区域的胚珠数量无需在荧光显微镜下观察雌蕊中的花粉管与胚珠，该压片仅仅依靠光学显微镜即可，极大的降低了观测成本。

(2)睡莲花粉管在雌蕊中的生长途径纵横交错，传统的石蜡制片将组织纵向切成1至10微米的薄片，仅能观测到零散的花粉管片段，本发明使用“载玻片+材料+载玻片”的压片制片，并通过35℃干燥去除水分和气泡，能通过光学显微镜清晰完整的观察到花粉管的生长途径以及胚珠的分布。

(3)目前针对睡莲花粉管和胚珠的显微观察，通常需要分开进行观察睡莲的花粉管和胚珠，需要采用两种不同的制片方法和观察方法，而我们只需要一个压片就都可以同时观察睡莲的花粉管和胚珠，只需要一个压片一次观察即可。

(4)本申请的方法是通过压片的方式，将厚组织软化后压成薄片，可以较完整保留花粉管。本申请的方法无需石蜡切片、包埋等繁琐的步骤，极大的节约了实验的成本与时间。

附图说明

图1是睡莲的单个子房室，是用刀片从睡莲子房中一一分离而来，沿着雌蕊附属物边缘切下，可以不损坏子房室两侧的薄膜，防治胚珠在软化过程中泄露。箭头1是雌蕊附属物，箭头2是胚珠所在部位，表面有一层薄膜。

图2为25℃条件下，在盛有5mol/L NaOH溶液的培养皿中软化7小时的子房室。

图3为本发明专利所制作的组织压片，在光学显微镜下可清晰显示花粉管的生长途径与镜检区域的胚珠数量，箭头1为睡莲的花粉管簇，圆圈处为睡莲的胚珠。

图4为不进行组织染色的组织制片，在光学显微镜下花粉管和胚珠呈现不清晰。

图5为乳酸酚棉蓝染色10分钟的组织制片，在光学显微镜下可以看到花粉管与胚珠的轮廓在睡莲的雌蕊中被染成深蓝色。

图6为乳酸酚棉蓝染色4小时的组织制片，在光学显微镜下观察，看到乳酸酚棉蓝染液侵染了全部组织。

图7为以本发明专利所述方法获得的压片，在光学显微镜下观察的图片。

图8为以“载玻片+材料+盖玻片”方法获得的压片，在光学显微镜下观察的图片。

图9为在35℃条件下进行4小时干燥处理的样本制片，在光学显微镜下观察的图片。

图10为未经干燥处理的样本制片，在光学显微镜下，样本含有大量水分、多余的染色液以及气泡。

图11为完全按照实施例1所述的方法进行样本制片，在光学显微镜下的观察图片，可以清晰完整的看到花粉管的生长途径以及胚珠的分布。

图12为传统的石蜡切片方法所获得的样本制片，在光学显微镜下无法观察到完整的花粉管。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1

以睡莲品种‘公牛眼’为父本，‘泰国王’为母本，异花授粉12小时后，对授粉后的睡莲花雌蕊的采样、子房室分离、固定样本、软化组织、组织染色、组织压片、干燥七个步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样：摘下已经授粉的睡莲花花朵，剥离花瓣、花托，仅留下雌蕊(包括雌蕊中的花粉管)。

(2)子房室分离：睡莲的雌蕊中整齐排列10到20个子房室，使用刀片将子房室一一分离，如图1所示，箭头1所指处是每个子房室外侧上方的一个雌蕊附属物，箭头2所指处是睡莲胚珠所在部位，由一层薄膜保护。沿着雌蕊附属物的边缘进行切片，可以最大限度的减少子房室内膜的损伤，防止内部的胚珠泄露，有效的分离子房室。

(3)固定样本：迅速将样本轻轻放入组织固定液中，杀死细胞，固定24小时。固定液的配比使用体积分数为80％乙醇、体积分数35％甲醛、体积分数35％冰醋酸混合而成，且体积比为10：1：1。

(4)软化组织：如图2所示，在25℃条件下，将组织浸泡在盛有5mol/LNaOH溶液的培养皿中静置7小时。

(5)组织染色：将完成软化的待检样本置于盛有蒸馏水的培养皿清洗30秒。此时样本完全软化，容易破碎，因此需要轻轻摇晃培养皿，30秒后更换蒸馏水，重复此操作3次。随后，将样本置于乳酸酚棉蓝染液中染色，静置10分钟。

(6)组织压片：本发明专利采用“载玻片+材料+载玻片”的方式进行压片处理。首先，将载玻片A的左右两端边缘处涂抹中性树胶。其次，将样本置于载玻片A的中心处，用另一规格相同的载玻片B轻轻盖在样本上，最后，固定好载玻片A的位置，轻撵载玻片B进行压片处理。

(7)干燥：此时，样本制片已基本完成，但两载玻片之间含有大量的水分、多余的染色液和气泡，影响光学显微观察效果，且不利于样本制片的长期保存。将样本制片置于恒温电烘箱中，35℃干燥4小时，去除样本中的水分。

将制备得到的压片在光学显微镜下观察，花粉管呈深蓝色(近似黑色)，能清晰看到花粉管在睡莲雌蕊中的生长情况，包括授粉后花粉管的生长途径与镜检区域的胚珠分布，如图3所示，箭头1所指处为的深蓝色线条为睡莲花多根花粉管聚集成簇，圆圈处为睡莲的胚珠。

实施例2

以睡莲品种‘公牛眼’为父本，‘泰国王’为母本，异花授粉12小时后，对授粉后的睡莲花雌蕊的采样、子房室分离、固定样本、软化组织、组织染色、组织压片、干燥七个步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样：摘下已经授粉的睡莲花花朵，剥离花瓣、花托，仅留下雌蕊(包括雌蕊中的花粉管)。

(2)子房室分离：睡莲的雌蕊中整齐排列10到20个子房室，使用刀片将子房室一一分离，如图1所示，箭头1所指处是每个子房室外侧上方的一个雌蕊附属物，箭头2所指处是睡莲胚珠所在部位，由一层薄膜保护。沿着雌蕊附属物的边缘进行切片，可以最大限度的减少子房室内膜的损伤，防止内部的胚珠泄露，有效的分离子房室。

(3)固定样本：迅速将样本轻轻放入组织固定液中，杀死细胞，固定24小时。固定液的配比使用体积分数为80％乙醇、体积分数35％甲醛、体积分数35％冰醋酸混合而成，且体积比为10：1：1。

(4)软化组织：如图2所示，在23℃条件下，将组织浸泡在盛有6mol/LNaOH溶液的培养皿中静置6小时。

(5)组织染色：将完成软化的待检样本置于盛有蒸馏水的培养皿清洗30秒。此时样本完全软化，容易破碎，因此需要轻轻摇晃培养皿，30秒后更换蒸馏水，重复此操作3次。随后，将样本置于乳酸酚棉蓝染液中染色，静置10分钟。

(6)组织压片：本发明专利采用“载玻片+材料+载玻片”的方式进行压片处理。首先，将载玻片A的左右两端边缘处涂抹中性树胶。其次，将样本置于载玻片A的中心处，用另一规格相同的载玻片B轻轻盖在样本上，最后，固定好载玻片A的位置，轻撵载玻片B进行压片处理。

(7)干燥：此时，样本制片已基本完成，但两载玻片之间含有大量的水分、多余的染色液和气泡，影响光学显微观察效果，且不利于样本制片的长期保存。将样本制片置于恒温电烘箱中，33℃干燥5小时，去除样本中的水分。

实施例3

以睡莲品种‘公牛眼’为父本，‘泰国王’为母本，异花授粉12小时后，对授粉后的睡莲花雌蕊的采样、子房室分离、固定样本、软化组织、组织染色、组织压片、干燥七个步骤组成，各步骤具体操作如下：

(1)采样：摘下已经授粉的睡莲花花朵，剥离花瓣、花托，仅留下雌蕊(包括雌蕊中的花粉管)。

(2)子房室分离：睡莲的雌蕊中整齐排列10到20个子房室，使用刀片将子房室一一分离，如图1所示，箭头1所指处是每个子房室外侧上方的一个雌蕊附属物，箭头2所指处是睡莲胚珠所在部位，由一层薄膜保护。沿着雌蕊附属物的边缘进行切片，可以最大限度的减少子房室内膜的损伤，防止内部的胚珠泄露，有效的分离子房室。

(3)固定样本：迅速将样本轻轻放入组织固定液中，杀死细胞，固定24小时。固定液的配比使用体积分数为80％乙醇、体积分数35％甲醛、体积分数35％冰醋酸混合而成，且体积比为10：1：1。

(4)软化组织：如图2所示，在27℃条件下，将组织浸泡在盛有4mol/LNaOH溶液的培养皿中静置8小时。

(5)组织染色：将完成软化的待检样本置于盛有蒸馏水的培养皿清洗30秒。此时样本完全软化，容易破碎，因此需要轻轻摇晃培养皿，30秒后更换蒸馏水，重复此操作3次。随后，将样本置于乳酸酚棉蓝染液中染色，静置10分钟。

(6)组织压片：本发明专利采用“载玻片+材料+载玻片”的方式进行压片处理。首先，将载玻片A的左右两端边缘处涂抹中性树胶。其次，将样本置于载玻片A的中心处，用另一规格相同的载玻片B轻轻盖在样本上，最后，固定好载玻片A的位置，轻撵载玻片B进行压片处理。

(7)干燥：此时，样本制片已基本完成，但两载玻片之间含有大量的水分、多余的染色液和气泡，影响光学显微观察效果，且不利于样本制片的长期保存。将样本制片置于恒温电烘箱中，37℃干燥3小时，去除样本中的水分。

对比例1

不进行步骤(5)的组织染色，其余步骤参照实施例1的方法进行。

对比例2

步骤(5)中使用乳酸酚棉蓝染液染色4小时，其余步骤参照实施例1的方法进行。

对比例1中未染色的组织制片结果如图4，在光学显微镜下花粉管和胚珠呈现不清晰。与实施例1中的乳酸酚棉蓝染色10分钟的组织制片结果如图5，可以看到花粉管和胚珠的轮廓在睡莲的雌蕊中被染成深蓝色，胚珠呈现出完整的轮廓。对比例2中乳酸酚棉蓝染色4小时的组织制片结果如图6，乳酸酚棉蓝染液侵染了全部组织，光学显微镜下无法清晰的观察花粉管、胚珠。

对比例3

步骤(6)采用传统的“载玻片+材料+盖玻片”，先将材料置于载玻片上，然后用盖玻片轻轻碾压样本进行压片，随后用滤纸沿着盖玻片边缘将样本中的水分吸出，再用胶头吸管向盖玻片内侧滴加中性树胶封片。其余步骤参照实施例1的方法进行。

实施例1的光学显微镜观察结果如图7所示，可以清晰看到花粉管的生长以及胚珠等组织结构。

对比例3的光学显微镜观察结果如图8所示，对比例3中的样品由于水分和中性树胶混合，在光学显微镜下可以看到明显的中性树胶颗粒，影响了观察效果。

对比例4

不进行步骤(7)的干燥，其余步骤参照实施例1的方法进行。

实施例1的光学显微镜观察结果如图9所示，样本中无气泡、水分等因素干扰。对比例4(未干燥样本制片)的观察结果如图10所示，样本中含有大量水分、多余的乳酸酚棉蓝染色液以及气泡，严重影响了观察效果。

对比例5

采用传统的石蜡切片方法制片，具体操作为：新鲜组织用固定液固定24h以上。依次用梯度浓度的酒精进行脱水，55℃纯蜡浸蜡。将浸蜡的组织于包埋机内进行包埋，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块，置于石蜡切片机进行切片，在37℃温水上将组织切片展平，用载玻片将组织粘片，37℃烘箱内烤片，随后采用过碘酸希夫染色液进行染色，最后用中性树胶封片即可进行光学显微镜观察。

实施例1即采用本专利所述的制片方法获得的样本在光学显微镜下能看到完整的花粉管(如图11所示)。而对比例5使用石蜡切片获得的样本在光学显微镜下无法看到完整的花粉管组织(如图12所示)，这是由于石蜡切片将睡莲雌蕊纵向切成1至10微米的薄片，而花粉管的生长是纵横交错的，因此横向生长的花粉管被切断，无法呈现完整的生长途径。

由上可知，本申请制作得到睡莲授粉后花粉管与胚珠的光学显微压片，可以在光学显微镜下观察，花粉管呈深蓝色(近似黑色)，能清晰看到花粉管在睡莲雌蕊中的生长情况，包括授粉后花粉管的生长途径与镜检区域的胚珠数量无需在荧光显微镜下观察雌蕊中的花粉管与胚珠，该压片仅仅依靠光学显微镜即可，极大的降低了观测成本。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。