用于副结核病的免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及治疗或预防鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium aviumsubspecies paratuberculosis，MAP)的感染，并且涉及治疗或预防与MAP感染相关的疾病。

背景技术

MAP是一种生长非常缓慢的细胞内分枝杆菌病原体，可导致许多动物物种(包括灵长类动物)全身感染和慢性肠炎症(约内氏病(Johne’s disease，JD))。MAP于1894年在德国的一头病奶牛上首次发现。在随后的几年中，MAP感染和疾病似乎仅限于欧洲和北美。此后，由于亚临床感染家畜的国际贸易以及能够在最早阶段识别MAP感染的可靠灵敏的诊断技术的缺乏，该病毒已在全球范围内传播。MAP基因组富含GC(69.3％)，并且在序列和遗传组织上与紧密相关的鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)和其他在动物和人的环境及微生物组中富有的细菌具有96.4％的同源性(Li et al.PNAS 2005；102:12344-9)。

被MAP感染的动物将这些生物体散布到牧场上。在多杆菌病(pluribacillarydisease)中，被MAP感染的动物的粪便中的MAP病原体为其常见的杆状形式，通过显微镜可见已建立的染上红色的齐尔-尼尔森(Ziehl-Neelsen)涂层。人类似乎对这种杆状形式的MAP不太敏感，这种杆状形式的MAP作为也是常规的部分有效的全灭活MAP疫苗中常用的一种。研究表明，儿童在早期暴露于被MAP感染的农场动物，特别是牛，可导致随后的克罗恩病(Crohn’s disease)发病率显著降低(Cucino C,Sonnenberg A.(2001)Am JGastroenterol.96:1101-5.Radon K.et al(2007)Paediatrics；120:354-61)。

在被感染的动物本身的体内，MAP存在于细胞内。这种形式对人类似乎更具侵略性，因此，牛奶、乳制品和肉类中被感染的动物细胞是反复MAP感染和长期定殖的来源。此外，MAP是一种顽强环境生物体，巴氏灭菌对其破坏作用还不完全。因此，来自牛、绵羊和山羊的乳制品对人类具有风险。

MAP存活于牧场上，并被原生生物吸收，在该原生生物的细胞内环境中，MAP可存活数月或数年。这些生物体感染野生动物，例如兔，其负载MAP的粪便被放牧的牛再次吸收。来自死亡的被感染动物的MAP也通过腐肉进食者传播。剔除被感染动物并隔一段时间再饲养健康的牲畜只会导致慢性MAP感染的复发。降雨将MAP冲洗到河流中，从河流中MAP可以通过气溶胶扩散以及通过生活用水直接扩散(Richardson et al.2019 Microorganisms 7,136)。

一旦在农场动物及其环境中确定有MAP，它就会存留，并在一段时间后一直伴随有人群中克罗恩病的出现和增加。MAP感染的主要贮存体是不断补充的来自被感染的牲畜的MAP的环境资源。因此，对全球MAP问题的控制和随后的逆转取决于对其存在的识别以及有效疫苗的可用性，这可阻止粪便散播并减少或消除动物和人慢性MAP感染。美国农业部获得的数据预测，美国奶牛群中有91.1％被MAP感染(Lombard JE et al.(2013)PreventiveVeterinary Medicine 108:234–238)。

在20世纪80年代后期，对IS900元件进行了识别和表征(Green et al.(1989)Nucleic AcidsRes；17:9063-73)。它是在MAP和紧密相关的鸟分枝杆菌中发现的一组相关但不同的DNA插入元件中的第一个。MAP是唯一已知的具有14至18个相同拷贝IS900的生物体。MAP也是引起许多物种(包括灵长类动物)慢性炎症疾病的唯一已知病原体。

HAV疫苗有限公司(HAV Vaccines Ltd)与牛津大学詹纳研究所(OxfordUniversity JennerInstitute)已经开发了一种病毒载体的抗MAP疫苗，其提供了含有HAV疫苗插入物的hAd5和ChAdOx2腺病毒初免(priming)载体和MVA加强(boosting)载体(Bullet al.2007 PLoS ONE2(11):e1229；Bull et al.2014 Veterinary Research 45:112)。HAV疫苗有限公司设计并制造了“HAV”疫苗插入物，“HAV”疫苗插入物在WO 2007/017635中进行了描述，并包含来自所有MAP菌株中存在的4个MAP基因1589c(AhpC)、1234(Gsd)、2444c(p12)和1235(mpa)的95 kDa融合构建体。AhpC是其他病原性分枝杆菌共有的MAP中的一种分泌型毒力因子。Gsd直接参与岩藻糖的合成和运输，岩藻糖有助于MAP的相对惰性和高度化学抗性以及酶抗性。P12主要由分枝杆菌细胞释放的IS900蛋白的胞外羧基末端部分组成，并参与致病性。Mpa是细胞表面酰基转移酶，可能具有孔功能，这有助于MAP的固有耐药模式。

在HAV插入物的所有这4个MAP基因内，都存在与克罗恩病的次生辅助病原体(secondary co-pathogen)(包括一些大肠杆菌和其他鸟分枝杆菌属(M.avium sp))中的那些序列相似的序列。预计通过疫苗接种诱导的对HAV插入物的快速免疫反应的重叠使治疗性疫苗接种的功效最大化。对所选HAV基因的DNA进行密码子优化以用于哺乳动物细胞表达，并串在一起以表达单个HAV疫苗抗原。为了患者安全，将其进一步编辑以去除与哺乳动物序列具有同源性的任何遗传序列。

由于缺乏实用的临床MAP诊断，对人MAP感染的现状的认识延迟了很多年(Nacy和Buckey，来自2008年American Academy of Microbiology的报告“Mycobacterium aviumparatuberculosis:Infrequent Human Pathogen or Public Health Threat？”)。

发明内容

本发明人惊奇地发现，来自MAP P900蛋白的N末端区域的肽片段是具有免疫原性的。使用这种肽片段的抗体，发明人已经示出MAP P900在被MAP感染的人和动物对象中表达。发明人还示出，MAP 900蛋白被切割，使得N末端胞外结构域和C末端胞外结构域并不总是在感染的对象的细胞中共定位(co-localise)。此外，发明人已经示出，可以产生对磷酸化的N末端肽或该肽的非磷酸化形式具有特异性的抗体，并且抗体是互斥的。使用这种磷酸化敏感性抗体，发明人已经示出，与被感染动物的肠道相比，在被感染的人的肠道中P900的N末端的磷酸化模式不同。在被感染动物中，N末端在被感染的肠道中被磷酸化，而在人中，磷酸化的N末端仅在感染MAP的对象的血细胞中可见。

基于P900对MAP的重要性、其对单个感染细胞和感染细胞群体的作用的认识(包括观察到的N末端胞外结构域的裂解及其随后的分离)、以及P900的C末端结构域的差异定位，本发明人已经开发了一种新型MAP疫苗。发明人已经示出，N末端结构域内的肽是具有免疫原性的。这些肽和包含这些肽的更长的多肽、以及编码这些肽和多肽的多核苷酸可以用作疫苗。例如，发明人已经发现这些肽和多肽可以在本领域描述的HAV疫苗中提供额外的表达刺激。

因此，本发明提供用于治疗或预防对象MAP感染或与对象MAP感染相关的病症或症状的方法的疫苗，该疫苗包含多肽或编码所述多肽的多核苷酸，该多肽包含来自SEQ IDNO：2所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列。

在特定的实施方式中，该疫苗包含含有氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR的多肽或编码这种多肽的多核苷酸。包含氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR的多肽可以在疫苗组合物中或在将疫苗给药至对象后在丝氨酸残基处被磷酸化。该疫苗对于治疗患有以下疾病的对象特别有用：克罗恩病、约内氏病、溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)、银屑病(Psoriasis)、甲状腺炎(Thyroiditis)、结节病(Sarcoidosis)、帕金森病(Parkinson’s disease)、多发性硬化症(Multiple Sclerosis)、1型糖尿病(Type 1 Diabetes)、关节炎(arthritis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、肠易激综合征(irritablebowel syndrome)、炎性肠病(inflammatory bowel disease)、慢性肠炎(chronic enteritis)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、多发性硬化症(multiplesclerosis)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)、麻风病(leprosy)和/或慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)。

本发明还提供：

-多达100个氨基酸的肽，该肽包含氨基酸序列：

MVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELI；

-多肽，该多肽包含氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR和ahpC多肽、gsd多肽、p12多肽和/或mpa多肽的多肽；

-疫苗载体，该疫苗载体包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含来自SEQ ID NO：2所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列；

-用于治疗或预防对象MAP感染或与对象MAP感染相关的病症或症状的方法的由氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR组成的肽、或本发明的肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体。

-治疗或预防MAP感染或与MAP感染相关的病症或症状的方法，该方法包括将有效量的以下物质给药至有此需要的对象：包含来自SEQ ID NO：2所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列的多肽、编码该多肽的多核苷酸、由氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR组成的肽、或本发明的肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体。

-试剂盒，所述试剂盒用于治疗或预防MAP感染或与MAP感染相关的病症或症状，所述试剂盒包含用于同时、顺序或分开使用的：(i)以下中的至少一种：包含来自SEQ ID NO：2所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列的多肽、编码所述多肽的多核苷酸、由氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR组成的肽，或本发明的肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体；(ii)至少一种其他治疗剂。

附图说明

图1示出了使用抗鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)的两种特异性单克隆抗体对患有克罗恩病的40岁男性的回肠中的MAP ISP900进行染色。A1为红色(右上)，A4为绿色(左上)。下图示出两者的混合图；

图2示出了使用A1抗体(红色/右上)和A4抗体(绿色/左上)染色的患有克罗恩病的个体的横结肠。下图示出两者的混合图；

图3示出了使用A1抗体(红色/右上)和A4抗体(绿色/左上)染色的患有克罗恩病的个体的回肠。下图示出两者的混合图；

图4示出了使用A1抗体(红色/右上)和A4抗体(绿色/左上)染色的患有克罗恩病的3

月龄的男孩的直肠。下图示出两者的混合图；

图5示出了使用A1抗体(红色/右上)和A4抗体(绿色/左上)染色的患有约内氏病的绵羊的肠道小动脉。下图示出两者的混合图；

图6示出了使用A1抗体(红色/右上)和A4抗体(绿色/左上)染色的患有克罗恩病的个体的肠道小动脉。下图示出两者的混合图；

图7示出了使用A0X抗体染色的母乳中的负载MAP的白细胞；

图8示出了血液中的负载MAP的白细胞。示出了细胞的相衬图像(右上)并用A0X抗体(左上)染色。下图是两个图像的叠加；

图9示出了来自患有严重克罗恩病的25岁男性的血液中的A4染成红色(右上)的和XA4P染成绿色(左上)的单核细胞。细胞没有穿孔，因此染色针对该细胞表面，并且几乎肯定会扰乱其功能。单克隆抗体的靶包括含有1个丝氨酸残基的相同的氨基酸序列。该丝氨酸在A4靶中没有被磷酸化，但在XA4P靶中被磷酸化。磷酸化事件导致靶改变其免疫原性，因此尽管它们彼此以紧密并置挤满细胞表面，但是它们并不相混。因此，A4单克隆抗体和XA4P单克隆抗体的使用允许使用2种MAP产品来追踪分子并研究其位置的行动。

SEQ ID NO：1和2分别是MAP P900蛋白的N末端区域的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：3和4分别是短A0X肽和长A0X肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5和6分别是显示磷酸化位点的短A0X肽和长A0X肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7和8分别是短A1肽和长A1肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9和10分别是短AN末端肽和长AN末端肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11和12分别是与A1短肽连接的A0X短肽和与A1长肽连接的A0X短肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13和14分别是与A1短肽连接的A0X长肽和与A1长肽连接的A0X长肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15和16分别是与A0X短肽连接的AN短肽和与A0X长肽连接的AN短肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17和18分别是与A0X短肽连接的AN长肽和与A0X长肽连接的AN长肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19和20分别是与连接至A1长肽的A0X长肽连接的AN短肽和与A0X长肽连接的AN长肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21和22分别是MAP ahpC基因的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：23和24分别是MAP gsd基因的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：25和26分别是MAP p12基因的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：27和28分别是截短的MAP p12基因的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：29和30分别是MAP mpa基因的核酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：31和32分别是MAP ahpC基因的修饰版本的核酸和氨基酸序列，其中已经对该核酸序列进行密码子优化以供人使用。

SEQ ID NO：33和34分别是MAP gsd基因的修饰版本的核酸和氨基酸序列，其中已经对该核酸序列已被进行密码子优化以供人使用，并且在N末端被截短以除去第22位的半胱氨酸残基。

SEQ ID NO：35和36分别是MAP p12基因的修饰版本的核酸和氨基酸序列，其中已经对该核酸序列已被进行密码子优化以供人使用。

SEQ ID NO：37和38分别是截短的MAP p12基因的修饰版本的核酸和氨基酸序列，其中已经对该核酸序列已被进行密码子优化以供人使用。

SEQ ID NO：39和40分别是MAP mpa基因的修饰版本的核酸和氨基酸序列，其中已经对该核酸序列已被进行密码子优化以供人使用并且许多跨膜区域已被移除。

SEQ ID NO：41是内部截短的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42是HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43是全长MAP P900蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：44是A4肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：45是被磷酸化的A4肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：46是可替换地被磷酸化的A4肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47是被双磷酸化的A4肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：48是A3肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：49是HAV疫苗的核酸序列。

SEQ ID NO：50是来自P900的N末端区域的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：51是P900的胞外区域的部分的氨基酸序列。

SEQ ID NO：52是包含来自P900的胞外区域的三条肽的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：53是P900的跨膜区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：54是P900的分枝杆菌内区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：55是P900的变体分枝杆菌内区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：56是P900的跨膜区域和分枝杆菌内区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57是P900的跨膜区域和变体分枝杆菌内区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：58是包含P900的胞外区域的部分、跨膜区域和分枝杆菌内区域的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59是包含P900的胞外区域的部分、跨膜区域和变体分枝杆菌内区域的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：60是包含来自P900的胞外区域的三条肽、P900的跨膜区域和P900的分枝杆菌内区域的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是包含来自P900的胞外区域的三条肽、P900的跨膜区域和P900的变体分枝杆菌内区域的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：62是在N末端添加了SEQ ID NO：59的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63是HAVX1疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：64是在N末端添加了SEQ ID NO：58的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65是在N末端添加了SEQ ID NO：58的内部截短的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是在N末端添加了SEQ ID NO：59的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63是HAVX2疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：64是在N末端添加了SEQ ID NO：60的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65是在N末端添加了SEQ ID NO：60的内部截短的HAV疫苗多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：70是2A肽的共有氨基酸序列。

SEQ ID NO：71是2A肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：72至146是实施例中描述的肽和多肽的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明提供用于治疗或预防对象MAP感染或与对象MAP感染相关的病症或症状的方法的疫苗，该疫苗包含多肽、或编码所述多肽的多核苷酸，该多肽包含来自SEQ ID NO：2所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列。

疫苗中的多肽可以包含SEQ ID NO：2的9至71、10至70、12至65、15至60、18至55、20至50、25至45，或30至40个连续的氨基酸，由SEQ ID NO：2的9至71、10至70、12至65、15至60、18至55、20至50、25至45，或30至40个连续的氨基酸组成或基本上由SEQ ID NO：2的9至71、10至70、12至65、15至60、18至55、20至50、25至45，或30至40个连续的氨基酸组成。

该多肽可以包含两个或更多个来自SEQ ID NO：2的至少9个连续氨基酸的片段(stretch)。例如，该多肽可以包含一个、两个、三个或更多个来自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的9个或更多个连续氨基酸的片段。氨基酸的每个连续片段可以是9至30个氨基酸的片段，例如来自长度为12至25、13至24、14至22或15至20个氨基酸的片段。来自SEQ ID NO：2的连续的氨基酸可以彼此直接连接，或者可以包含在连续的氨基酸的片段之间的接头(linker)。优选地，使用肽接头(例如另一个氨基酸序列)来连接氨基酸的连续片段。

疫苗可以包含多肽，该多肽包含以下物质，由以下物质组成或基本上由以下物质组成：SEQ ID NO：3的氨基酸序列(MVINDDAQRLLSQR)和/或单独或组合的如下所述的任何一种或多种肽或多肽。具体而言，疫苗可以包含多肽，该多肽包含以下氨基酸序列中的至少一个氨基酸序列，由以下氨基酸序列中的至少一个氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列中的至少一个氨基酸序列组成：MVINDDAQRLLSQR(SEQ ID NO：3)，MVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELI(SEQ ID NO：4)，MVINDDAQRLL[pS]QR(SEQ ID NO：5)，VTTLADGGEVTWAID(SEQ ID NO：7)，VTTLADGGEVTWAIDLNA(SEQ ID NO：8)，EVVVAQPVWAGVDAGKADHY(SEQ ID NO：9)，MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHY(SEQ ID NO：10)和VDAGKADHY(SEQ ID NO：50)。在多肽中存在两个或更多个这些氨基酸序列的情况下，它们可以彼此直接连接，或者该多肽可以包含一个或多个另外的连接氨基酸，例如1至20、2至15、3至10或4至8个氨基酸。例如，可以使用A或AA将VTTLADGGEVTWAID(SEQ ID NO：7)、VTTLADGGEVTWAIDLNA(SEQ ID NO：8)连接至另一个氨基酸序列。氨基酸可以以任何顺序连接。在一些实施方式中，它们以在P900中出现的顺序进行连接。

在一些实施方式中，疫苗中的多肽，或由疫苗编码的多肽，以任意顺序包含SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7中的任何两个或所有的氨基酸序列。这些序列可以彼此直接相邻，或者可以包括连接它们的一种或多种另外的氨基酸。在一些实施方式中，SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7可以以该顺序连接。在这些情况下，多肽可以包含整个正常分枝杆菌外区域的氨基酸序列：

MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYCMVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELIAAVTTLADGGEVTWAID(SEQ ID NO：51)。

在一些实施方式中，疫苗中的多肽，或由疫苗编码的多肽，以任意顺序包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。例如，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：50和SEQID NO：7可以以该顺序连接。这些序列可以彼此直接相邻，或者可以包括连接它们的一种或多种另外的氨基酸。例如，多肽可以包含氨基酸序列：

MVINDDAQRLLSQRVDAGKADHYAVTTLADGGEVTWAID(SEQ ID NO：52)。

在一些实施方式中，疫苗可以另外包含形成P900的跨膜片段的全部或部分的氨基酸序列。例如，

疫苗可以例如，包含或编码多肽，该多肽包含氨基酸序列：

MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYCMVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELIAAVTTLADGGEVTWAID

MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYCMVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELIAAVTTLADGGEVTWAID

MVINDDAQRLLSQRVDAGKADHYAVTTLADGGEVTWAID

MVINDDAQRLLSQRVDAGKADHYAVTTLADGGEVTWAID

SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59表示正常的分枝杆菌外区域、跨膜区域(SEQ IDNO：53)和P900序列的第一个分枝杆菌内部分(SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：55)，该第一个分枝杆菌内部分在假定的转座酶的活性位点机制缺失的情况下停止。它没有已知的毒性，在MAP感染期间在体内大量表达。SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61就在其即将进入跨膜序列(SEQ ID NO：53)之前，破坏P900的正常序列，着重于N末端表位(SEQ ID NO：3)并暴露另一个表位(SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：8)。本发明人首次示出P900的胞外氨基末端包含至少三个免疫原性区域。这些免疫原性区域是SEQ ID NO：3和4(本文中称为A0X)，其可被磷酸化以形成：SEQ ID NO：5和6(本文中称为A0XP)；SEQ ID NO：7和8(本文中称为A1)；以及SEQ IDNO：9和10(本文中称为AN)。

在一个优选实施方式中，疫苗包含A0X肽，或者A0X肽编码在疫苗序列中并以天然氨基酸形式表达。疫苗接种和表达后，丝氨酸可以如所示被磷酸化。肽的磷酸化和非磷酸化形式均可存在于相同的被MAP感染的细胞内和相同的细胞表面上。类似地，接种的对象可以向免疫系统呈现磷酸化和非磷酸化形式。使用对天然肽或其磷酸化衍生物具有特异性的荧光单克隆抗体对这种细胞染色显示出这些抗体是互斥的，并显露出单独的标记肽簇，这些肽簇充满了被MAP感染的细胞的细胞质和表面。尽管广泛暴露于抗体和细胞介导的免疫中，但未进行疫苗接种的被MAP感染的宿主无法识别这些分枝杆菌肽。疫苗接种释放对氨基末端肽的免疫识别的阻滞，就像疫苗接种后其在P900的羧基末端部分进行的一样。

A0X丝氨酸磷酸化中存在重要的物种差异。通过免疫小鼠来合成MVINDDAQRLLpSQR并进行克隆选择来制备A0XP的单克隆抗体。这些抗体证明，除了在肠道血管内的免疫细胞中隐约可见磷酸化的A0XP，在正常或发炎的人肠道组织切片中看不到磷酸化的A0XP。然而，A0XP对循环中的人WBC呈强阳性。另一方面，在牛、绵羊、山羊和鹿中，A0XP在肠道细胞以及循环中的WBC中均呈强阳性。当考虑使用A0XP和适当的佐剂的合成聚合物进行针对动物MAP感染的额外免疫时，可以考虑这些新的观察结果。

在一个优选实施方式中，疫苗包含A0X肽，或者A0X肽编码于疫苗序列中并以天然氨基酸形式表达，并且A0X肽在其N末端不与半胱氨酸残基相邻。例如，A0X肽在疫苗中的肽或多肽的N末端。P900中半胱氨酸残基出现在A0X肽氨基酸序列旁被视为将P900束缚在膜上。表达没有该N末端半胱氨酸残基的A0X肽改善了该肽对免疫系统的可见性。

任选地，除A0X肽之外，疫苗还可以包含A1肽。A1肽紧密附着于MAP的外表面，其羧基末端进入其第一跨膜部分(上面突出显示)的外层。它是一种强大的抗原，是用于MAP和紧密相关的鸟分枝杆菌(M.avium)的有用标志物。为了最大的免疫原性，与A1的氨基末端相邻的P900氨基酸序列中存在的两个丙氨酸残基不包含在A1中，这使得肽免疫原始于VTT。然而，A1肽可以另外包括两个N末端丙氨酸残基。本发明人发现，A1是这样的免疫原：用截短的重组P900对小鼠和兔进行免疫，随后针对一系列合成的15聚体肽(15mer peptide)抗原进行筛选。

任选地，除A0X和/或A1肽之外，疫苗还可以包含AN肽。与P900的其他氨基末端肽不同，尽管在被MAP感染的宿主中通常少见，但AN肽序列自发识别抗体。如果使用合成的AN肽作为疫苗免疫原，则删除初始MTVT以提高免疫原性。如果使用该肽作为免疫原，则可以去除c末端Cys以防止交联，或与马来酰亚胺键一起使用于的载体分子，例如钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Haemocyanin，KLH)或牛血清白蛋白。

可以使用的多肽的具体例子包括包含以下氨基酸序列之一的多肽：

(i)MVINDDAQRLLSQRX

(ii)MVINDDAQRLLSQRX

(iii)MVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELIX

(iv)MVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELIX

(v)EVVVAQPVWAGVDAGKADHYX

(vi)EVVVAQPVWAGVDAGKADHYX

(vii)MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYX

(viii)MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYX

(ix)EVVVAQPVWAGVDAGKADHYX

(x)MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYX

其中X

多肽可以是SEQ ID NO：2的变体，该变体包含SEQ ID NO：3至10中的一个或多个，并且在SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列的区域外的SEQ ID NO：2中具有至少一个氨基酸置换、缺失或添加。

疫苗中的多肽可以进一步包含至少一种另外的MAP多肽的氨基酸序列，或其片段。疫苗可以进一步包含至少一种另外的MAP多肽的氨基酸序列或其片段、或者编码另外的MAP多肽的至少一种其他的多核苷酸或其片段。

在一个实施方式中，上述多肽可以通过“自切割(self-cleaving)”肽与另外的多肽连接。“自切割”肽是在翻译过程中介导包含该肽的多肽的切割的肽。自切割肽的一个实例是2A多肽。2A肽是18-22个氨基酸长病毒肽，其在真核细胞翻译过程中介导多肽的切割(Liu et al.2017Scientific Reports 7:2193)。2A肽可以源自在其病毒基因组中包括2A肽的任何病毒。2A肽通常包含保守序列GDVEXNPGP(SEQ ID NO：70)。2A肽的一个实例具有序列APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：71)。

至少一种另外的多肽可以是，例如，ahpC多肽、gsd多肽、p12多肽和/或mpa多肽；特别地，当与p12多肽组合使用时，例如当引入WO2007/017635(通过引用整体并入本文)中描述的HAV疫苗时，编码P900的胞外氨基末端P900肽的核酸序列的表达将促进P900系统失能。

ahpC是许多病原性分枝杆菌共有的一种分泌组分。它与MAP在巨噬细胞内生存的能力有关，并在进入微生物休眠状态时被上调。MAP ahpC基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：21和22中给出。对于在本发明中的用途，可以使用该序列或其如下所述的其变体。例如，可以如下文进一步讨论的那样对MAP ahpC基因序列进行密码子优化，以使其更适合于哺乳动物、特别是人使用。合适的经修饰的ahpC序列和编码的蛋白分别在SEQID NO：31和32中给出。

gsd是由GS致病性元件编码的具有预测的信号序列和脂质酰化位点的糖基转移酶。微阵列分析显示出它在细胞内环境中被上调。gsd在微生物细胞表面上表达，预计将GDP-岩藻糖转移至亚末端鼠李糖，并用衍生的岩藻糖将MAP上的表面糖肽磷脂覆盖，从而使处于ZN阴性状态的病原体呈惰性、疏水性和高抗性的细胞表面。MAP gsd基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：23和24中给出。对于在本发明中的用途，可以使用该序列或其如下所述的其变体。例如，可以如下文进一步讨论的那样对MAP gsd基因序列进行密码子优化，以使其更适合于哺乳动物、特别是人使用。可以进行其他修饰，例如可以去除潜在的酰化位点。一种合适的经修饰的gsd序列和编码的蛋白分别在SEQ ID NO：33和34中给出。

p12是由IS900编码的p43的羧基末端17kDa片段，其在细胞内也被上调。强烈预测在细胞表面以及MAP和p43.rec.E.coli中p12是特定蛋白水解切割和胞外域释放的底物。MAP p12基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：25和26中给出。对于在本发明中的用途，可以使用该序列或其如下所述的其变体。例如，可以如下文进一步讨论的那样对MAP p12基因序列进行密码子优化，以使其更适合于哺乳动物、特别是人使用。一种合适的经修饰的p12序列和编码的蛋白分别在SEQ ID NO：35和36中给出。

mpa也在MAP的表面上表达，并被认为是病原体所特有的。它既是乙酰酶，又是具有10个跨膜区域和大胞外肽环的预期孔分子。MAP mpa基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：29和30中给出。对于在本发明中的用途，可以使用该序列或其如下所述的其变体。例如，可以如下文进一步讨论的那样对MAP mpa基因序列进行密码子优化，以使其更适合于哺乳动物、特别是人使用。可以进行其他修饰，例如可以去除跨膜区域以降低该蛋白质的疏水性。一种合适的经修饰的mpa序列和编码的蛋白分别在SEQ ID NO：39和40中给出。

合适的ahpC多肽可以具有SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：32的氨基酸序列。合适的gsd多肽可以具有SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：34的氨基酸序列。合适的p12多肽可以具有SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：36的氨基酸序列。合适的mpa多肽可以具有SEQ ID NO：30或SEQID NO：40的氨基酸序列。合适的ahpC、gsd、p12或mpa序列可以可替代地为这些特定序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述氨基酸序列的置换、缺失或添加变体，或者可以是如本文所述的其任何的片段。

在特定实施方式中，ahpC多肽可以包含：SEQ ID NO：22的序列；其变体，该变体在SEQID NO：22的全长范围内与SEQ ID NO：22具有超过70％的氨基酸序列同一性；或SEQIDNO：22的至少8个氨基酸的片段，该片段包含表位。优选地，ahpC多肽具有SEQ ID NO：32中给出的氨基酸序列。gsd多肽可以包含：SEQ ID NO：24的序列；其变体，该变体在SEQ IDNO：24的全长范围内与SEQ ID NO：24具有超过70％的氨基酸序列同一性；或SEQ ID NO：24的至少8个氨基酸的片段，该片段包含表位。优选地，gsd多肽具有SEQ ID NO：34中给出的氨基酸序列。pl2多肽可以包含：SEQ ID NO：26的序列；其变体，该变体在SEQ ID NO：26的全长范围内与SEQ ID NO：26具有超过70％的氨基酸序列同一性；或SEQ ID NO：26的至少8个氨基酸的片段，该片段包含表位。SEQ ID NO：10的片段优选包含SEQ ID NO：44、45、46或47和/或SEQ ID NO：48。优选地，pl2多肽具有SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：44、45、46或47和/或SEQ ID NO：48中给出的氨基酸序列。mpa多肽可以包含：SEQ ID NO：30的序列；其变体，该变体在SEQ ID NO：30的全长范围内与SEQ ID NO：30具有超过70％的氨基酸序列同一性；或SEQ ID NO：30的至少8个氨基酸的片段，该片段包含表位。优选地，mpa多肽具有SEQID NO：40中给出的氨基酸序列。

将P900蛋白的胞外氨基末端肽引入包含p12多肽的MAP疫苗中起到了使P900蛋白系统的两端失能的作用。因此，在一个优选的实施方式中，疫苗包含：包含SEQ ID NO：2的至少9个连续氨基酸的多肽和包含SEQ ID NO：10的至少9个连续氨基酸的多肽；或包含SEQIDNO：2的至少9个连续氨基酸和SEQ ID NO：10的至少9个连续氨基酸的多肽；或编码所述多肽的一个或多个多核苷酸。例如，疫苗可以包含：包含SEQ ID NO：3至10中任一序列、由SEQID NO：3至10中任一序列组成或基本上由SEQ ID NO：3至10中任一序列组成的多肽和包含SEQ ID NO：44至48中任一序列、由SEQ ID NO：44至48中任一序列组成或基本上由SEQ IDNO：44至48中任一序列组成的多肽；或包含SEQ ID NO：3至10中至少一个序列和SEQ ID NO：44至48中至少一个序列的多肽；或编码所述多肽的一个或多个多核苷酸。在一个优选的实施方式中，疫苗包含：包含SEQ ID NO：3或4、由SEQ ID NO：3或4组成或基本上由SEQ ID NO：3或4组成的多肽和包含SEQ ID NO：44至47中任一序列、由SEQ ID NO：44至47中任一序列组成或基本上由SEQ ID NO：44至47中任一序列组成的多肽；或包含SEQID NO：3或4和SEQ IDNO：44至47中一个序列的多肽；或编码所述多肽的一个或多个多核苷酸。

在特定实施方式中，疫苗可以包含多肽，该多肽包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：

在特定实施方式中，疫苗可以包含多肽，该多肽包含以下氨基酸序列、由以下氨基酸序列组成或基本上由以下氨基酸序列组成：

疫苗可以是核酸疫苗，该核酸疫苗包含编码本文所述的任何一种或多种多肽的多核苷酸。疫苗可以包含多核苷酸，该多核苷酸包含两个或更多个拷贝，例如编码本文所述的肽或多肽中的一种或多种的核苷酸序列的3、4、5或更多个拷贝。

本发明提供免疫原性MAP肽。本发明提供包含序列MVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELI(SEQ ID NO：4)或(SEQ ID NO：6)的多达100个氨基酸的肽。本发明的肽可以具有26至100、30至95、35至80、40至75、45至70、50至65、55至60个氨基酸的长度。该肽可以是P900的片段。

本发明的肽可以进一步包含氨基酸序列：VTTLADGGEVTWAID或VTTLADGGEVTWAIDLNA；和/或VDAGKADHY、EVVVAQPVWAGVDAGKADHY或MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHY。本发明的肽可以包含SEQ ID NO：11至20中任一序列的氨基酸序列。SEQ ID NO：1至20中任一序列中的肽接头可以是如下所述的肽接头中的任何肽接头。

该肽可以包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列、由SEQ ID NO：4或SEQIDNO：6的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。

在一个方面，本发明提供一种多肽，该多肽包含与一个或多个另外的MAP多肽融合的来自MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列，或其片段。在一个实施方式中，另外的MAP多肽可以是包含P900的C末端胞外区域的全部或部分的片段。可选地或另外地，至少一种另外的MAP多肽可以由不同的MAP蛋白的全部或部分组成。

包含来自SEQ ID NO：2所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列的多肽可以是上述多肽中的任何多肽。在优选的实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列和/或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在一个特别优选的实施方式中，该多肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本文公开的p12多肽包含MAP P900的C末端胞外区域。因此，在一个实施方式中，另外的MAP多肽是p12多肽或其片段或变体。可以使用本文公开的p12多肽中的任何一个。例如，p12多肽的片段可以包含SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：44至47中任一序列所示的氨基酸序列、由SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：44至47中任一序列所示的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO：48和/或SEQ ID NO：44至47中任一序列所示的氨基酸序列组成。

另外的MAP多肽可以是ahpC多肽、gsd多肽、p12多肽和/或mpa多肽。在一个实施方式中，该多肽包含氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR和ahpC多肽、gsd多肽、p12多肽和mpa多肽中的任何一种或任何组合。在一些实施方式中，多肽可以在MVINDDAQRLLSQR氨基酸序列的丝氨酸残基处被磷酸化。

ahpC多肽可以是本文所述的任何ahpC多肽。Gsd多肽可以是本文所述的任何gsd多肽。mpa多肽可以是本文所述的任何MPA多肽。

在一个优选的实施方式中，在单个融合蛋白中，N末端P900多肽具有四种多肽ahpC、gsd、p12和mpa中的任何一种或多种。这种融合蛋白中的四个多肽序列可以是本文所述的任何多肽或变体。可以以任何顺序在融合蛋白中提供该四种多肽。在一个实施方式中，它们以N末端P900-ahpC-gsd-p12-mpa的顺序提供。

在一个实施方式中，融合蛋白中存在的ahpC、gsd、p12和mpa多肽是SEQ ID NO：32、34、36和40中给出的那些多肽。

在一个替代实施方式中，多肽可以存在于可以通过或不可以通过非共价键连接的两个或更多个单独的多肽分子中。例如，多肽可以分开提供，或者可以在两个、三个或更多个分开的融合蛋白多肽分子中提供。例如，N末端P900多肽可以作为一个分子提供，而ahpC、gsd、p12和mpa可以作为融合蛋白提供。

在融合蛋白中，接头序列可以使所需的多肽序列分离和/或在肽的N末端或C末端可以存在或可以不存在另外的序列。通常，融合蛋白包含1、2、3或更多个这种接头。接头的长度通常为1、2、3、4或更多个氨基酸。因此，在多肽序列中的1个、2个、3个或所有肽中，例如可以通过这种接头彼此邻接或可以通过这种接头彼此分开。

该肽和多肽可以用作在对象中诱导针对MAP的免疫应答。

在一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列，其中包含来自SEQ IDNO：2中所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列(优选氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR)的肽，插入在第7位和第8位、第199位和第200位、第442位和第443位、第577位和第578位，和/或第820位和第821位之间。

在另一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列，其中包含来自SEQID NO：2中所示的MAP P900区域的至少9个连续氨基酸的氨基酸序列(优选氨基酸序列MVINDDAQRLLSQR)的肽插入在第7位和第8位、第199位和第200位、第442位和第443位、第582位和第583位，和/或第825位和第826位之间。

在SEQ ID NO：41或42中，MQIFVKL前导序列可以被任何其他合适的前导序列取代。类似地，可以用任何其他标签取代PALRIPNPLLGLD标签。可以将来自SEQ ID NO：2的至少9个连续氨基酸直接插入到SEQ ID No：41或42的一个或多个指定位置，或者可以在被插入序列的一个或两个末端包括肽接头。

本文使用的“多肽”的最广泛的意义是指具有两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其他拟肽的化合物。术语“多肽”与术语“肽”同义使用。因此，术语“多肽”包括短肽序列以及较长的多肽和蛋白质。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然氨基酸和/或非天然氨基酸或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。

多肽的变体可以包含序列表中给出的序列的1、2、3、4、5、多达10个、多达20个、多达30个或更多个氨基酸置换和/或缺失。“缺失”变体可以包括单个氨基酸的缺失、一小部分氨基酸(例如2、3、4或5个氨基酸)的缺失，或较大氨基酸区域的缺失，例如特定氨基酸结构域或其他特征的缺失。“置换”变体优选涉及用相同数目的氨基酸取代一个或多个氨基酸并进行保守的氨基酸替代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的替代氨基酸置换，例如，被另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸置换。可用来选择合适的取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：

优选的“变体”包括其中出现在序列中代替其天然存在的氨基酸的氨基酸是其结构类似物的那些。假如肽的功能不会受到显著不利的影响，序列中使用的氨基酸也可以被衍生化或被修饰，例如，被标记。

如上所述的变体可以在肽的合成过程中或通过生产后修饰来制备，或者当肽为重组形式时，使用定点诱变、随机诱变或酶促切割和/或核酸连接的已知技术来制备。

合适的变体可以包含除MAP以外的来自分枝杆菌的天然存在的多肽的序列。例如，变体ahpC多肽序列可以衍生自与MAP不同的分枝杆菌菌株。这种天然存在的变体优选地维持刺激免疫应答的能力，该免疫应答能够抵抗MAP。也就是说，对变体多肽的免疫应答将反抗MAP多肽以及所使用的变体多肽。

优选地，根据本发明的变体具有与例如SEQ ID No：2、22、32、24、34、26、36、30或40具有超过60％，或超过70％，例如75％或80％，优选超过85％，例如超过90％或95％的氨基酸同一性(根据下文所述的测试)的氨基酸序列。可以基于序列的全长或序列的部分查看氨基酸同一性水平，例如20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸，这取决于全长多肽的大小。

关于氨基酸序列，“序列同一性”是指当使用ClustalW(上述Thompson et al.,1994)用以下参数进行评估时具有所述值的序列：

配对比对参数-方法：准确，矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，空位延伸罚分：0.10；

多重比对参数-矩阵：PAM，空位开放罚分：10.00，延迟同一性％：30，惩罚末端空位：打开，空位间隔距离：0，负矩阵：否，空位延伸罚分：0.20，残基特异性空位罚分：打开，亲水空位罚分：打开，亲水残基：G、P、S、N、D、Q、E、K、R。在特定残基处的序列同一性旨在包括被简单衍生化的相同残基。

可以对SEQ ID NO：2、22、32、24、34、26、36、30或40中给出的任何野生型MAP蛋白序列进行特定修饰。例如，可以进行修饰以尝试改善变体蛋白作为免疫原的整体性质。

在一个实施方式中，可以通过缺失或置换以去除酰化位点来修饰野生型蛋白。这种酰化位点可能影响蛋白的整体构象。通过省去酰化位点，例如通过排除或置换半胱氨酸残基，可以优化蛋白内有效表位的呈现。例如，SEQ ID NO：24中给出的野生型MAP gsd序列在第22位包含半胱氨酸残基。在SEQ ID NO：34的变体中，氨基酸序列已通过在N末端截短而被修饰，使得该半胱氨酸残基不再存在。类似地，SEQ ID NO：22中所示的P900的N末端片段在第25位包含半胱氨酸残基。优选使该半胱氨酸缺失，或用一个或多个氨基酸例如用肽接头置换该半胱氨酸。可以对野生型蛋白或本文所述的任何变体或片段序列(例如密码子优化序列)进行这种修饰。

在另一个实施方式中，可以对野生型MAP蛋白进行修饰以使潜在的交叉反应表位失能或将其去除。例如，在旨在将本发明的多肽用于人的情况下，可以对该多肽序列进行修饰以使潜在的交叉反应的人表位失能或将其去除，例如在人患者中产生可以与人蛋白质中的类似序列交叉反应的抗体的序列。因此可以对MAP序列进行修饰以避免这种交叉反应，但是保持产生抗MAP免疫应答的能力。

例如，在野生型MAP gsd序列内，第239位和第241位的赖氨酸残基(参见SEQ IDNO：24)可以各自被天冬酰胺置换。可以在本文所述的任何变体或片段gsd序列中进行等效置换。例如，在SEQ ID NO：34的变体序列中，第216位和第218位的赖氨酸残基可以被天冬酰胺取代。这可以通过对编码gsd多肽的核酸序列进行修饰来实现。例如，在SEQ ID NO：33的gsd多核苷酸序列中，可以用AAT取代第646至648位，以及第651至654位的AAG密码子。这维持了SEQ ID NO：33的优化的人密码子使用，并进一步去除了潜在的交叉反应人表位。

类似地，可以对MAP ahpC序列进行修饰。在SEQ ID NO：22的野生型ahpC序列中，第29位的赖氨酸可以被苏氨酸取代，第31位的脯氨酸可以被亮氨酸取代。可以在本文所述的任何变体或片段ahpC序列中进行等效置换。例如，在SEQ ID NO：32的经修饰的变体序列中，可以在第28位赖氨酸和第30位脯氨酸进行相同的置换。这可以通过对编码ahpC多肽的核酸序列进行修饰来实现。例如，在SEQ ID NO：31的ahpC多核苷酸序列中，第82至84位的AAA密码子可以被ACA取代，第88至90位的CCC密码子可以被CTC取代。这维持了SEQ ID NO：31的优化的人密码子使用，并进一步去除了潜在的交叉反应人表位。

类似地，可以进行修饰以减少蛋白的疏水性，从而帮助优化表位的表面递呈。例如，SEQID NO：30的野生型mpa序列包括十个跨膜区域。为了降低蛋白的疏水性，可以省略或置换这些区域中的一个或多个区域或这些区域的一部分。例如，可以使跨膜区域中的一个、多个或所有跨膜区域缺失。可以使这种区域全部或部分缺失，任选地不留下蛋白的跨膜序列的末端的氨基酸残基，留下蛋白的跨膜序列的末端的一个、两个或更多个氨基酸残基。因此，一种修饰可以是一种或多种疏水氨基酸的缺失或置换。这样的一个例子见于MAP mpa的变体SEQ ID NO：40，其中已使跨膜序列的大部分缺失，仅在变体多肽的跨膜区域中留下一个或两个氨基酸。另一个例子是SEQ ID NO：22的四个N末端氨基酸残基MTVT的缺失。

多肽“片段”可以通过截短来制备，例如通过从多肽的N和/或C末端除去一个或多个氨基酸来制备。以这种方式，可以从N和/或C末端除去多达10、多达20、多达30、多达40或更多个氨基酸。片段也可以通过一个或多个内部缺失产生。例如，在不存在非表位氨基酸的情况下，本发明的变体可以由来自该区域的全长多肽的两个或更多个表位区域组成或包含来自该区域的全长多肽的两个或更多个表位区域。优选地，N末端P900的片段，ahpC、gsd、p12或mpa多肽包含至少一个能够诱导针对未修饰的MAP多肽的免疫应答的表位。这种片段可以衍生自SEQ ID NO：2、22、32、24、34、26、36、30或40的序列，或者可以衍生自本文所述的变体肽。优选地，这种片段的长度为8至150个残基，例如8至50个或8至30个残基。或者，本发明的片段可以是较长的序列，例如包含全长多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

优选地，变体是其功能变体。特别地，变体多肽应保留刺激针对未修饰的MAP多肽的免疫应答的能力。在一个实施方式中，功能性变体多肽应该能够充当抗原并且应该包括来自原始多肽的至少一个功能性表位。

“抗原”是指可在个体中引起免疫应答的任何试剂，通常是大分子。如本文所用，“抗原”通常用于指包含一个或多个表位的多肽分子或其部分。此外，出于本发明的目的，“抗原”包括对天然序列具有修饰，例如缺失、添加和置换(本质上通常是保守的)的多肽，只要该多肽维持足够的免疫原性即可。这些修饰可以是经过仔细考虑的，例如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。

针对目标抗原的“免疫应答”是在个体中对该抗原的体液免疫应答和/或细胞免疫应答的发展。“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。

如本文所用，术语“表位”通常是指靶抗原上被免疫受体例如T细胞受体和/或抗体识别的位点。优选地，表位是衍生自蛋白质或作为蛋白质的一部分的短肽。然而，该术语也意图包括具有糖肽和碳水化合物表位的肽。单个抗原分子可以包含若干个不同的表位。术语“表位”还包括刺激识别整个生物体的应答的氨基酸或碳水化合物的经修饰的序列。

如果所选择的表位对MAP具有特异性，或与MAP的致病性有关，则是有利的。例如，如果识别表位的免疫受体和/或抗体将仅识别来自MAP的该表位，而不识别其他不相关蛋白质(特别是来自不相关生物体的蛋白质或宿主蛋白质)的该表位，则是有利的。如果表位与MAP的致病性有关，则针对这种表位的免疫反应可以用于靶向致病性MAP感染。

表位也可能与其他分枝杆菌上的等效表位有关。例如，许多患有被MAP感染的个体也被作为次生共病原(secondary co-pathogen)的鸟分枝杆菌感染。其他鸟分枝杆菌复合体可以出现在或参与克罗恩病、约内氏病、溃疡性结肠炎、银屑病、甲状腺炎、结节病、帕金森病、多发性硬化症、1型糖尿病、关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、肠易激综合征、炎性肠病、慢性肠炎、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、特发性肺纤维化、麻风病和/或慢性疲劳综合征。MAP中表达的许多蛋白质(例如AhpC)与鸟分枝杆菌中表达的蛋白质非常相似。如果除MAP外，本发明的多肽还包含能够刺激对抗鸟分枝杆菌的免疫应答的一个或多个表位，则可以实现进一步的次要治疗效果。

表位可以由肽或多肽的氨基酸和相应的DNA序列的知识、以及由特定的氨基酸的性质(例如大小、电荷等)和密码子词典来鉴定，而无需过多实验。例如参见Ivan Roitt,EssentialImmunology,1988；Janis Kuby,Immunology,1992 e.g.,pp.79-81。确定蛋白质或目标表位是否会刺激应答的一些准则包括：肽长度-肽的长度应至少为8个或9个氨基酸以适合MHCI类复合体，长度应至少为8-25个氨基酸，例如至少13-25个氨基酸以适合II类MHC复合物。这些长度是肽结合各个MHC复合物的最小值。肽优选长于这些长度，因为细胞可能切割肽。肽应包含合适的锚定基序，该锚定基序使该肽能够以足够高的特异性与各种I类或II类分子结合，以产生免疫应答。这可以通过比对目标蛋白的序列和与MHC分子相关的肽的公开结构，在不进行过多实验的情况下完成。因此，本领域技术人员可通过将蛋白质序列与蛋白质数据库中列出的序列进行比对来确定目标表位。

因此，可以通过常规使用的方法来识别合适的表位，例如图3和图4中所示的用于识别mpa的第5个胞外环中的强T细胞表位GFAEINPIA(肽9.1)的那些方法。在这种方法中，可以产生短肽文库，该短肽文库是目标多肽序列的片段，并且分别评估这些肽中的每一个识别对全长多肽的免疫应答的能力。可以按组或池对文库成员进行筛选，或者可以对文库的单个成员(例如单个池中的单个成员)进行单独评估。

在另一个实例中，对SEQ ID NO：32、34、36和40的单个蛋白质的表位扫描揭露出许多预测的I类和II类表位。

在SEQ ID NO：32的ahpC变体序列中，在第48至56、90至101和161至169位氨基酸处识别出预测的强II类表位。本发明的ahpC多肽，例如ahpC变体或片段多肽，优选包含这些表位中的至少一个表位，例如一个、两个或全部三个表位。

在SEQ ID NO：34的gsd变体序列中，在第1至32、58至68、99至119、123至147、159至169、180至194和200至231位氨基酸处识别出预测的I类表位，并且在第64至76、95至110、192至206和223至240位氨基酸处识别出预测的强II类表位。本发明的gsd多肽，例如gsd变体或片段多肽，优选包含这些表位中的至少一个表位，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或全部表位。

在SEQ ID NO：36的p12变体序列中，在第33至56和98至117位氨基酸处识别出预测的I类表位，并且在第3至10位氨基酸处识别出预测的强II类表位。本发明的p12多肽，例如p12变体或片段多肽，优选包含这些表位中的至少一个表位，例如一个、两个或全部三个表位。

在SEQ ID NO：40的mpa变体序列中，在第130至160位氨基酸处识别出预测的I类表位，并且在第56至64位和第150至160位氨基酸处识别出预测的强II类表位。本发明的mpa多肽，例如mpa变体或片段多肽，优选包含这些表位中的至少一个表位，例如一个、两个或全部三个表位。

如实施例中所示，已经在mpa多肽序列中识别出特定的强T细胞表位。该表位具有氨基酸序列GFEAINPIA，并且位于SEQ ID NO：30的第357至365位氨基酸处和SEQ ID NO：40的第177至185位氨基酸处。在SEQ ID NO：42的构建体中的第761至769位氨基酸处发现了该序列。优选的mpa多肽序列是包含GFEAINPIA的序列。这种序列还可以包含上述预测的I类和II类表位中的一个、两个或全部三个表位。

据信该表位位于mpa的第五胞外环中(图5A)。因此，优选的mpa多肽可以维持第五胞外环的序列。因此，mpa多肽可以包含氨基酸序列GFAEINPIA以及来自mpa第五胞外环的相邻的氨基酸。优选地，该第五胞外环将以合适的形式和构象存在于本发明的多肽中，以使其被免疫系统识别。

本发明的或用于本发明的肽或多肽可以包含其他另外的序列，例如由下述多核苷酸和载体编码的那些序列。例如，它可以包含另外的表位、治疗性多肽、佐剂或免疫调节分子。

多肽可以包含前导序列，即在多肽的氨基末端处或附近的序列，该前导序列在靶向或调节多肽方面起作用。例如，多肽中可以包含将其靶向于体内特定组织的序列，或在表达时帮助多肽进行加工或折叠的序列。各种这样的序列是本领域众所周知的，并且可以由阅读本文的技术人员根据例如所需的多肽的性质和生产方法来选择。

多肽可以进一步包含标签或标记，以识别或筛选多肽或多肽的表达。合适的标记包括放射性同位素(例如

SEQ ID NO：40或41中给出的序列包含：SEQ ID NO：32、34、36或37和40的四个经修饰的多肽；以及其他序列，例如泛素前导序列和pK标签。

如本文所定义，本发明的肽可以被化学修饰，例如，翻译后修饰。例如，它们可以是糖基化的或包含经修饰的氨基酸残基。它们可以是多种形式的多肽衍生物，包括酰胺以及与多肽的缀合物。

化学修饰的肽还包括那些具有通过官能侧基反应进行化学衍生的一个或多个残基的肽。这种衍生的侧基包括那些已经衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基基、叔丁氧羰基、氯乙酰基和甲酰基的侧基。可以使游离羧基衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。可以使游离羟基衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。可以使组氨酸的咪唑氮衍生形成N-im-苄基组氨酸。肽也可以通过磷酸化(例如3氨基磷酸化)和通过糖基化(例如甘露糖基化)来修饰。

化学修饰的肽还包括那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，可以用4-羟基脯氨酸置换脯氨酸，或者可以用高丝氨酸置换丝氨酸。

本发明的肽或本发明的疫苗中的一种或多种多肽可以在N末端和/或在C末端处进行修饰和/或可以与载体分子缀合或偶联。例如，肽/多肽可以与细菌糖类或载体蛋白(比如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或卵清蛋白(OVA))缀合。肽可以在N末端或C末端处生物素化、可以在N末端或C末端处酰胺化和/或可以具有添加在N末端或C末端的肽标签。例如，肽标签可以是：聚赖氨酸，比如支链聚赖氨酸八聚体(branchedpolylysine octamer)；或细胞穿透肽，比如寡聚精氨酸(例如聚精氨酸八聚体或九聚体(nonomer))。优选地，肽在N末端生物素化，并且在C末端具有酰胺基或支链聚赖氨酸八聚体。任选地除了其他末端修饰之外，可以在N末端和/或C末端添加一个或多个另外的氨基酸残基。例如，可以在N末端添加一个或多个(比如两个)丙氨酸残基以增加免疫原性和特异性和/或可以在N末端或优选C末端添加带电的残基(例如GKK)以降低疏水性。当在一个末端添加残基(比如GKK)时，可以在另一个末端添加镜像残基(比如KKG)。

本发明的肽和多肽可以包含通过一个或多个肽接头连接在一起的MAP多肽的两个或更多个，例如3、4、5、6或更多个片段。肽接头可以是例如任何合适的多表位疫苗接头。接头的长度可以是例如1至15个氨基酸，例如长度为2至10、3至6或4至5个氨基酸。合适的接头的具体例子包括：GGG、GG、SGSG、AG、GGGS、AAY、二赖氨酸接头(KK)EAAAK、AAY和HEYGAEALERAG。

本发明还涉及包含编码本发明的肽或多肽的核酸序列的多核苷酸构建体。例如，可以提供编码上述任何肽或多肽(例如融合蛋白)的单个核酸分子。本发明的疫苗可以包含本文所述的多核苷酸中的任何一种或多种多核苷酸。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式：脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括：基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以分离或纯化的形式提供。

“编码”所选多肽的核酸序列是当置于适当调节序列的控制下时在体内被转录(对于DNA而言)和翻译(对于mRNA而言)成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。为了本发明的目的，这种核酸序列可包括但不限于：来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列、以及甚至是合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3’末端。

因此，在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包含：含有SEQ ID NO：21、31、23、33、25、35、29、39、41、62、63、64、65、67、68和69所示序列中的任一序列的所有或部分序列的核酸序列。多核苷酸中的核酸序列可以可替代地为这些特定序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述核酸序列的置换、缺失或添加变体。四种基因中的一种的变体可以包含序列表中给出的序列的1、2、3、4、5、多达10个、多达20个、多达30个、多达40个、多达50个、多达75个或更多个核酸置换和/或缺失。

合适的变体可以与SEQ ID NO：1、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、62、63、64、65、67、68和69所示的MAP多核苷酸之一至少70％同源，优选与其至少80％或90％同源，以及更优选至少95％、97％或99％同源。测量同源性的方法是本领域众所周知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，同源性是基于核酸同一性来计算的。这种同源性可以存在于至少15个，优选至少30个，例如至少40、60、100、200或更多个连续核苷酸的区域上。这种同源性可以存在于未修饰的MAP多核苷酸序列的整个长度上。

测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG包提供BESTFIT程序，该程序可用于计算同源性(例如，在其默认设置下使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12,p387-395)。

PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol215:403-10中所述。

用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))公开获得。这种算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高评分序列对(High scoring sequence pair，HSP)，该短字在与数据库序列中的相同长度的字比对时匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域字得分阈值(如上所述，Altschul et al)。这种初始邻域字命中作为种子启动搜索，以查找包含它们的HSP。只要可增加累积比对得分，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的延伸：由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积比对评分为零或低于零；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用字长(W)11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff andHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)比对(B)50，期望(E)10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。

BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见，例如Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，在第一序列与第二序列的比较中，如果最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。

同源物通常以明显高于背景的水平与相关多核苷酸杂交。由同源物和多核苷酸之间的相互作用产生的信号水平通常是“背景杂交”强度的至少10倍，优选至少100倍。例如，可以通过对探针进行放射性标记(例如通过

严格的杂交条件可包括50％甲酰胺、5x Denhardt溶液、5x SSC、0.1％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA，洗涤条件可包括37℃下，2x SSC、0.1％SDS，随后68℃下，1x SSC、0.1％SDS。定义合适的杂交条件在本领域技术范围内。参见例如，如上所述的Sambrook etal.。

同源物可以与相关多核苷酸中的序列相差少于3、5、10、15、20或更多个突变(其中的每个突变可以是置换、缺失或插入)。可以在同源物的至少30个，例如至少40、60或100或更多个连续核苷酸的区域上测量这些突变。

在一个实施方式中，由于遗传密码的冗余性，变体序列可以与序列表中给出的特定序列不同。DNA密码具有4个主要的核酸残基(A、T、C和G)，并使用它们来“拼写”代表了生物体基因中编码的蛋白质的氨基酸的三字母密码子。沿着DNA分子的密码子的线性序列被翻译成由那些基因编码的蛋白质中氨基酸的线性序列。该密码是高度简并的，有61个密码子编码20个天然氨基酸，而3个密码子代表“终止”信号。因此，大多数氨基酸由多于一个的密码子编码-实际上，有几种氨基酸由四个或更多个不同的密码子编码。因此，本发明的变体多核苷酸可以编码与本发明的另一多核苷酸相同的多肽序列，但是由于使用不同的密码子来编码相同的氨基酸，因此可以具有不同的核酸序列。

在一个实施方式中，可以优化多核苷酸构建体的编码序列以更类似于哺乳动物细胞中高表达基因的密码子使用。在有不止一个密码子可用于编码给定氨基酸的情况下，已经观察到生物体的密码子使用模式是高度非随机的。不同物种在其密码子选择上显示出不同的偏向，此外，在单个物种，高水平表达和低水平表达的基因之间，密码子的使用可能显著不同。这种偏向在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中是不同的，并且一些物种比其他物种表现出更强的偏离随机密码子选择。

例如，与某些细菌或病毒相比，人和其他哺乳动物的强偏向性较小。由于这些原因，例如在哺乳动物细胞中表达的分枝杆菌基因可能将具有不合适用于有效表达的密码子分布。据信，在异源DNA序列中存在密码子簇，该密码子簇在发生表达的宿主中很少观察到，预示了该宿主中低异源表达水平。

因此，在本发明的多核苷酸中，可以将密码子使用模式改变为不同于在MAP中自然发现的模式，以更紧密地表示靶生物体例如哺乳动物，特别是人的密码子偏向。“密码子使用系数”是给定多核苷酸序列的密码子模式与靶物种的密码子模式有多相似的量度。密码子频率可从许多物种的高表达基因的文献资源中获得(参见例如Nakamura et.al.NucleicAcids Research 1996,24:214-215)。对于20种天然氨基酸中的每一种氨基酸，将61个密码子中的每一个密码子的密码子频率(表示为所选基因类别的每1000个密码子的出现次数)标准化，因此每种氨基酸的最常用密码子的值设置为1，不常见密码子的频率按比例缩放在0和1之间。因此，对于靶物种的高表达基因，将61个密码子中的每个密码子指定为1或更低的值。为了计算特定多核苷酸的密码子使用系数，相对于该物种的高表达基因，记录了特定多核苷酸的每个密码子的换算值，并取所有这些值的几何平均值(将这些值的自然对数之和除以密码子总数，然后取反对数)。该系数将具有介于0和1之间的值，并且系数越高，多核苷酸中“经常使用的密码子”就越多。如果多核苷酸序列的密码子使用系数为1，则所有密码子都是靶物种的高表达基因的“最常用”密码子。

根据本发明，本发明的多核苷酸的密码子使用模式将优选地排除靶生物体的高表达基因中相对同义密码子使用度(Relative synonymous codon usage，RSCU)值小于0.2的密码子。RSCU值是观察到的密码子数目除以如果该氨基酸的所有密码子均被频繁使用的预期数目。对于高表达人基因，本发明的多核苷酸通常将具有大于0.3，优选大于0.4，最优选大于0.5的密码子使用系数。人密码子使用表也可在基因库(GenBank)中找到。

因此可以看出，可以基于要处理的物种来改变编码本发明多肽的特定多核苷酸序列，以优化密码子。例如，SEQ ID NO：21、23、25和29中给出的MAP序列已进行密码子优化，以供人在SEQ ID NO：31、33和35的多核苷酸中使用。这种修饰可以提高这种多核苷酸在人细胞中表达其编码蛋白的能力。

如以上关于多肽所解释的，也可以对本发明的多核苷酸进行修饰以使所编码的多肽中的潜在交叉反应表位失能或将其去除。

根据本发明的多核苷酸“片段”可以通过截短来制备，例如通过从多核苷酸的一个或两个末端除去一个或多个核苷酸来制备。可以以此方式从多核苷酸的3’末端和/或5’末端除去多达10、多达20、多达30、多达40、多达50、多达75、多达100、多达200或更多个氨基酸。片段也可以通过一个或多个内部缺失产生。例如，在不存在非表位氨基酸的情况下，本发明的变体可以编码这这样的多肽：由来自本发明的全长多肽的两个或更多个表位区域组成或包含来自本发明的全长多肽的两个或更多个表位区域。优选地，ahpC、gsd、p12或mpa多肽序列的片段包含至少一个编码能够诱导针对未修饰的MAP多肽的免疫应答的表位的区域。这种片段可以衍生自SEQ ID NO：21、31、23、33、25、35、29或39的序列，或者可以衍生自本文所述的变体多肽。优选地，这种片段的长度为24至500个残基，例如24至400、24至300、24至100、100至200或200至400个残基。或者，本发明的片段可以是更长的序列，例如包含本发明的全长多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

因此，本发明的肽可以由编码并能够表达该肽的多核苷酸产生或以编码并能够表达该肽的多核苷酸的形式递送。本发明的多核苷酸可以根据本领域熟知的方法合成，例如Sambrook et al(1989，Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring HarborPress(分子克隆-实验室手册；冷泉港出版社))中所述。可使用标准分子生物学工具获来得基本上纯的抗原制剂。也就是说，编码上述部分的多核苷酸序列可使用重组方法来获得，例如通过从表达抗原的细胞中筛选cDNA和基因组文库，或者通过从已知包括包括多肽的编码序列的载体中获得该多肽的编码序列。此外，可使用标准技术，例如酚提取和cDNA或基因组DNA的PCR，直接从含有所需序列的细胞和组织中分离出所需序列。参见，例如，如上所述的Sambrook et al.对用于获得和分离DNA的技术的描述。多核苷酸序列也可合成产生，而不是克隆。

分离特定核酸分子的另一种方便的方法是通过聚合酶链反应(PCR)。Mullis etal.(1987)Methods Enzymol.155:335-350。该技术使用DNA聚合酶(通常是热稳定DNA聚合酶)来复制所需的DNA区域。通过与所需DNA的相反端和相反链互补的特定序列的寡核苷酸来识别要复制的DNA区域，以引发复制反应。第一轮复制的产物本身就是后续复制的模板，因此重复的连续复制循环导致由使用的引物对限定的DNA片段的几何扩增。

一旦获得序列，就可以使用标准克隆或分子生物学技术将它们连接在一起以提供核酸分子。或者，该序列可以合成产生，而不是克隆。可以针对所需的特定氨基酸序列来设计具有适当密码子的核苷酸序列。如本文所解释的，通常会为将在其中表达该序列的预期宿主选择优选的密码子。然后可以由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸来组装完整序列，并组装成完整的编码序列。

本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，该表达盒包括可操作地连接至插入序列的控制序列，从而允许本发明的多肽在靶对象物种体内表达。这些表达盒又通常在适合用作核酸免疫试剂的载体(例如，质粒或重组病毒载体)内提供。这种表达盒可以直接给药至宿主对象。或者，可以将包含本发明的多核苷酸的载体给药至宿主对象。优选地，使用遗传载体来制备和/或给药多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够数量的遗传信息并允许表达本发明的多肽的任何载体。

因此，本发明包括包含这种多核苷酸序列的表达载体。这种表达载体在分子生物学领域中常规构建，并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的引发剂、启动子、增强子和其他元件，例如聚腺苷酸化信号，聚腺苷酸化信号可能是必需的并且位于正确的方向，以允许本发明的肽的表达。其他合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的。在这方面作为进一步的例子，我们参考Sambrook et al.。

因此，可以通过将这种载体递送至细胞并允许从载体发生转录来提供本发明的多肽。优选地，本发明的多核苷酸或用于载体的本发明的多核苷酸与控制序列可操作地连接，该控制序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达，即该载体是表达载体。

“可操作地连接”是指元件的排布，其中本文描述的组件配置成执行它们的常用功能。因此，当存在合适的酶时，与核酸序列可操作地连接的给定调节序列(例如启动子)能够影响该序列的表达。启动子不需要与序列邻接，只要它起到指导该序列的表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可以存在干扰的未翻译但转录的序列，并且启动子序列仍然可以被视为与编码序列“可操作地连接”。

在本领域中已经描述了许多表达系统，其中的每个表达系统通常由载体组成，该载体包含与表达控制序列可操作地连接的目标基因或核苷酸序列。这些控制序列包括转录启动子序列以及转录起始和终止序列。本发明的载体可以是例如具有复制起点的质粒、病毒或噬菌体载体，任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选的启动子调节子。“质粒”是染色体外遗传元件形式的载体。载体可以包含一个或多个可选择性标记基因，例如在细菌质粒的情况下为氨苄青霉素抗性基因或对于真菌载体是抗性基因。载体可以在体外使用，例如用于产生DNA或RNA，或用于转染或转化宿主细胞，例如哺乳动物细胞宿主细胞。载体也可以适于在体内使用，例如允许在体内表达多肽。

“启动子”是启动并调节编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)、阻抑型启动子(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达受到分析物、辅助因子、调节蛋白等抑制)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”旨在包括全长启动子区域和这些区域的功能性(例如，控制转录或翻译)区段。

可以选择启动子和其他表达调节信号以与针对其进行了表达设计的宿主细胞相容。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH启动子、裂殖酵母(S.pombe)nmt1和adh启动子。可以使用哺乳动物启动子，例如β-肌动蛋白启动子。组织特异性启动子是特别优选的。哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，其可响应于重金属(例如镉)而被诱导。

在一个实施方式中，病毒启动子用于从多核苷酸驱动表达。用于哺乳动物细胞表达的典型病毒启动子包括：SV40大T抗原启动子、腺病毒启动子、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复序列(Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat，MMLV LTR)、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子、SV40早期启动子、人巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)IE启动子、腺病毒(包括腺病毒主要晚期启动子(Adenovirus major late promoter，Ad MLP))、HSV启动子(例如HSV IE启动子)或HPV启动子(特别是HPV上游调节区(Upstream regulatory region，URR))。所有这些启动子都是本领域容易获得的。

在一个实施方式中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。优选的启动子元件是不含内含子A但包括外显子1的CMV立即早期(Immediate early，IE)启动子。因此，从多核苷酸开始表达可以在hCMV IE早期启动子的控制下。使用hCMV立即早期启动子的表达载体包括例如，pWRG7128、和pBC12/CMV和pJW4303。可以使用已知方法获得hCMV立即早期启动子序列。可以使用标准技术直接从病毒样本中分离天然hCMV立即早期启动子。例如，US 5385839描述了hCMV启动子区域的克隆。hCMV立即早期启动子的序列可从基因库#M60321(hCMVTowne株)和X17403(hCMV Ad169株)获得。因此，可基于已知序列使用PCR引物通过PCR来分离天然序列。参见，例如，如上所述的Sambrook et al.对用于获得和分离DNA的技术的描述。合适的hCMV启动子序列也可从现有质粒载体中分离。启动子序列也可合成产生。

本发明的多核苷酸、表达盒或载体可以包含非翻译前导序列。通常，非翻译前导序列的长度为约10至约200个核苷酸，例如约15至150个核苷酸，优选为15至约130个核苷酸。可以使用包含例如15、50、75或100个核苷酸的前导序列。通常，功能性非翻译前导序列是能够提供用于表达与前导序列可操作地连接的编码序列的翻译起始位点。

通常，转录终止和聚腺苷酸化序列也会存在，位于翻译终止密码子的3’末端。优选地，还存在用于优化启动翻译的序列，其位于编码序列的5'末端。转录终止子/聚腺苷酸化信号的实例包括如上文Sambrook et al.所述的源自SV40的信号，以及牛生长激素终止子序列。含有剪接供体和受体位点的内含子也可以设计到表达盒或载体中。

表达系统通常包括称为“增强子”的转录调节元件。增强子被广义地定义为顺式作用剂，当它与启动子/基因序列可操作地连接时，它将增加该基因序列的转录。增强子可在比其他表达控制元件(例如启动子)更远离目标序列的位置上起作用，并且当以相对于目标序列的任一方向定位时可以起作用。已经从许多病毒来源中识别出增强子，包括多瘤病毒、BK病毒、巨细胞病毒(CMV)、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)、莫洛尼肉瘤病毒、牛乳头瘤病毒和劳斯氏肉瘤病毒。合适的增强子的实例包括SV40早期基因增强子、衍生自劳斯氏肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子，以及衍生自人或鼠CMV的元件，例如，CMV内含子A序列中包含的元件。

根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体可以另外包含信号肽序列。通常将信号肽序列以与启动子可操作地连接的方式插入，使得信号肽被表达并促进由编码序列(也与启动子可操作地连接)编码的多肽的分泌。

通常，信号肽序列编码10至30个氨基酸(例如15至20个)氨基酸的肽。氨基酸通常主要是疏水的。在典型情况下，信号肽使得承载该信号肽的生长中的多肽链靶向至表达细胞的内质网。信号肽在内质网中被切割，从而允许通过高尔基体分泌多肽。

用于编码已知展示抗病毒或抗菌活性的多肽、免疫调节分子例如细胞因子(例如TNF-α、干扰素(例如IL-6和IL-2干扰素)、集落刺激因子(例如GM-CSF))、佐剂和共刺激分子和辅助分子(B7-1、B7-2)的核酸可以包括在本发明的多核苷酸、表达盒或载体中。或者，这种多肽可以例如在包含本发明的分子的制剂中分开提供，或者可以与本发明的组合物同时、依次或分开给药。在体内位点同时提供免疫调节分子和本发明的多肽可以增强特异性效应子的产生，特异性效应子可以帮助增强免疫应答。免疫应答的增强程度可能取决于所使用的特定免疫刺激分子和/或佐剂，因为不同的免疫刺激分子可能会引发增强和/或调节免疫应答的不同机制。例如，不同的效应子机制/免疫调节分子包括但不限于：辅助信号(IL-2)的增强、专职性APC(GM-CSF)的募集、T细胞频率(IL-2)的增加、对抗原加工途径和MHC表达(IFN-γ和TNF-α)的效应以及免疫反应从Th1应答转向Th2应答的转移。含有未甲基化的CpG的寡核苷酸也是Th1应答的优先诱导剂，并且适用于本发明。

在一些实施方式中，多核苷酸、表达盒或载体将编码佐剂，或者将提供佐剂。如本文所用，术语“佐剂”是指能够特异性地或非特异性地改变、提高、引导、重定向、增强或启动抗原特异性免疫应答的任何材料或组合物。

合适的佐剂可以是ADP-核糖基化细菌毒素。这些ADP-核糖基化细菌毒素包括：白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)、百日咳毒素(Pertussis toxin PT)、霍乱毒素(Choleratoxin，CT)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT1和LT2)、假单胞菌内毒素A、假单胞菌外毒素S、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)胞外酶、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)毒素、肉毒梭状芽孢杆菌(C.botulinum)C2和C3毒素、泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶，以及来自产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringens)、螺旋形梭状芽孢杆菌(C.spiriforma)和艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)的毒素和金黄色葡萄球菌EDIN。大多数ADP-核糖基化细菌毒素含有A亚基和B亚基。

目标多核苷酸可以在体外或体内用于生产本发明的肽。可以将这种多核苷酸给药或用于制备用于治疗克罗恩病或另一种以MAP表达为特征的疾病或病症的药物。

基因治疗和核酸免疫是提供将编码一种或多种所选择抗原的核酸分子引入宿主细胞以在体内表达一种或多种抗原的方法。用于基因递送的方法是本领域熟知的。参见，例如美国专利第5,399,346、5,580,859和5,589,466号。可将核酸分子直接引入受体对象中，例如通过：标准的肌内或皮内注射；经皮颗粒递送；吸入；局部，或通过口服、鼻内或粘膜给药方式。可替代地，可将分子离体引入已经从对象中移出的细胞中。在后一种情况下，将含有目标核酸分子的细胞重新引入对象中，使得可以针对由该核酸分子编码的抗原进行免疫应答。在这种免疫作用中使用的核酸分子在本文中通常称为“核酸疫苗”。

这些递送技术中的每一种都需要在转染细胞中有效表达核酸，以提供足量的治疗基因产物或抗原基因产物。已知有几个因素会影响获得的表达水平，包括转染效率、目标基因或序列被转录以及mRNA翻译的效率。

取决于所使用的多核苷酸和/或载体，由宿主细胞产生的试剂可以被分泌在细胞内或可以被包含在细胞内。如本领域技术人员将理解的，可以将含有本发明的多核苷酸的表达载体设置有信号序列，该信号序列指导通过特定的原核或真核细胞膜分泌从载体表达的多肽。

本发明的载体和表达盒可以作为“裸核酸构建体”直接给药，优选进一步包含与宿主细胞基因组同源的旁侧序列。如本文所用，术语“裸DNA”是指载体，例如包含本发明的多核苷酸以及短启动子区域以控制其产生的质粒。之所以称其为“裸”DNA，是因为这些载体不在任何递送溶媒中携带。当这种载体进入宿主细胞(例如真核细胞)时，其编码的蛋白质在细胞内被转录和翻译。

因此，本发明的载体可以是质粒载体，即自主复制的染色体外环状或线性DNA分子。质粒可以包含其他元件，例如复制起点或选择子基因。这种元件在本领域中是已知的并且可以使用标准技术来包括。许多合适的表达质粒是本领域已知的。例如，一种合适的质粒是pSG2。该质粒最初从加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)分离。13.8 kb的长度，HindIII、EcoRV和PvuII的单个限制性酶切位点以及使质粒非必要区域缺失的可能性使得pSG2成为适合载体开发的基本复制子。

或者，可以使用本领域已知的多种病毒技术将本发明的载体引入合适的宿主细胞，例如用重组病毒载体，比如逆转录病毒、单纯性疱疹病毒和腺病毒进行感染。

在一个实施方式中，载体本身可以是重组病毒载体。合适的重组病毒载体包括但不限于：腺病毒载体、腺相关病毒(Adeno-associated viral，AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体或细小病毒载体。在病毒载体的情况下，多核苷酸的给药由靶细胞的病毒感染来介导。

已经开发了许多用于转染哺乳动物细胞的基于病毒的系统。

例如，可以使用本领域已知的技术将选择的重组核酸分子插入载体中并包装为逆转录病毒粒子。然后可以分离重组病毒并递送至对象的体内或离体细胞。逆转录病毒载体可以基于莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)。在逆转录病毒载体中，通常目标基因取代病毒基因(gag、pol和env)中的一个或多个基因。

许多腺病毒载体是已知的。腺病毒C亚群血清2型和5型通常用作载体。野生型腺病毒基因组大约为35 kb，其中多达30 kb可被外源DNA取代。有四个具有调节功能的早期转录单元(E1、E2、E3和E4)，以及编码结构蛋白的晚期转录子。腺病毒载体可以使E1和/或E3基因失活。然后可以通过辅助病毒、质粒来反式提供缺失的基因，或将其整合到辅助细胞基因组中。腺病毒载体可以使用E2a温度敏感突变体或E4缺失。最小的腺病毒载体可能仅包含反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)和转基因周围的包装序列，辅助病毒反式提供了所有必需的病毒基因。因此，合适的腺病毒载体包括Ad5载体和猿猴腺病毒载体。例如，可以使用ChAdOx2，其是一种由牛津大学开发的用于在人中最大程度减少与任何先前存在的腺病毒免疫的交叉反应性的、猿猴衍生的非复制性疫苗载体(Morris et al.FutureVirol.2016；11(9):649–659)。在一些实施方式中，可以将编码上述多肽中的任何一种多肽(例如具有SEQ ID NO：41和62至69中任一个所示的序列的多肽)的多核苷酸，以与(Morriset al.Future Virol.2016；11(9):649–659)中描述的含有HAV并表达MAP基因AhpC、Gsd、p12和mpa的HAVChAdOx2疫苗构建体相同的方法插入ChAdOx2载体中。

病毒载体也可以衍生自痘病毒家族，包括牛痘病毒和禽痘病毒，例如鸡痘疫苗。例如，经修饰的牛痘病毒安卡拉(Modified vaccinia virus Ankara，MVA)是一种牛痘病毒株，它在大多数细胞类型(包括正常人组织)中不复制。因此，重组MVA载体可以用于递送本发明的多肽。

添加病毒类型(例如腺相关病毒(AAV)或单纯性疱疹病毒(HSV))也可以用于开发合适的载体系统。

作为病毒载体的替代，脂质体制剂可替代地用于递送本发明的核酸分子。有用的脂质体制剂包括阳离子(带正电荷)、阴离子(带负电荷)和中性制剂，其中阳离子脂质体是特别优选的。阳离子脂质体可介导质粒DNA和mRNA的细胞内递送。

作为病毒载体系统的另一种选择，本发明的核酸分子可以被封装、吸附至颗粒载体或与颗粒载体缔合。合适的颗粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的颗粒载体，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微粒。也可使用其他颗粒系统和聚合物，例如聚合物是聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的缀合物。

在一个实施方式中，载体可以是靶向载体，即其感染或转染或转导细胞或在宿主和/或靶细胞中表达的能力限于宿主对象内的某些细胞类型(通常为具有共同或相似表型的细胞)的载体。

在一个实施方式中，本发明的载体可以包含单个表达盒，单个多肽序列可从单个表达盒中表达。或者，本发明的载体可以包含两个或更多个表达盒，每个表达盒能够表达不同的多肽，使得载体整体上能够表达所有需要的多肽。当多肽在载体中从多于一个基因座表达或表达为多个单独的分子时，优选对多个序列的表达进行协调，使得所有多肽一起表达。例如，相同或相似的启动子可以用于控制各种组件的表达。可以使用诱导型启动子，以便可以协调各种多肽组件的表达。

本发明还包括已被修饰以表达本发明的肽的细胞。这种细胞包括：瞬时的或优选稳定的较高等的真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞；瞬时的或优选稳定的较低等的真核细胞，例如酵母、或原核细胞，例如细菌细胞。可以通过插入编码本发明的肽的载体或表达盒来进行修饰的细胞的特定实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa和COS细胞。优选地，所选择的细胞系将不仅是稳定的，而且允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达。表达可以在转化的卵母细胞中实现。合适的肽可以在转基因非人类动物(优选小鼠)的细胞中表达。表达本发明的肽的转基因非人动物包括在本发明的范围内。本发明的肽也可以在非洲爪蟾卵母细胞(Xenopuslaevis oocyte)或黑素细胞中表达。

可以使用常规方法培养本发明的这种细胞系以产生本发明的多肽，或者可以治疗或预防地使用本发明的这种细胞系以将本发明的多肽递送至对象。例如，可以将能够分泌本发明的多肽的细胞系给药至对象。或者，可以将本发明的多核苷酸、表达盒或载体给药至来自对象的离体细胞，然后将细胞返回至对象体内。

例如，用于将转化细胞离体递送和再植入对象的方法是已知的(例如，右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射到细胞核中)。

如上所述的包含肽、多肽、多核苷酸或载体的组合物的配制可以使用标准药物配制化学和方法来进行，所有这些对于合理的技术人员都是容易获得的。例如，可将包含本发明的一种或多种分子的组合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂或溶媒组合。赋形剂或溶媒中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。这些赋形剂、溶媒和辅助物质通常是不会在接受组合物的个体中诱导免疫应答并且其给药可能不会引起异常毒性的药物制剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中也可包括药学上可接受的盐，例如：无机酸盐，比如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences；Mack Pub。Co.，N.J.1991)中可获得药学上可接受的赋形剂、溶媒和辅助物质的详尽论述。

这种组合物可以以适于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售。可注射组合物可以以单位剂型形式制备、包装或销售，例如在含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物包括但不限于：悬浮液、溶液、油性或水性溶媒中的乳液、糊剂，和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。这种组合物还可以包含一种或多种另外的成分，包括但不限于：悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外给药的组合物的一个实施方式中，活性成分以干燥(例如粉末或颗粒)形式提供，以便在进行复原组合物的胃肠外给药之前用合适的溶媒(例如无菌无热原水)进行复原。药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知的技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含其他成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂(例如水或1,3-丁二醇)来制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于：林格氏溶液，等渗氯化钠溶液和不挥发性油(例如合成的单甘油酯或二甘油酯)。

其他有用的可肠胃外给药的组合物包括包含微晶形式的活性成分、在脂质体制剂中的活性成分、或作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的组合物。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水性材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。

核酸吸收和/或表达的某些促进剂(“转染促进剂”)也可包括在组合物中，例如促进剂为布比卡因、心脏毒素和蔗糖，以及转染促进溶媒(例如常规用于递送核酸分子的脂质体或脂质制剂)。阴离子脂质体和中性脂质体是广泛可得的并且众所周知用于递送核酸分子(参见，例如，Liposomes:A Practical Approach,(1990)RPC New Ed.,IRL Press)。阳离子脂质制剂也是用于递送核酸分子的众所周知的载体。合适的脂质制剂包括可以以商品名Lipofectin

或者，本发明的核酸分子可以被封装、吸附至颗粒载体或与颗粒载体缔合。合适的颗粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的颗粒载体，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微粒。参见例如，Jeffery et al.(1993)Pharm.Res.10:362-368。也可使用其他颗粒系统和聚合物，例如聚合物是聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的缀合物。

配制的组合物将包括足以引起免疫应答的一定量的目标分子(例如载体)。合适的有效量可由本领域技术人员容易地确定。这种量将落在可通过常规试验确定的相对宽的范围内。该组合物可以包含约0.1％至约99.9％的载体，并且可使用本领域技术人员已知的方法直接给药至对象，或者离体递送至衍生自对象的细胞。

在一个方面，疫苗可以是肽疫苗。在一个实施方式中，可以使用任何合适的递送系统来递送疫苗中的肽，例如基于乳剂的递送系统、基于脂质体的递送系统、基于病毒体的递送系统、基于传递体的递送系统、基于古细菌体(archeosome)的递送系统、基于囊泡的递送系统、基于脂质卷(cochleate)的递送系统和/或颗粒递送系统。

肽可以与佐剂一起给药，或者疫苗可以包括佐剂。佐剂可以例如，选自弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，CFA或FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund’s incompleteadjuvant，IFA或FIA)、Montanide

本文公开的疫苗、肽、多肽、多核苷酸和载体可用于治疗或预防MAP感染，或用于治疗或预防与MAP感染相关的任何疾病、病症或症状，即任何是MAP感染的直接或间接结果的疾病病症或症状，或者是由于MAP的存在所致的疾病或病症导致的疾病病症或症状。已知MAP与许多特定的医学状况有关，例如肠的慢性炎症，包括炎性肠病以及肠易激综合征。例如，MAP感染会引起慢性肠炎，例如牲畜约内氏病(副结核病)和人克罗恩病和肠易激综合征。其他与MAP相关的疾病或病症包括但不限于：帕金森病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、甲状腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、结节病、特发性肺纤维化、慢性疲劳综合征和其他具有慢性自身免疫性炎症组分的复杂疾病。因此，本文公开的疫苗、肽、多肽、多核苷酸和载体可以用于预防或治疗任何这些特定病症。

在某些情况下，正在治疗的对象可能被临床诊断识别为MAP感染。在一个实施方式中，如国际专利申请第PCT/GB2018/050075(通过引用整体并入本文)中所述，使用单克隆抗体通过临床上适用于人和动物MAP感染的简单诊断来检测MAP感染。例如，靶向多拷贝IS900编码的蛋白质的可接近的氨基和羧基末端胞外结构域中的特定肽序列的一对或两对互斥的单克隆抗体可用于检测来自对象的样本中的MAP。在该诊断测试中，一对抗体中的一个抗体识别天然肽序列，另一个抗体识别其磷酸化衍生物。两种或更多种不同荧光团标记的单克隆抗体的同时使用首次获得了布满被MAP感染的宿主细胞的细胞质并显示在被感染的细胞表面上的MAP的清晰图像。诊断方法可以例如使用针对MVINDDAQRLLSQR和MVINDDAQRLL[pS]QR的成对的单克隆抗体和/或针对YLSALVSIRTDPSSR和YLSALVSIRTDPS[pS]R的成对的单克隆抗体。抗体可以例如用相同或不同的荧光团标记。

使用这些成对的特异性共定位单克隆抗体对血液样本进行流式细胞术提供了一种简单而准确的检测方法，该方法允许对被MAP感染的循环白细胞及其亚型进行定量。在组织样本(例如内窥镜活检和手术切除组织)上使用这些荧光团标记的抗体显示出明亮的被MAP感染的细胞及其分布和宿主细胞亚型的强图像。

这些特定的试剂以及随后在血液和组织上进行的新型临床MAP测试表明，患有克罗恩病的每个人都感染了MAP。该方法和试剂首次提供用于简单准确的测试以对人和动物MAP感染进行诊断和定量。它们还可用于临床筛查患有MAP是候选病原体的其他疾病的人的血液和组织样本，该其他疾病如帕金森病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、甲状腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、结节病、特发性肺纤维化、慢性疲劳综合征和其他具有慢性自身免疫炎性组分的复杂疾病(Hui KY etal.2018；Sci.Transl.Med.10,eaai7795；Hütlova A et al.2018.The EMBO Journale98694)。

因此，本发明涉及本文公开的疫苗、肽、多肽、多核苷酸、载体、细胞或组合物在治疗方法，特别是在治疗或预防与MAP感染相关的或由MAP感染引起的疾病、病症或症状的方法中的用途。因此，本发明的这些分子也可以用于制备用于治疗或预防这种疾病、病症或病状的药物。因此，本发明还包括根据本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体在制备用于治疗或预防MAP感染或与MAP感染相关的病症或症状的药物中的用途。特别地，提出了本发明的分子用于治疗或预防肠的慢性炎症(优选在哺乳动物诸如人、牛、绵羊或山羊中)。因此，本发明还提供了一种治疗或预防任何这种疾病、病症或症状的方法，该方法包括将本发明的多肽、多核苷酸、表达盒、载体、细胞、抗体或组合物给药至有此需要的对象。

本发明广泛适用于疫苗接种方法，并且涉及预防性和/或治疗性疫苗(包括免疫治疗性疫苗)的开发。应当理解的是，本文对治疗的所有提及均包括治愈性、姑息性和预防性治疗。

根据本发明，肽、多核苷酸、载体或疫苗可以单独用作组合物的一部分，例如但不限于用于预防和/或治疗与MAP感染相关的病症的药物组合物或疫苗组合物或免疫治疗组合物。组合物的给药可以用于“预防性”或“治疗性”目的。如本文所用，术语“治疗性”或“治疗”包括以下中任一项：感染或再感染的预防；症状的减少或消除；以及病原体的减少或完全消除。可以预防性地(在感染之前)或治疗性地(在感染之后)进行治疗。

预防或治疗包括但不限于引起对本发明的多肽的有效免疫应答和/或减轻、减少、治愈或至少部分地阻止由MAP感染引起或与MAP感染相关的症状和/或并发症。当预防性地提供时，通常在任何症状之前提供本发明的组合物。本发明的组合物的预防性给药是为了预防或改善任何随后的感染或疾病。当治疗性地提供时，通常在感染或疾病的症状发作时或发作不久之后提供本发明的组合物。因此，可以在预期暴露于MAP之前或在相关疾病状态发作时或在感染或疾病开始之后提供本发明的组合物。

如果在疫苗接种后被MAP攻击，与未接种疫苗的对象相比，疫苗降低了接种疫苗的对象中的MAP负载，则通常认为该疫苗是预防有效的。如果对象在疫苗接种前被MAP感染，与疫苗接种前相比，如果MAP负载降低，则通常认为疫苗是有效的。可以确定血液或组织中的MAP负载。MAP和/或MAP组件，例如肽或蛋白质可存在于细胞表面上或细胞质内的细胞内。MAP表达可以通过抗体染色来确定(WO 2018/130836)。

疫苗的有效性可以任何合适的方式来确定。例如，细胞因子表达、T细胞活化、抗体产生和/或外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)MAP杀伤中的变化可以用于确定疫苗的有效性。在监测细胞因子表达的情况下，例如，抑制性细胞因子产生(例如IL-10产生)的减少是理想的效果。疫苗中表位特异的T细胞的产生可以例如通过用疫苗中存在的肽离体刺激T细胞并检测IFN-γ释放来检测，例如使用ELISpot或ELISA测定法。用于检测对疫苗中的多肽具有特异性的抗体(例如针对疫苗中存在的一种或多种肽的抗体)的合适的测定法是本领域已知的。类似地，用于监测PBMC MAP杀伤的离体测定法是已知的。

本发明尤其涉及与MAP感染相关的疾病或其他病症的治疗或预防。这些治疗可以用于易受MAP感染的任何动物。

待治疗的对象可以是cordata亚门的任何成员，包括但不限于：人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物，例如黑猩猩和其他类人猿以及猴物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟，包括家禽、野生鸟类和猎禽，例如鸡、火鸡和其他鹑鸡、鸭、鹅等。这些术语不指定具体年龄。因此，旨在覆盖成年和新生个体。本文描述的方法旨在用于上述任何脊椎动物物种，因为所有这些脊椎动物的免疫系统均类似地起作用。如果是哺乳动物，则对象将优选是人，但也可以是家畜、实验室对象或宠物。

因此，待治疗的对象可以是易受MAP感染的任何脊椎动物。在本领域中已经显示出许多能够具有这种感染的动物，包括：牲畜，例如牛、山羊和绵羊；灵长类动物，例如猕猴和人；其他哺乳动物，包括羊驼、羚羊、驴、麋鹿、马、鹿、狗、沙鼠和兔；以及鸟，包括鸡。因此，本发明的组合物可以用于治疗任何这种物种。

在一个实施方式中，治疗或预防MAP感染或与MAP感染相关的病症的方法可以包括将对MAP具有活性的另一种治疗剂或在与MAP感染相关的病症的治疗中使用的另一种治疗剂给药至对象。

另一种治疗剂可以是另一种多核苷酸、载体或多肽，例如，一种或多种抗微生物剂(比如包括利福布汀和克拉霉素的组合)单独或与一种或多种另外的治疗剂组合给药至对象。治疗可以是预防性或治疗性MAP疫苗。治疗可以包括将抗MAP单克隆抗体(比如本文所描述的抗体和肽)给药至对象的被动免疫疗法。

治疗剂可以是例如对MAP具有活性的试剂，或是用于治疗与MAP感染相关的病症的试剂。本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体优选以足以增强其他治疗剂的抗MAP作用的量给药，反之亦然。许多其他试剂可用于治疗MAP或与MAP感染相关的病症。这些其他试剂包括利福霉素，例如利福布汀和利福昔明、克拉霉素和其他大环内酯类、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、阿达木单抗、6-巯基嘌呤和/或英夫利昔单抗。也可以使用各种抗结核药。

其他治疗剂可以是增强本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体的分子的作用的试剂。例如，其他试剂可以是增强对多肽的免疫应答的免疫调节分子或佐剂。或者，其他分子可以增加对象中存在的MAP对攻击(例如来自免疫系统的攻击)的敏感性。

因此，在一个实施方式中，本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体与一种或多种其他治疗剂组合用于治疗。

疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体可以分开、同时或依次给药。疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体可以在相同或不同的组合物中给药。因此，在本发明的方法中，还可以用其他治疗剂治疗对象。

因此可以配制包含本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体以及一种或多种其他治疗分子的组合物。例如，本发明的载体可以与编码一种或多种其他抗原或治疗性分子的另一种载体一起配制。或者，本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体可以与一种或多种治疗性蛋白质一起配制。

本发明还包括根据本发明的疫苗、肽、多肽、多核苷酸或疫苗载体与另外的治疗剂结合在制备用于治疗或预防MAP感染或与MAP感染相关的病症或症状的药物中的用途。

一旦进行了配制，疫苗组合物就可以使用多种已知途径和技术体内递送至对象。例如，组合物可以作为可注射溶液剂、悬浮剂或乳剂提供，并使用常规针和注射器，或使用液体喷射注射系统通过肠胃外、皮下、表皮、皮内、肌内、动脉内、腹膜内、静脉内注射给药。组合物还可以局部给药至皮肤或粘膜组织，例如经鼻、经气管内、经肠、经直肠或经阴道，或作为适合于呼吸或肺部给药的细分喷雾剂提供。其他给药方式包括口服给药、栓剂和主动或被动经皮递送技术。特别地，对于本发明，可以将组合物直接给药至胃肠道。

或者，可以离体给药该组合物，例如，用于将转化细胞离体递送和再植入对象的方法是已知的(例如，右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射到细胞核中)。

组合物以与剂量制剂相容且预防和/或治疗有效的量给药至对象。适当的有效量将落在相对宽的范围内，但是可由本领域技术人员通过常规试验容易地确定。“医生桌上参考手册(Physicians Desk Reference)”以及古德曼(Goodman)和吉尔曼(Gilman)的“《治疗学药理基础》”对于确定所需的量是有用的。

如本文所用，术语“预防或治疗有效剂量”意指足以引起对本发明多肽的一个或多个表位的免疫应答和/或减轻、减少、治愈或至少部分阻止与MAP感染相关的疾病(例如炎性肠病)的症状和/或并发症的剂量。

预防或治疗可通过在单个时间点单次直接给药或可选地在多个时间点通过多次给药来完成。给药也可递送至单个或多个位点。本领域技术人员可调节剂量和浓度以适合于特定的递送途径。在一个实施方式中，在单个时刻给药单次剂量。在一个替代实施方式中，在同一时刻但是例如在不同的部位给药至对象多次剂量。在另一个实施方式中，在多个时刻给药多次剂量。这种多次剂量可以分批给药，即在同一时刻在不同的部位多次给药，或者可以单独给药，在多个时刻中的每个时刻给药一次(任选在多个部位)。可以使用这种给药方案的任何组合。

在一个实施方式中，作为同一治疗方案的一部分，本发明的不同组合物可以在不同的部位或在不同的时刻给药。已知可以通过改变用于递送抗原的载体来产生对抗原的改善的免疫应答。有证据表明，在某些情况下，可以通过依次使用两种不同的载体作为“初免(prime)”和“加强(boost)”来改善抗体和/或细胞免疫应答。

例如，本发明的相同的肽、多肽或多核苷酸可以在一种组合物中作为“初免”给药，然后在不同的组合物中随后作为“加强”给药。用于“初免”和“加强”的两种疫苗组合物可以不同。例如，它们在包含多核苷酸的载体的选择上可以不同。例如，可以依次给药分别选自质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体或本文所述的其他载体的两种或更多种不同载体。

在一个实施方式中，“初免”通过给药在质粒载体例如pSG2中的本发明的多核苷酸来实现。然后在稍后的时间使用在痘病毒载体例如MVA中的本发明的多核苷酸进行“加强”。

在一个替代实施方式中，“初免”通过给药在腺病毒载体例如Ad5中的本发明的多核苷酸来实现。然后在稍后的时间使用在痘病毒载体例如MVA中的本发明的多核苷酸进行“加强”。

用于“初免”的疫苗组合物与用于“加强”的疫苗组合物的不同之处可以在于一种组合物可以包含肽或多肽，而另一种组合物可以包含多核苷酸。例如，在一个实施方式中，“初免”可以通给药肽或多肽来实现，而“加强”可以通过使用多核苷酸来实现。作为其具体实例，“初免”可以包括给药肽或多肽，例如包含SEQ ID NO：3至6中任一个所示的序列，基本上由SEQ ID NO：3至6中任一个所示的序列组成或由SEQ ID NO：3至6中任一个所示的序列组成，并且“加强”可以通过给药包含P900的N末端片段的多核苷酸，例如包含P900的N末端片段和ahpC多肽、gsd多肽、p12多肽和MPA多肽中的一种或多种的多核苷酸来实现。该多肽可以具有SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示的特定序列之一，其中MAP P900 N末端片段插入在aphC多肽和gsd多肽之间、gsd多肽和p12多肽之间、p12多肽和mpa多肽之间、aphC多肽之前和/或mpa多肽之后的连接处。可以设想，这种免疫方案可能在免疫牲畜如牛或绵羊中特别有利，特别是在使用磷酸化形式的MAP P900 N末端片段的情况下，例如包含SEQ IDNO：4或6所示的氨基酸序列、由SEQ ID NO：4或6所示的氨基酸序列组成或基本上由SEQ IDNO：4或6所示的氨基酸序列组成的肽。

在这种初免-加强方案中，可以进行初免和/或加强的一次或多次给药。例如，初免和/或加强步骤可以在不同的部位和/或在不同的时刻使用单次给药或使用两次或更多次给药来实现。在一个实施方式中，对于初免步骤中给予不同的时刻的两次施给药，而对于加强步骤，给予随后的时刻的单次给药。

可以在同一天、间隔一天、二天、三天、四天、五天或六天、间隔一周、二周、三周、四周或更多周在同一时刻进行不同的给药。优选地，间隔1周至5周，更优选间隔2周至4周，例如间隔2周、3周或4周给药。本领域技术人员可以通过常规试验针对一种或多种特定组合物优化这种多次给药的计划表和时间。

给药剂量将取决于许多因素，包括组合物的性质、给药途径以及给药方案的计划表和时间。本发明分子的合适剂量可以大约为每次给药多达15μg、多达20μg、多达25μg、多达30μg、多达50μg、多达100μg、多达500μg或更多。对于本发明的一些分子，例如质粒，使用的剂量可以更高，例如多达1mg、多达2mg、多达3mg、多达4mg、多达5mg或更高。这种剂量可以在液体制剂中提供，其浓度宜为允许适当体积通过所选择的途径进行给药。在病毒载体的情况下，每次给药可以给予约10

本发明还涉及适用于本发明治疗中的本文所述组分的组合，该组合以试剂盒的形式包装在容器中。这种试剂盒可以包含一系列组分以允许本发明的治疗。例如，试剂盒可以包含本发明的两种或更多种不同的载体，或本发明的一种或多种载体，以及一种或多种适合于同时给药，或适合于依次或分开给药(例如使用初免和加强方案)的另外的治疗剂。试剂盒可以任选地包含其他合适的试剂、对照或说明书等。

伦敦大学圣乔治学院(St George’s University of London)、牛津大学詹纳研究所(TheJenner Institute University of Oxford)、爱丁堡大学罗斯林研究所(TheRoslin Institute University of Edinburgh)、动物健康和福利(Animal Health andWelfare)以及北爱尔兰农业食品与生物科学研究所(Agri-Food and BiosciencesInstitute of Northern Ireland)进行了一项由BBSRC资助的HAV疫苗接种防止试验性MAP感染的试验(2010-2014)。

HAV疫苗的在任一端插入前导肽和PK尾部(以粗体显示)的氨基酸序列如下所示。来自其四个如上所述的MAP基因1589c(AhpC)、1234(Gsd)、2444c(p12)和1235(mpa)的序列在其间包含肽序列。HAV疫苗组分之间的连接处标有*。

下划线的序列是p12的序列，是由IS900元件的正链编码的P900蛋白的羧基末端区域。HAV内的p12部分具有短胞质结构域，随后是突出显示的预测的跨膜样序列，随后是P900蛋白的其余胞外部分。P900的胞外羧基末端部分由MAP细胞输出，并通过有限的蛋白水解作用进一步切割，以宿主细胞之间在外泌体样囊泡中运输。HAV疫苗的IS900衍生组分在4种HAV疫苗组分中具有最高水平的细胞免疫原性。

通过向颈部的皮肤中皮内注射(intradermal injection，id)，将初次剂量为10

在12周时，所有动物均连续2天接受了口服给予的5×10

口服MAP攻击后不久，对照组中的所有动物均从其粪便中排出MAP，并在整个研究中持续。在整个研究过程中，对于所有测试动物，HAV疫苗接种都防止了可检测到的MAP粪便排出。在PPD-J刺激后，测试组中的所有六只小牛的应答为IFN-γ的PBMC释放增加，而对照组中并未见到。这伴随着CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+分泌细胞百分比的增加，而对照组没有。加强后的两周，在所有进行HAV疫苗接种的动物中均观察到对HAV疫苗肽的特异性细胞免疫应答，但在对照组动物中未见到，并且在整个研究过程中一直持续这种状态。

即将口服给药MAP之前，对照小牛的PBMC杀伤MAP的能力的实验室测试与HAV疫苗接种小牛的PBMC杀伤MAP的能力的实验室测试相同。在攻击的1周内，对照小牛的PBMC的体外MAP杀伤能力急剧下降了30％，但是在HAV疫苗接种小牛中没有变化。同时，PCR测试出5/6的HAV疫苗接种小牛和4/5的对照小牛的循环PBMC对MAP为阳性。

对照小牛的PBMC杀伤MAP的体外能力仍然受到显著阻碍，到14周时，这些动物在其血液中MAP阳性的PBMC的比例仍为4/5。同时，疫苗接种小牛的血液中MAP阳性PBMC降至2/6。血液中的这些趋势一直持续，以致在MAP感染后的19周研究的第二部分中，有3/5的对照动物始终保持MAP阳性，而其他2只则间歇性地为阳性。相比之下，4/6的HAV疫苗接种小牛的PBMC始终保持MAP阴性。在最后19周的观察期内，其他2只动物中的每只5次MAP PCR测试中只有1次为阳性。PBMC对HAV特异性肽抗原刺激的ELISpot响应持续进行，而动物对照组却没有，这在整个对所有疫苗接种动物的研究中持续。

尸检时，全层组织样本采集自小肠整个长度的11个部位(包括十二指肠2个、空肠6个和回肠3个)以及4个肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph node，MLN)和脾组织。通过特异性qPCR测量尸检时组织中的MAP负载。在5只对照小牛中，所有组织样本对MAP均为阳性，每克样本微生物负载高达5 log。作为一个组，这些组织样本总共包括十二指肠10个、空肠30个、回肠15个、肠系膜淋巴结(MLN)20个以及5个脾脏的每个脾脏的1个样本。

相比之下，在6头HAV疫苗接种小牛中，测试出十二指肠的12个组织样本中有10个、空肠的36个中有28个、回肠的18个中有12个、MLN的24个中有7个、6个脾脏中的3个对MAP呈阴性。在残留的MAP阳性样本中，HAV疫苗接种与明显低于对照组的对应样本的微生物负载相关。与其他慢性肠道人病原体(例如结核病、耶尔森氏鼠疫杆菌、军团杆菌等等)一样，MAP显示出在MLN中持续存在的能力，为此可以制定进一步的策略。

这项研究必须设计为测试HAV疫苗接种对牛犊中MAP感染的保护作用的能力。对照组和HAV疫苗接种组的小牛在MAP攻击后血液中MAP均为阳性。在整个研究过程中，所有对照小牛的血液中君保持MAP阳性，并且在其粪便中排出MAP。所有HAV疫苗接种小牛似乎都消除了血液中的MAP，并阻止了可检测的粪便排出。

阶段1.对结合P900中的肽结构域的小鼠抗体进行绘谱

IS900(NCBI登录：AE016958.1)是本发明人及同事于1985年末在MAP的三种克罗恩病分离株中发现的1451 bp至1453 bp的DNA插入元件(E.Green et al Nucleic AcidsResearch1989；17:9063-73)。该DNA插入元件以插入在整个MAP基因组中的高度保守位点处的14至18个相同拷贝的方式存在于MAP中。该多拷贝元件具有其自身的启动子，在人体中大量表达，并且导致广泛的致病性表型。

IS900的正链预测具有406个氨基酸的蛋白质(P900)。该蛋白质的全长氨基酸序列是MAP特有的，但在密切相关的分枝杆菌和放线菌中存在覆盖了P900分子的大部分的P900“相似物”。

由IS900的正链所编码的全长P900蛋白对大肠杆菌细胞是有毒的。在大肠杆菌中制备并作为重组蛋白表达由P900的第49至377位氨基酸组成的毒性较小的截短版本。

因为发现游离的重组蛋白未诱导令人满意的免疫响应，用粘附至磁珠的重组P900截短蛋白免疫10只小鼠。通过针对固定化P900的ELISA来筛选来自免疫小鼠的血清并鉴定出4只阳性小鼠。将来自这些小鼠的脾细胞用于杂交瘤融合，从而产生10个亲本克隆。针对跨越从ELIAAVTTLADGGEV…至…DRKRTEGKRHTQAVL的P900氨基酸截短序列的、具有10个氨基酸重叠的、64种合成的15个氨基酸的肽的文库来筛选来自这些亲本克隆及其连续亚克隆的上清液。抗体全部是IgM，并且最终证明该克隆不稳定。尽管不能获得所需的单克隆试剂，但在P900截短蛋白中的8种肽或肽簇被鉴定为具有免疫原性。在肽文库中，这些涉及肽编号2-VTTLADGGEVTWAID、27-NKSRAALILLTGYQT、41-AKEVMALDTEIGDTD、42-ALDTEIGDTDAMIEE以及在序列GRISGNLKRPRRYDRRLLRACYLSALVSIRTDPSSRTYYD内的簇。

阶段2.在兔中制备P900序列多克隆抗体及该抗体在人和动物上的测试。

多克隆抗体制备

鉴定命名为A1-VTTLADGGEVTWAIDLNA、A2-NKSRAALILLTGYQTPDA、A3-NLKRPRRYDRRLLRAGYL以及A4-YLSALVSIRTDPSSR的初始肽。将这些肽制备为合成的在聚赖氨酸核上的支链八肽免疫原，并用来使兔免疫。对于A1、A3以及A4，容易达到合适的多克隆抗体滴度。A2对兔没有免疫原性。而且A2在MAP胞内，未进一步研究。

使用过量的抗原将与弗氏完全佐剂反应的A1和A3血清中的抗体(结核分枝杆菌H37Ra，Difco，USA)提取完成。仅对A4使用弗氏不完全抗原作为佐剂。将兔多克隆试剂A1、A3以及A4应用于初步研究，以探索所述兔多克隆试剂检测其靶序列从而检测人和动物组织以及人血液中的MAP免疫反应性的能力。

人组织中的MAP免疫反应性

在初始研究中，从14名在英国伦敦圣托马斯医院(St Thomas’Hospital)内窥镜门诊就诊的被诊断为患有克罗恩病(CD)的患者和10名参加筛查或随访的无炎性肠病(nIBD)的对照患者中获得了新鲜肠粘膜活检组织。当地伦理委员会给出了伦理批准(EC03/053)。将活检组织包埋在Jung组织冷冻培养基中，并在内窥镜套件中的液氮中快速冷冻。然后将活检组织带到实验室进行编码并在使用前储存于-80℃。

随后将定向的活检组织切成6μm的切片并封固在涂覆有PTFE的载玻片上，并用以1：400至1：800稀释的A1、A3以及A4多克隆抗体染色。对于T细胞，宿主细胞表型标志物为CD3，对于单核细胞/巨噬细胞为CD8，对于B细胞为CD19，对于中性粒细胞为CD66b，对于树突细胞为CD83，对于胶质细胞为PgP 9.5，并且对于内皮细胞为CD31。二抗为兔抗小鼠TRITC(R0270 Dako，UK)、兔抗小鼠FITC(F0261，Dako)、猪抗兔TRITC(R0156，Dako)、猪抗兔FITC(F0205，Dako)以及山羊抗小鼠FITC(F0479)。将载玻片在PBS中洗涤3次并封固在荧光封片剂(F4680 Sigma-Aldrich，UK)中，然后盖上盖玻片。

单独使用浓度为1:500至1:800的抗体A1、A3以及A4导致上皮细胞内的和下方固有层中的细胞染色。然后成对地使用抗体A1和A3或A4，其中A1用TRITC(红色)标记，A3或A4用FITC(绿色)标记。

A1位点位于P900蛋白中与第一跨膜区相邻并且正对微生物细胞的表面的胞外氨基末端结构域。A1肽似乎保持附接于MAP上。

A3和A4位点位于半胱氨酸344任一侧的较长羧基末端胞外结构域的中心。羧基末端结构域可以通过靠近第二跨膜区的有限蛋白水解切割来附接或释放。

使用A1(红色)和仍附接有羧基末端肽的A4(绿色)导致不仅在相同细胞中而且在受感染细胞的细胞质内的亚微米颗粒上共定位(金色)。释放羧基末端导致从金色至橙色至红色的渐进梯度的颜色变化以及释放的肽(绿色)在受影响细胞的细胞质中的可见迁移。观察到其他细胞含有绿色仅表明释放的羧基末端肽运输到本身不含MAP的其他细胞中的能力。这通过充满绿色的细胞间囊泡组织的外观与核内体一致得到了支持。

在表面上皮中，观察到与淋巴细胞和巨噬细胞一致，MAP感染肠上皮细胞以及上皮内细胞。观察到MAP常常聚集在释放绿色羧基末端肽的杯状细胞的粘液液泡底部周围的“项链环(necklace)”中，该羧基末端肽在细胞质中迁移到这些细胞的尖端以及粘液液泡本身内。

还看到MAP广泛感染固有层中的细胞，并且特别是在隐窝底部周围的细胞簇。染色特别涉及巨噬细胞、多形核白细胞以及B淋巴细胞，尽管经常注意到存在与MAP簇相邻的T淋巴细胞，但染色不涉及T淋巴细胞。

在所有14名克罗恩病患者中均观察到内窥镜黏膜活检组织中有大量的MAP感染。10名对照对象的8名中观察到少量的免疫反应性MAP簇。其他2名对照对象完全不含MAP染色。添加特异性肽至操作缓冲液中完全阻断了相应抗体对组织的染色。使用其他肽对抗体结合没有影响。与共定位一起，该特异性阻断巩固了MAP检测系统的精确性和特异性。

与人组织中MAP结合的A1抗体的PCR验证：

进行A1免疫反应性基因座的激光显微切割压力弹射(LMPC)以使用IS900 PCR确定在组织中识别到抗体是否等同于存在MAP。从11名知情同意的患者和4名未患炎性肠病的对照对象中获得了新鲜内窥镜粘膜活检组织。将组织在液氮中快速冷冻，并如前所述切割为6μm的冷冻切片。将切片转移到涂覆PTFE的显微镜载玻片上用于常规H&E染色。将用于LMPC的切片固定在PEN-膜载玻片上(Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Germany)。

使用与兔免疫球蛋白结合的生物素化的碱性磷酸酶H标记的二抗，用A1兔多克隆抗体鉴定切片中的免疫反应性MAP区域。在PBS中洗涤载玻片后，根据制造商的说明，使用Vectastain Universal ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories UK)定位免疫反应性MAP区域。使用Vector Blue碱性磷酸酶底物试剂盒1(Vector Laboratories Uk)定位二抗。

使用Zeiss PALM MicroBeam激光显微切割系统，用激光显微切割和压力弹射来分离免疫反应性(IR)和非免疫反应性(nIR)MAP区域。在显微切割之前，特别注意确保切片完全风干，以使切除的区域容易脱离。目视鉴定IR和nIR区域，并将胶帽管定位在所选区上方。将样本积聚于胶管的帽上。如T.Bull et al.2003 J Clin Microbiol 2003；41:2915-23所述进行DNA提取。简而言之，向每个管中添加200μL分枝杆菌裂解缓冲液(MLB)、8.6 ml分子级水、800μL的5 M NaCl、1 M 10x Tris-EDTA(TE)以及600μL的10％SDS，并在37℃下孵育过夜。向每个管中添加10μL的10 mg/ml蛋白酶K(Sigma)、5μL的100 mg/ml溶菌酶(Sigma)以及4μL的120 mg/ml脂肪酶(Sigma)的MLB溶液，并在37℃下再孵育3小时。将样本转移至LysingMatrix B ribolyser管中并添加400μL 1xTE。使管在FastPrep Ribolyser仪器上以6.5ms

所有4名对照对象通过IS900 PCR测试为阴性。CD组的11名患者中有7名的免疫反应区域在IS900 PCR中为MAP阳性，有5名通过扩增子测序证实。在CD患者中取样的所有nIR区域均为PCR阴性。所有7名通过IS900 PCR测试为MAP阳性的患者经历硫唑嘌呤(azathioprine)单独治疗。4个PCR阴性样本来自接受硫唑嘌呤与阿达木单抗(Humira)或6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)以及英夫利昔单抗(Infliximab)联合治疗的克罗恩病患者。

阶段3.抗所选A0、A1、A3以及A4位点内的优化的P900肽序列的鼠单克隆抗体和磷酸化衍生物的制备。

在该阶段，引入了命名为A0的另外的用于产生单克隆抗体的靶位点，该靶位点包含序列MVINDDAQRL，即P900的胞外氨基末端结构域中的第26至39位残基。在NCBI数据库中几乎没有发现与该序列相同的匹配序列。

首先以下列方式尝试产生鼠单克隆抗体。针对A0(MVINDDAQRL-C)、A3(C-NLKRPRRYDR)以及A4(C-VSIRTDPSSR)，制备在各种情况下掺入用于连接至KLH的单独半胱氨酸硫醇的免疫原肽，并且在每组中免疫5只小鼠。尽管每组中的一些小鼠免疫响应好，但没有获得识别其在组织中的天然靶的单克隆抗体。发现这是由于排他地使用用于筛选ELISA的靶肽和直接涂覆在ELISA板孔上进行克隆选择。这导致了大量的人为产物，项目全面失败。

另一方面，本发明人发现，用于筛选ELISA的靶合成肽必须是α-n生物素化的且附着于涂覆有链霉亲和素的孔。这增加了附着的移动肽的空间可及性，并允许采用适合于液相中的抗体的肽构型。在ELISA中以该形式与靶肽结合的抗体与靶组织中与天然肽结合的抗体之间存在密切的相关性。

在ELISA孔中采用必需的链霉亲和素涂层和生物素基-肽固定并在整个下一个项目中使用。在该项目期间，选择小鼠血清和培养物上清液以与参考肽而不与阴性肽结合。随后通过对人体和动物组织以及感染MAP的细胞的进行萤光免疫检验来测试所选样本。

使用肽序列A0X MVINDDAQRLLSQR-C、A1 VTTLADGGEVTWAID-C以及XA4YLSALVSIRTDPSSR-C合成免疫原，在每种情况中使用标准方法用半胱氨酸硫醇连接至KLH。这些构建体用于免疫5至10只BalbC小鼠的组。所有组均出现良好的血清响应，并且每组获得了有希望的候选克隆。尽管对免疫方案进行了补充，包括体外免疫以及接着使用不同的免疫原加合物进行免疫，连同大量的额外工作，但仍无法获得合适的最终稳定的IgG克隆。

在下一个项目中初始使用的材料如下：

在第1天用弗氏完全抗原(Freund’s Complete Antigen)中的免疫原肽构建体免疫5只SwissWebster小鼠组，然后使用弗氏不完全抗原(Freund’s Incomplete antigen)在第14天和第21天进行2次加强注射。继续推进，但很明显，4组中没有一组的响应令人满意。合成新的肽免疫原ac-MVINDDAQRL-C、ac-VTTLADGGEVT-C、ac-NLKRPRRYDR-C以及ac-VSIRTDPSSR-C，通过C-与KLH偶联并继续免疫。

A0组和A1组的瞬态响应没有持续。均没有信号并且终止。

来自A3组和A4组中每一组的一只小鼠的血清达到足以进行亲本克隆融合和发育的滴度。随后A3没有获得令人满意的亚克隆，该项目终止。A4实现了令人满意的亚克隆，该亚克隆识别了参考肽而不识别5种阴性肽并且通过最终生产和蛋白A亲和纯化取得。

在该阶段，将三个进一步的修改引入方案中：

1.使用Balb/C小鼠。

2.采用在尾静脉底部给药免疫原的技术，然后直接融合来自腹股沟淋巴结的池化细胞。

3.使用以下新的肽免疫原重新设计项目。

在该位点向氨基末端添加两个丙氨酸残基旨在增加免疫原性和特异性。在免疫原肽的羧基末端添加带电-GKK残基旨在克服其增加的疏水性。如果在偶联反应期间免疫原肽形成胶束，则与半胱氨酸硫醇相邻的带电GKK部分的存在将有利于其对BSA的可接近性。在参考肽的氨基末端包含镜像KKG将有利于选择对靶序列本身具有特异性的抗体。

所有5个A0X、A0XP、XA1、A4以及XA4P项目均得出了成功的结论，这些项目包括：针对通过ELISA识别参考肽而与阴性对照肽有限结合或不结合来进行克隆选择，然后通过组织和细胞染色通过所选克隆的上清液与组织和细胞结合。获得了亲和纯化的A0X、A0XP、XA1、A4以及XA4P单克隆抗体。

1.感染MAP的人肠道组织的检测和测量

对来自45名患有克罗恩病和其他一些疾病(比如肠易激综合征)的人的内窥镜活检组织进行了研究(Scanu et al.Mycobacterium avium subspecies paratuberculosisinfection in cases of Irritable Bowel Syndrome and comparison with Crohn’sdisease and Johne’s disease:common neural and immune pathogenicities.J ClinMicrobiol 2007:45:3883-90)。立即将样本固定在福尔马林中，然后进行标准处理并包埋在石蜡组织病理学块中。进行了初步工作，鉴定2μm切片是最优的。用标准抗原修复方案处理切片。然后以范围为1/500至1/5000的单克隆抗体稀释液染色。采用直接荧光团标记一抗以及使用用荧光团标记的二抗。用单独使用的一抗A0X、A0XP、XA1、A4、XA4P各自对组织进行染色，并用Zeiss AxioSkop 2显微镜在×100和×200放大倍数下查看以获得MAP分布的整体印象，然后在×400和×1000下查看。人体中的MAP是齐尔-尼尔森(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色阴性形式，并且似乎在0.3至1μm的大小范围内。对于令人满意的分辨率需要更高的放大倍数。

A0X、XA1、A4以及XA4P均使在人肠道中、更具体地在所有测试的45名患有克罗恩病的人的肠道的内窥镜活检组织中的MAP染色。然而，除了来自血液中含有A0XP阳性细胞的组织血管腔的偶然可见的荧光信号之外，在人中未观察到人肠道组织被A0XP染色。与动物不同，A0X的磷酸化似乎不会在人肠道中广泛发生。然而，在被MAP感染的人血液中看见了磷酸化A0XP。在被MAP感染的人血液中和在测试的所有患有克罗恩病的人中观察到MAP被A0X、A0XP、XA1、A4以及XA4P染色。

还组合使用抗体并通过共聚焦显微镜查看。优选地，使用成对抗体。优选的对是A0X与来自亲本MAP分子的氨基末端的A0XP或XA1，以及A4与来自羧基末端的XA4P。优选的对也是分别用红色荧光团或绿色荧光团标记的A0X与A4以及XA1与A4。这在试剂不仅在相同细胞的细胞质中还在感染细胞的细胞质内的亚微米MAP上特异性地共定位时提供了金色染色。这种共定位提供了对MAP检测的特异性的有力证明。

使用包含XA1与A4以及A0X与A4的抗体对揭示了该方法的另一方面。这是因为A0X和XA1似乎保持附着于MAP生物体本身或被释放而保留在细胞中或展示在细胞表面上，而A4经常从MAP中释放而展示在细胞表面上以及从受感染细胞中释放而在细胞之间运输。当A0X或XA1用红色荧光团标记并且A4用绿色荧光团标记时，随着绿色标记的A4贩运并且进入其他细胞，原始的金色共定位逐渐耗尽为橙色，然后变为红色。观察到充满A4绿色的膜结合结构，与细胞间囊泡的存在一致。

来自所有克罗恩病患者的活检组织样本测试为MAP阳性。这在粘膜区室的细胞中、特别是在上皮细胞的基部和杯状细胞中粘液的底部周围的细胞质中观察到。在粘膜区室中其他含MAP的细胞是上皮内巨噬细胞和树突细胞以及上皮内淋巴细胞。在腔内粘液凝胶层中也观察到含MAP的细胞和游离杆菌。在固有层中，MAP感染常见于巨噬细胞、多形核白细胞以及B淋巴细胞中。很少观察到T淋巴细胞本身会参与，但经常出现在充满MAP的巨噬细胞的邻近。MAP阳性细胞常见于小血管腔。在十二指肠活检组织中，布氏腺(Brunner’s glands)的MAP染色仅限于偶然可见的充满MAP的巨噬细胞，而腺细胞本身未受影响。然而，含MAP细胞存在于布氏腺的间质结缔组织中。组织内细胞中的A0XP似乎集中在细胞核周围。人组织中MAP的这些图像可以适应于成为定量性的并且能够监测MAP感染载量。

从4名克罗恩病患者中也可获得手术切除样本。这些样本不仅允许检查肠道的较深层直到浆膜，还允许检查肠系膜中的较大的血管、淋巴管、额外的肠脂肪包覆以及区域淋巴结。与活检组织一样，这4名患者中每一名的粘膜和粘膜下层呈MAP强阳性。还发现MAP感染正好通过累及淋巴管、肌肉层之间的组织和浆膜本身的肠壁而扩展。在一些切片中，观察到充满染色的MAP生物体的淋巴管。

人们早就知道，克罗恩病的病理特征之一是被认为是自身免疫性的血管炎。诊断抗体显示增厚的这种血管的壁被还累及周围的血管周结缔组织的MAP广泛浸润。克罗恩病的另一个特征性病理特征是肠道周围的脂肪组织增加。这在末端回肠(在此被称为“脂肪包覆”)尤为明显。已知该脂肪的脂肪细胞是炎症标志物CRP(C-反应蛋白)的丰富来源。诊断方法显示出该组织中脂肪细胞的稀薄细胞质被MAP广泛感染。在脂肪内间质结缔组织的细胞中也观察到大量的MAP。还观察到MAP累及区域淋巴结。

还观察到测试的被诊断为患有肠易激综合征(IBS)的所有5人的肠道组织被MAP以与CD非常相似的方式广泛感染。在甲状腺炎和银屑病的病例中也观察到肠道内窥镜活检组织的MAP染色阳性。

2.动物肠道组织

对来自所有都被诊断为患有约内氏病(JD)的3只牛、1只绵羊、1只山羊、1只红鹿以及2只黇鹿的肠道组织样本进行了研究。如对于人样本所描述的，处理尸检样本并用一抗染色。来自所有动物的组织被通常以齐尔-尼尔森阳性表型存在的MAP广泛感染。将诊断患有约内氏病的这些动物的肠道中的MAP用A0X、A0XP、A4和XA4P抗体以及用XA1染色。动物中的MAP的显微镜下外观通常是经典的Z-N阳性分枝杆菌表型，但是本工作的单克隆抗体也证明了寡微生物形式(paucimicrobial form)的病原体。

患有约内氏病的动物的MAP的感染载量比在人体中发现的感染载量更重，这与公认的普通多杆菌形式(pluribacillary form)的JD保持一致。MAP表型本身与ZN阳性细胞一致。肠道的粘膜和固有层以及所有层都广泛累及。观察到由充满被MAP感染的白细胞的微脉管系统产生的细胞索。此外，如在人体中所见，增厚的血管炎血管壁和血管周组织被MAP感染的细胞浸润。在影响神经节细胞的神经血管束以及神经鞘中也观察到MAP感染。这与良好描述的被诊断患有JD的动物的肠神经系统的损伤一致，就像在被诊断患有CD的人中的一样。这5种反刍动物物种与人的肠道组织之间的显著差异是，A0XP广泛存在于这些动物肠道组织中，但似乎不存在于人肠道组织中。

3.人血液

与在人肠道组织中不同，A0XP(A0X的磷酸化形式)在人血液中广泛表达。A0XP(MVINDDAQRLL[pS]QR)是在IS900蛋白的胞外氨基末端区域中的A0X肽的丝氨酸磷酸化形式。XA4P(YLSALVSIRTDPS[pS]R)是在IS900蛋白的胞外羧基末端区域中的两个相邻的丝氨酸残基的远端被磷酸化的A4肽。在CD中，A0XP和XA4P在人血液中的含MAP的细胞内和表面上均表达。

这在P900多肽上提供了2对空间上可接近的互斥抗体用于流式细胞术，其中在氨基末端胞外结构域上为A0X/A0XP，羧基末端胞外结构域上为A4/XA4P。每对作为底物和产物以动态平衡存在，其总和提供了用于确定感染胞内MAP的外周血白细胞群的百分比的稳健信号。A0X/A0XP保持附着于MAP，或者可以释放于细胞内和受感染宿主细胞的表面上。A4/XA4P提供类似的信号，但A4可以离开被MAP感染的细胞并在细胞间贩运，因此含有A4/XA4P的细胞群包含含有MAP生物体的细胞群以及另外的通过细胞间运输而获得A4/XA4P的较小群。

在探索性研究中，使用直接荧光标记的A0X-FITC/A0XP-PC5.5和A4-FITC/XA4P-PC5.5对42名患有克罗恩病的人执行对常规EDTA临床血液样本的流式细胞术。所有人测试为MAP阳性，MAP阳性的循环白细胞总数的比例为从3.9％至47.1％不等。使用主要的血细胞谱系的表型标志物使得能够根据宿主细胞类型进行分类。使用A4/XA4P的比例通常大于使用A0X/A0XP的比例。A0X/A0XP和A4/XA4P的比率提供了磷酸化活性的测量。高比率的XA4P/A4倾向于是具有更高活性状态的患有克罗恩病的人的特征。在这类人中，可以观察到血液中用隔离的大量A4/XA4P完全覆盖的完整的单核细胞。

在24名患有克罗恩病的连续患者中进行第二次流式细胞术，以确定含有MAP的总循环白细胞的比例(％)。

将血液样本收集到标准EDTA真空采血管中。然后将100μl血液添加到所需数量的12×75mm圆底Falcon管中。将其与5μl Human Seroblock(Bio-Rad)一起孵育5分钟。将抗人CD45APC缀合的抗体(Beckman Coulter)添加到所有管中以使得能够在白细胞群上进行门控。然后将管的一半(标记为“表面染色”)用抗MAP单克隆抗体在室温下在暗处处理15分钟。然后将0.5 ml OptiLyse C(Beckman Coulter)红细胞裂解缓冲液添加到所有这些管中，并在室温下在暗处孵育10分钟。然后通过添加0.5 ml PBS洗涤细胞，并在325 G下离心5分钟，弃去上清液。

然后将所有管用100μl固定培养基A(Thermo Fisher Scientific)固定5分钟，然后如上洗涤。将未用抗MAP抗体染色的管(标记为“透化”)与Invitrogen透化培养基B(Thermo Fisher Scientific)一起孵育至团块，添加抗MAP单克隆抗体并在室温下在暗处中孵育15分钟，然后如上用PBS洗涤。然后用流动缓冲液PBS(不含Ca和Mg)、0.2％叠氮化钠以及2％牛血清白蛋白(BSA)将所有试管补足至1 ml。然后在对SSC与CD45进行门控的CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上获得样本，随后使用CytExpert软件(BeckmanCoulter)分析数据。

对24名患有克罗恩病的人的第二项研究的结果如下表所示(表2)。8名女性和16名男性的年龄在18至49岁之间。表中沿行的数字表示每个人中用相应的MAP抗体A0X单独、A0XP单独或A0X+A0XP两者，以及用A4单独、XA4P单独或A4+XA4P两者染色的总循环白细胞群的百分比。因为A0抗体保持附着于其靶肽的时间长于A4抗体保持附着于其靶肽的时间，所以将个人中A0数据的SUM作为对含有MAP的循环WBC的百分比的测量(突出显示的中心柱)。该SUM随着进展、临床过程以及对克罗恩病治疗的响应而变化，从而提供了对该特有的多拷贝插入元件所导致的致病性的促成因素的直接获取。

通过记录P900的体内功能的另一方面，来自A4、XA4P以及A4+XA4P的流式细胞术数据提供了MAP致病性的可能的促成因素的第二种直接见解。即，观察附着和释放的羧基末端的磷酸化和贩运的能力，所述附着和释放的羧基末端均具有如本工作中的下游丝氨酸磷酸化和上游配偶体磷酸化。

表1总结了从24名克罗恩病患者获得的流式细胞术数据，该数据基于表左侧上的在P900的胞外氨基末端上的单克隆抗体A0X和A0XP以及右侧上的在P900的胞外羧基末端上的A4和XA4P的使用。将每行中每位患者的数据分成与白细胞的表面结合(surf)以及与整个透化细胞结合(perm)。被MAP感染的细胞的总比例由通过单独A0X、单独A0XP以及A0X+A0XP(突出显示的)鉴定的分离的透化细胞群中的百分比％的总和给出。这是优选的测量，因为A0X肽倾向于保持与宿主细胞内的分枝杆菌细胞结合比A4肽时间更长。在表右侧是使用A4、XA4P以及A4+XA4P对细胞群染色的结果。在该研究中，使用了有力地预测的XA4P中的远端丝氨酸的磷酸化，但类似的研究可能靶向该对的磷酸化近端丝氨酸或双磷酸化。

当我们关注细节时，数据的潜力便汇集在一起。24名患者的组的总MAP载量百分比的范围为1.52％至48.9％，并且在该阶段表现出随疾病的活动而变化。MAP阳性细胞的百分比中的峰或谷可以遵循抗MAP治疗的开始。随着对数量更大的人进行测试，并伴随不同的疾病、特别是在“自身免疫和自身炎症”组中的疾病，以及伴随获得单个细胞类型的载量，将会出现更多的数据。从研究磷酸化事件的临床相关性和监测不同治疗的效果中也将获得更多的数据。

数据显示，在细胞表面上具有A0X/A0XP或两者的细胞比例约为一半。在透性化细胞中，具有A0X/A0XP的总细胞百分比与使用A4/XA4P的总细胞百分比接近一致，而在细胞表面上的A4/XA4P的总和远小于A0X/A0XP的总和。这与从细胞表面大量损失A4/XA4P一致，这其公认的流动性较大相符。研究这些磷酸化事件的影响将需要更大量的临床研究。

流式细胞仪系统是为了克罗恩病中的副结核感染而开发的第一个例子。流式细胞仪系统现在可用于研究其他疾病中的MAP感染，包括尤其是银屑病、甲状腺炎、帕金森病、1型糖尿病、关节炎、强直性脊柱炎、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、炎性肠病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、结节病、特发性肺纤维化和/或慢性疲劳综合征。对于克罗恩病和这些其他疾病，特别是“自身免疫病症”，MAP的存在是否有助于疾病的出现或进展将来自特异性抗MAP疗法是否导致缓解或治愈疾病。目前，针对MAP的治疗性T细胞疫苗正处于早期临床试验阶段。

3.2细胞学

用两种直接缀合的单克隆抗体的组合来对从外周血液中分离的细胞染色：A0X(FITC/绿色)+A0XP(Cy 5.5/红色)或A4(FITC/绿色)+XA4P(Cy 5.5/红色)。使用Leica SP-2共聚焦显微镜查看共聚焦图像，以JPEG格式记录和存储。

结果：外周血细胞在其染色模式中显示出相当大的异质性，细胞对于仅单一的抗体是阴性或阳性的，或者细胞对于两种抗体是阳性的。后一观察结果通过荧光报道分子的明确共定位来证明。虽然阳性细胞的表型尚有待确认，但DIC(微分干涉差)成像和流式细胞术数据指示了阳性细胞起源于非淋巴细胞。

4.动物血液

4.1猫

家猫(猫1)因体重减轻、腹泻、腹部饱胀以及全身情况较差而变得不适。临床受影响动物的腹部的超声扫描显示出整个结肠的壁增厚。兽医的内窥镜检查和活检组织在临床和组织学上显示，该动物患有炎性肠病。在4个月的时间内对2个EDTA血液样本执行流式细胞术。在猫中感染MAP的总循环白细胞的比例为7.6％和9.8％。来自猫1的内窥镜活检组织样本的免疫荧光显微检查证实了存在MAP，其组织学外观类似于在患有约内氏病的动物和患有克罗恩病的人中观察到的外观。

在此期间，一只新的小猫(猫2)被引入同一家庭。在从饲养员处购买时，该小猫在临床上是良好的。在引入该家庭一周后，小猫出现了出血性腹泻。常规粪便微生物学为阴性。在4个月的时间内再次对2个EDTA血液样本执行流式细胞术。感染MAP的循环白细胞的比例为16.4％和14.3％。这些数据证实了两只动物都有全身性MAP感染。

4.2奶牛

从4头奶牛中获得EDTA血液样本。这些动物是保持关闭20多年的奶牛群的一部分，该奶牛群没有已知的约内氏病临床病例。来自牛群的个体乳汁样本的间歇性ELISA测试显示，在多个阴性结果中，4头取样的牛中有1头具有2个阳性ELISA读数，而其他2头取样的牛具有1个阳性ELISA读数。第4头牛的乳汁的ELISA读数完全没有提高。使用单克隆抗体的A0X/A0XP和A4/XA4P对来对4个血液样本执行流式细胞术。结果显示，感染胞内MAP的这些动物的总循环白细胞群的比例为10.9％、36.3％、40.1％以及45.2％。该结果进一步指示了显著的全身性MAP感染在亚临床状态下持续存在的能力。该结果还证明，目前的诊断技术比常规诊断方法具有更高的灵敏度，并具备揭示由这些病原体造成的对动物和人类健康造成的长期威胁的真实规模的能力。

5.人母乳

一名3个月大的男童出现直肠出血和腹痛发作。他接受了调查，包括上下胃肠道内窥镜检查和多次活检，结果在8个月时确诊为克罗恩病。随后要求的并对其石蜡包埋的组织病理学块进行的MAP测试显示出胃和十二指肠以及在从末端回肠到直肠的所有活检组织中广泛感染了MAP。他的母亲没有克罗恩病，并且除了她自己的乳汁以外，从来没有喂过他任何东西。然而，她被诊断出患有遗传学上与克罗恩病相关的自身免疫性甲状腺炎。她要求的对挤出的50ml母乳样本进行的MAP测试显示出在离心团块中有大量的被MAP感染的细胞。

6.银屑病中的人皮肤样本

在局部麻醉下从各自被诊断患有银屑病的2名成人中获得3-4mm钻孔活检组织全厚皮肤样本。样本取自银屑病患者的皮肤病变的中央区域，以及另外的来自与正常皮肤重叠的病变外周的样本。还获得了病变之间的正常皮肤样本。按照标准程序将样本用福尔马林固定、加工并包埋在常规组织病理学块中。切下2μm的切片，固定在Vectabond显微镜载玻片上，进行抗原修复处理，用XA1/A4单克隆抗体染色并通过共聚焦显微镜来检查。

在两名成人中，取自银屑病病变内的活检组织均为MAP阳性。在增厚的表皮层中的炎性细胞中看到XA1和A4的金色共定位，其中染色持续到角质层中。染色在生发层中也是显著的。阳性MAP染色延伸到膜层(rete)中的整个炎性细胞和真皮内的炎性细胞中。在毛囊周围也看到了MAP阳性细胞。一个显著的相关特征是在毛囊-皮脂单位内存在MAP。

皮脂腺的异常可能促成银屑病斑块浅层的干燥、鳞状的性质。通过增厚的动脉壁和血管周围结缔组织内对这些病原体进行共定位XA1/A4染色，真皮中的另一个显著特征是MAP参与神经血管束。还看到了相邻神经束的MAP染色。从在银屑病斑块的外周取得的活检组织中的染色显示出MAP染色在斑块和正常皮肤之间的边界处停止。斑块之间的正常外观皮肤的活组织检查中也不存在MAP。这与MAP在银屑病斑块形成中的作用一致。

7.测量关节炎中MAP阳性细胞下滑膜关节液中的比例

患有银屑病的女性成年人在其右膝关节中出现不适和急性积液。无创伤史。关节温热且肿胀，但并不剧烈疼痛。其他关节未受影响。吸出20 ml淡黄色略带乳白色液体的样本并通过离心来分离细胞。洗涤这些细胞，并用荧光团标记的A0X/A0XP染色，并通过流式细胞术检查。关节液中的含MAP细胞的比例为8.56％。这与此时在其血液中的MAP阳性外周血白细胞的百分比相似。

实施例4：新型ChAdOx2疫苗的构建

基于以上结果，已经开发了实施例1中描述的hAd5 HAV疫苗，以在氨基末端包括另外的MAP肽。已经生产了两种新型疫苗：HAVX1和HAVX2。HAVX1和HAVX2是五基因疫苗，而HAV(Bull et al.2007 PLoS ONE 2(11):e1229；Bull et al.2014 Veterinary Research 45:112；上述实施例1)是四基因疫苗。HAVX1编码序列：

MTVTEVVVAQPVWAGVDAGKADHYCMVINDDAQRLLSQRVANDEAALLELIAAVTTLADGGEVTWAID

HAVX1表示正常的分枝杆菌外区域、跨膜区域和P900序列的第一个分枝杆菌内部分，该P900序列在假定的转座酶的活性位点机制缺失的情况下停止。它没有已知的毒性，并且在体内大量表达。

HAVX2编码序列：

MVINDDAQRLLSQRVDAGKADHYAVTTLADGGEVTWAID

HAVX2打乱正常序列，着重于N末端表位，并就在其浸入跨膜序列之前暴露出另一个T细胞表位。

这些重排预计不会引入任何风险，并且与安全处理的新型ChAdOx2 HAVX1和ChAdOx2 HAVX2疫苗构建体兼容。

序列表

<110> HAV疫苗有限公司

<120> 用于副结核病的免疫原性组合物

<130> N413293WO

<150> GB1811382.9

<151> 2018-07-11

<160> 146

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 213

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 1

atgaccgtga ccgaggtggt ggtggcccag cccgtgtggg ccggcgtgga cgccggcaag 60

gccgaccact actgcatggt gatcaacgac gacgcccaga ggctgctgag ccagagggtg 120

gccaacgacg aggccgccct gctggagctg atcgccgccg tgaccaccct ggccgacggc 180

ggcgaggtga cctgggccat cgacctgaac gcc 213

<210> 2

<211> 71

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 2

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Leu Ile Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

50 55 60

Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala

65 70

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 3

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10

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<211> 26

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 4

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala

1 5 10 15

Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Ile

20 25

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Phosphorylated A0X short peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> PHOSPHORYLATION

<400> 5

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10

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<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Phosphorylated A0X long peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> PHOSPHORYLATION

<400> 6

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala

1 5 10 15

Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Ile

20 25

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 7

Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 8

Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu

1 5 10 15

Asn Ala

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 9

Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val Asp Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Asp His Tyr

20

<210> 10

<211> 24

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 10

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr

20

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> X is a peptide linker, A, or AA

<400> 11

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Xaa Val

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp

20 25 30

<210> 12

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> X is a peptide linker, A, or AA

<400> 12

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Xaa Val

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu Asn

20 25 30

Ala

<210> 13

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> X is a peptide linker, A, or AA

<400> 13

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala

1 5 10 15

Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Ile Xaa Val Thr Thr Leu Ala

20 25 30

Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp

35 40

<210> 14

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> X is a peptide linker, A, or AA

<400> 14

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala

1 5 10 15

Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Ile Xaa Val Thr Thr Leu Ala

20 25 30

Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala

35 40 45

<210> 15

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> X is a peptide linker or C

<400> 15

Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val Asp Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Asp His Tyr Xaa Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu

20 25 30

Ser Gln Arg

35

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<211> 47

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> X is a peptide linker or C

<400> 16

Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val Asp Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Asp His Tyr Xaa Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu

20 25 30

Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Ile

35 40 45

<210> 17

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)..(25)

<223> X is a peptide linker or C

<400> 17

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Xaa Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

35

<210> 18

<211> 51

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)..(25)

<223> X is a peptide linker or C

<400> 18

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Xaa Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Leu Ile

50

<210> 19

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> X is a peptide linker or C

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(48)

<223> X is a peptide linker, A, or AA

<400> 19

Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val Asp Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Asp His Tyr Xaa Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu

20 25 30

Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Ile Xaa

35 40 45

Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu

50 55 60

Asn Ala

65

<210> 20

<211> 70

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)..(25)

<223> X is a peptide linker or C

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (52)..(52)

<223> X is a peptide linker, A, or AA

<400> 20

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Xaa Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Leu Ile Xaa Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp

50 55 60

Ala Ile Asp Leu Asn Ala

65 70

<210> 21

<211> 606

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 21

atgcctctgc tgaccatcgg cgatcagttc cccgcctacg agcttgaccg cgtgatcgcg 60

ggcgacctgt ccaaggtcga cgccaagcag cccggtgact acttcaccac cgtcaccagc 120

gaggaccacg ccggcaagtg gcgcgtggtg ttcttctggc ccaaggactt caccttcgtc 180

tgccccaccg agatcgccac cttcggcaag ctcaacgacg agttcgagga ccgcgacgcc 240

caggtgctcg gcgtctcgat cgacagcgag ttcgtccact tcaactggcg cgcccagcac 300

gaggacctga agaacctgcc gttcccgatg ctctcggaca tcaagcgcga actgagcctg 360

gccaccggtg ttctcaacgc cgacggcgtg gccgaccggg ccaccttcat cgtcgacccg 420

aacaacgaga tccagttcgt ctcggtcacc gcgggttcgg tgggccgcaa cgtcgaggaa 480

gtgctgcggg tgctggatgc gctgcagtcc gacgagctgt gcgcgtgcaa ctggcgcaag 540

ggtgacccga cgctgaacgc caccgaactg ctcaaggcct ctgcttaaaa gggcgaattc 600

gtttaa 606

<210> 22

<211> 195

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 22

Met Pro Leu Leu Thr Ile Gly Asp Gln Phe Pro Ala Tyr Glu Leu Asp

1 5 10 15

Arg Val Ile Ala Gly Asp Leu Ser Lys Val Asp Ala Lys Gln Pro Gly

20 25 30

Asp Tyr Phe Thr Thr Val Thr Ser Glu Asp His Ala Gly Lys Trp Arg

35 40 45

Val Val Phe Phe Trp Pro Lys Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu

50 55 60

Ile Ala Thr Phe Gly Lys Leu Asn Asp Glu Phe Glu Asp Arg Asp Ala

65 70 75 80

Gln Val Leu Gly Val Ser Ile Asp Ser Glu Phe Val His Phe Asn Trp

85 90 95

Arg Ala Gln His Glu Asp Leu Lys Asn Leu Pro Phe Pro Met Leu Ser

100 105 110

Asp Ile Lys Arg Glu Leu Ser Leu Ala Thr Gly Val Leu Asn Ala Asp

115 120 125

Gly Val Ala Asp Arg Ala Thr Phe Ile Val Asp Pro Asn Asn Glu Ile

130 135 140

Gln Phe Val Ser Val Thr Ala Gly Ser Val Gly Arg Asn Val Glu Glu

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Val Leu Arg Val Leu Asp Ala Leu Gln Ser Asp Glu Leu Cys Ala Cys

165 170 175

Asn Trp Arg Lys Gly Asp Pro Thr Leu Asn Ala Thr Glu Leu Leu Lys

180 185 190

Ala Ser Ala

195

<210> 23

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<212> DNA

<213> Mycobacterium avium

<400> 23

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accacgttgg cccaggtagc cgcttttctc ggcgaccatg cggcaagcca tcttgtctat 360

ggcgatgttg tgatgcgttc gacgaaaagc cggcatgccg gacctttcga cctcgaccgc 420

ctcctatttg agacgaattt gtgccaccaa tcgatctttt accgccgtga gcttttcgac 480

ggcatcggcc cttacaacct gcgctaccga gtctgggcgg actgggactt caatattcgc 540

tgcttctcca acccggcgct gattacccgc tacatggacg tcgtgatttc cgaatacaac 600

gacatgaccg gcttcagcat gaggcagggg actgataaag agttcagaaa acggctgcca 660

atgtacttct gggttgcagg gtgggagact tgcaggcgca tgctggcgtt tttgaaagac 720

aaggagaatc gccgtctggc cttgcgtacg cggttgataa gggttaaggc cgtctccaaa 780

gaacgaagcg cagaaccgta g 801

<210> 24

<211> 266

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 24

Met Thr Ala Pro Val Phe Ser Ile Ile Ile Pro Thr Phe Asn Ala Ala

1 5 10 15

Val Thr Leu Gln Ala Cys Leu Gly Ser Ile Val Gly Gln Thr Tyr Arg

20 25 30

Glu Val Glu Val Val Leu Val Asp Gly Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu

35 40 45

Asp Ile Ala Asn Ser Phe Arg Pro Glu Leu Gly Ser Arg Leu Val Val

50 55 60

His Ser Gly Pro Asp Asp Gly Pro Tyr Asp Ala Met Asn Arg Gly Val

65 70 75 80

Gly Val Ala Thr Gly Glu Trp Val Leu Phe Leu Gly Ala Asp Asp Thr

85 90 95

Leu Tyr Glu Pro Thr Thr Leu Ala Gln Val Ala Ala Phe Leu Gly Asp

100 105 110

His Ala Ala Ser His Leu Val Tyr Gly Asp Val Val Met Arg Ser Thr

115 120 125

Lys Ser Arg His Ala Gly Pro Phe Asp Leu Asp Arg Leu Leu Phe Glu

130 135 140

Thr Asn Leu Cys His Gln Ser Ile Phe Tyr Arg Arg Glu Leu Phe Asp

145 150 155 160

Gly Ile Gly Pro Tyr Asn Leu Arg Tyr Arg Val Trp Ala Asp Trp Asp

165 170 175

Phe Asn Ile Arg Cys Phe Ser Asn Pro Ala Leu Ile Thr Arg Tyr Met

180 185 190

Asp Val Val Ile Ser Glu Tyr Asn Asp Met Thr Gly Phe Ser Met Arg

195 200 205

Gln Gly Thr Asp Lys Glu Phe Arg Lys Arg Leu Pro Met Tyr Phe Trp

210 215 220

Val Ala Gly Trp Glu Thr Cys Arg Arg Met Leu Ala Phe Leu Lys Asp

225 230 235 240

Lys Glu Asn Arg Arg Leu Ala Leu Arg Thr Arg Leu Ile Arg Val Lys

245 250 255

Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Ala Glu Pro

260 265

<210> 25

<211> 417

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 25

cgatttcgcc gccaccgcca cgccgaaatc atcctgagca tgcccggatt cggcgtcatc 60

ctgggcgctg agttcctcgc cgccaccggc ggggacatgg ccgcattcgc ctccgccgac 120

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aacctcaaac gcccccgacg ctacgaccgg cgcctgctgc gcgcctgcta cctgtcggcc 240

ttggtcagca tccgcaccga cccctcctcg cgcacctact acgaccgaaa acgcaccgaa 300

ggaaaacgcc acacccaagc cgtcctcgcc ctggcccgcc gccgcctcaa cgtcctgtgg 360

gccatgctgc gcgaccacgc tgtctaccac cccgcaacca ctaccgcggc ggcttga 417

<210> 26

<211> 138

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium

<400> 26

Arg Phe Arg Arg His Arg His Ala Glu Ile Ile Leu Ser Met Pro Gly

1 5 10 15

Phe Gly Val Ile Leu Gly Ala Glu Phe Leu Ala Ala Thr Gly Gly Asp

20 25 30

Met Ala Ala Phe Ala Ser Ala Asp Arg Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Pro Val Pro Arg Asp Ser Gly Arg Ile Ser Gly Asn Leu Lys Arg

50 55 60

Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Arg Leu Leu Arg Ala Cys Tyr Leu Ser Ala

65 70 75 80

Leu Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Asp Arg

85 90 95

Lys Arg Thr Glu Gly Lys Arg His Thr Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala

100 105 110

Arg Arg Arg Leu Asn Val Leu Trp Ala Met Leu Arg Asp His Ala Val

115 120 125

Tyr His Pro Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala

130 135

<210> 27

<211> 402

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 27

cgatttcgcc gccaccgcca cgccgaaatc atcctgagca tgcccggatt cggcgtcatc 60

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aacctcaaac gcccccgacg ctacgaccgg cgcctgctgc gcgcctgcgt cagcatccgc 240

accgacccct cctcgcgcac ctactacgac cgaaaacgca ccgaaggaaa acgccacacc 300

caagccgtcc tcgccctggc ccgccgccgc ctcaacgtcc tgtgggccat gctgcgcgac 360

cacgctgtct accaccccgc aaccactacc gcggcggctt ga 402

<210> 28

<211> 133

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 28

Arg Phe Arg Arg His Arg His Ala Glu Ile Ile Leu Ser Met Pro Gly

1 5 10 15

Phe Gly Val Ile Leu Gly Ala Glu Phe Leu Ala Ala Thr Gly Gly Asp

20 25 30

Met Ala Ala Phe Ala Ser Ala Asp Arg Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu

35 40 45

Ala Pro Val Pro Arg Asp Ser Gly Arg Ile Ser Gly Asn Leu Lys Arg

50 55 60

Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Arg Leu Leu Arg Ala Cys Val Ser Ile Arg

65 70 75 80

Thr Asp Pro Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Asp Arg Lys Arg Thr Glu Gly

85 90 95

Lys Arg His Thr Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala Arg Arg Arg Leu Asn

100 105 110

Val Leu Trp Ala Met Leu Arg Asp His Ala Val Tyr His Pro Ala Thr

115 120 125

Thr Thr Ala Ala Ala

130

<210> 29

<211> 1335

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 29

gtgactgaag ccaatgagtg caactcggcg tcgcgaaagg tttcagtcgc ggttgagcaa 60

gacaccgcaa gactactgga gtgcgtgcac aagcgccccc agctcgcggc tgaaagcgga 120

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caggttttcg acccgcgcgc gaatgcactt aatgcgtggc gcttggtgtt ggcgagcggg 240

gtgatcctat ggcattcgtt tccgctcact ggacgtatgc cgtgggcgcc gttcgtccag 300

ttgcttggcc ttggatgcgt tgatggtttc tttgcggtct ccggctatct catcgtctcg 360

agctggcttc gcaacccgca tcccgcccaa tacttcaccg ctcgatgtct tcgtattctc 420

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gcccagggcg gttcggccgc gaaactactg atgtccggcg ctccgatcga gtatgtgcta 540

aaagacagtg cggtttggat ggttaagttc gatatcggtg gcacacctcg cgatattcca 600

gttgcgggta tttggaacgg ttctctgtgg acattgggtt gggaggtgct ttgctatatc 660

ggcgtagcag tatttggtat gctcggactt cttagtcgcc gttggttcgt tccagggata 720

ttgatcctgg cgctgtcgtg gtcggtgttc ttgccggcat ggggcggaat acacgcgatc 780

gcctccaatg ctgcgcgatt cgctgtgatg ttttcggccg gagcgttgct gtatcaattc 840

cgtaacgtga ttccggctcg gtggtccttc gttgccgtcg gcctcattat cgttgtggtt 900

tcctctgccg tgctgccgga ctaccggttg gtggcggccc ttccgatggc gtacctaatc 960

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ataaatccaa tcgctttctg cgcgatttct gtcgcagcta ttttgccgct cgccgcgctc 1140

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agttcaattg cgctagccaa tatggaagat ggtggatcag tcggccgctc aaatgacatt 1260

cccggaaggc gggcccgctt tattggcgag aaagccgaag atcctcccgc gccgagccca 1320

agaccggctt tgtaa 1335

<210> 30

<211> 444

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 30

Val Thr Glu Ala Asn Glu Cys Asn Ser Ala Ser Arg Lys Val Ser Val

1 5 10 15

Ala Val Glu Gln Asp Thr Ala Arg Leu Leu Glu Cys Val His Lys Arg

20 25 30

Pro Gln Leu Ala Ala Glu Ser Gly Cys Lys Gly Val Arg Ser Leu Ser

35 40 45

Asn Met Arg Arg Gly Glu Arg Pro Met Ser Leu Gly Gln Val Phe Asp

50 55 60

Pro Arg Ala Asn Ala Leu Asn Ala Trp Arg Leu Val Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Ile Leu Trp His Ser Phe Pro Leu Thr Gly Arg Met Pro Trp Ala

85 90 95

Pro Phe Val Gln Leu Leu Gly Leu Gly Cys Val Asp Gly Phe Phe Ala

100 105 110

Val Ser Gly Tyr Leu Ile Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn Pro His Pro

115 120 125

Ala Gln Tyr Phe Thr Ala Arg Cys Leu Arg Ile Leu Pro Gly Leu Trp

130 135 140

Ile Cys Leu Ile Leu Thr Ala Phe Val Ile Ala Pro Ile Gly Val Gly

145 150 155 160

Ala Gln Gly Gly Ser Ala Ala Lys Leu Leu Met Ser Gly Ala Pro Ile

165 170 175

Glu Tyr Val Leu Lys Asp Ser Ala Val Trp Met Val Lys Phe Asp Ile

180 185 190

Gly Gly Thr Pro Arg Asp Ile Pro Val Ala Gly Ile Trp Asn Gly Ser

195 200 205

Leu Trp Thr Leu Gly Trp Glu Val Leu Cys Tyr Ile Gly Val Ala Val

210 215 220

Phe Gly Met Leu Gly Leu Leu Ser Arg Arg Trp Phe Val Pro Gly Ile

225 230 235 240

Leu Ile Leu Ala Leu Ser Trp Ser Val Phe Leu Pro Ala Trp Gly Gly

245 250 255

Ile His Ala Ile Ala Ser Asn Ala Ala Arg Phe Ala Val Met Phe Ser

260 265 270

Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Gln Phe Arg Asn Val Ile Pro Ala Arg Trp

275 280 285

Ser Phe Val Ala Val Gly Leu Ile Ile Val Val Val Ser Ser Ala Val

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Leu Pro Asp Tyr Arg Leu Val Ala Ala Leu Pro Met Ala Tyr Leu Ile

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Ile Ala Ser Gly Ser Leu Ile His Asn Gln Arg Met Arg Phe Arg Thr

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Asp Leu Ser Tyr Gly Val Tyr Ile Tyr Ala Phe Pro Ile Gln Gln Val

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Leu Val Leu Cys Gly Phe Ala Glu Ile Asn Pro Ile Ala Phe Cys Ala

355 360 365

Ile Ser Val Ala Ala Ile Leu Pro Leu Ala Ala Leu Ser Trp Phe Leu

370 375 380

Val Glu Lys Pro Ala Leu Ser Trp Lys Ser Arg Leu Arg Arg Lys Asn

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Ser Ser Ile Ala Leu Ala Asn Met Glu Asp Gly Gly Ser Val Gly Arg

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Ser Asn Asp Ile Pro Gly Arg Arg Ala Arg Phe Ile Gly Glu Lys Ala

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<210> 31

<211> 585

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon Optimised ahpC

<400> 31

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gatctcaaga accttccatt ccccatgctc agcgacatca agagagaact gagcttggca 360

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ctgagagttc tcgacgcact tcagagtgat gaactgtgtg cctgcaattg gcggaaagga 540

gatcctactc tcaatgccac agagctgctt aaagcaagtg ctctc 585

<210> 32

<211> 195

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 32

Pro Leu Leu Thr Ile Gly Asp Gln Phe Pro Ala Tyr Glu Leu Thr Ala

1 5 10 15

Leu Ile Ala Gly Asp Leu Ser Lys Val Asp Ala Lys Gln Pro Gly Asp

20 25 30

Tyr Phe Thr Thr Val Thr Ser Glu Asp His Ala Gly Lys Trp Arg Val

35 40 45

Val Phe Phe Trp Pro Lys Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile

50 55 60

Ala Thr Phe Gly Lys Leu Asn Asp Glu Phe Glu Asp Arg Asp Ala Gln

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ser Ile Asp Ser Glu Phe Val His Phe Asn Trp Arg

85 90 95

Ala Gln His Glu Asp Leu Lys Asn Leu Pro Phe Pro Met Leu Ser Asp

100 105 110

Ile Lys Arg Glu Leu Ser Leu Ala Thr Gly Val Leu Asn Ala Asp Gly

115 120 125

Val Ala Asp Arg Ala Thr Phe Ile Val Asp Pro Asn Asn Glu Ile Gln

130 135 140

Phe Val Ser Val Thr Ala Gly Ser Val Gly Arg Asn Val Glu Glu Val

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Leu Arg Val Leu Asp Ala Leu Gln Ser Asp Glu Leu Cys Ala Cys Asn

165 170 175

Trp Arg Lys Gly Asp Pro Thr Leu Asn Ala Thr Glu Leu Leu Lys Ala

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Ser Ala Leu

195

<210> 33

<211> 729

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Modified Gsd

<400> 33

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<210> 34

<211> 243

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 34

Gly Ser Ile Val Gly Gln Thr Tyr Arg Glu Val Glu Val Val Leu Val

1 5 10 15

Asp Gly Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Asp Ile Ala Asn Ser Phe Arg

20 25 30

Pro Glu Leu Gly Ser Arg Leu Val Val His Ser Gly Pro Asp Asp Gly

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Pro Tyr Asp Ala Met Asn Arg Gly Val Gly Val Ala Thr Gly Glu Trp

50 55 60

Val Leu Phe Leu Gly Ala Asp Asp Thr Leu Tyr Glu Pro Thr Thr Leu

65 70 75 80

Ala Gln Val Ala Ala Phe Leu Gly Asp His Ala Ala Ser His Leu Val

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Tyr Gly Asp Val Val Met Arg Ser Thr Lys Ser Arg His Ala Gly Pro

100 105 110

Phe Asp Leu Asp Arg Leu Leu Phe Glu Thr Asn Leu Cys His Gln Ser

115 120 125

Ile Phe Tyr Arg Arg Glu Leu Phe Asp Gly Ile Gly Pro Tyr Asn Leu

130 135 140

Arg Tyr Arg Val Trp Ala Asp Trp Asp Phe Asn Ile Arg Cys Phe Ser

145 150 155 160

Asn Pro Ala Leu Ile Thr Arg Tyr Met Asp Val Val Ile Ser Glu Tyr

165 170 175

Asn Asp Met Thr Gly Phe Ser Met Arg Gln Gly Thr Asp Lys Glu Phe

180 185 190

Arg Lys Arg Leu Pro Met Tyr Phe Trp Val Ala Gly Trp Glu Thr Cys

195 200 205

Arg Arg Met Leu Ala Phe Leu Lys Asp Lys Glu Asn Arg Arg Leu Ala

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Leu Arg Thr Arg Leu Ile Arg Val Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser

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Ala Glu Pro

<210> 35

<211> 420

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 35

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agattggctg gagttgcagg tttggctcca gttccaagag attcagggag aatcagcggt 180

aacctcaaga gacctagacg ctacgacaga agactgctta gagcctgcta tctgagtgct 240

ttggttagca ttagaaccga cccctctagt cgaacctact acgataggaa gcggactgaa 300

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<210> 36

<211> 140

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 36

Arg Ile Arg Arg His Arg His Ala Glu Ile Ile Leu Ser Met Pro Gly

1 5 10 15

Phe Gly Val Ile Leu Gly Ala Glu Phe Leu Ala Ala Thr Gly Gly Asp

20 25 30

Met Ala Ala Phe Ala Ser Ala Asp Arg Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu

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Ala Pro Val Pro Arg Asp Ser Gly Arg Ile Ser Gly Asn Leu Lys Arg

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Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Arg Leu Leu Arg Ala Cys Tyr Leu Ser Ala

65 70 75 80

Leu Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Asp Arg

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Lys Arg Thr Glu Gly Lys Arg His Thr Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala

100 105 110

Arg Arg Arg Leu Asn Val Leu Trp Ala Met Leu Arg Asp His Ala Val

115 120 125

Tyr His Pro Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Arg Leu

130 135 140

<210> 37

<211> 405

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Modified P12

<400> 37

agaattcgga gacatagaca tgcagagatc atcctgagca tgcctggatt tggcgttatc 60

ctcggagctg aatttcttgc agcaacagga ggtgatatgg cagctttcgc atcagctgac 120

agattggctg gagttgcagg tttggctcca gttccaagag attcagggag aatcagcggt 180

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<211> 135

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 38

Arg Ile Arg Arg His Arg His Ala Glu Ile Ile Leu Ser Met Pro Gly

1 5 10 15

Phe Gly Val Ile Leu Gly Ala Glu Phe Leu Ala Ala Thr Gly Gly Asp

20 25 30

Met Ala Ala Phe Ala Ser Ala Asp Arg Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu

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Ala Pro Val Pro Arg Asp Ser Gly Arg Ile Ser Gly Asn Leu Lys Arg

50 55 60

Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Arg Leu Leu Arg Ala Cys Val Ser Ile Arg

65 70 75 80

Thr Asp Pro Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Asp Arg Lys Arg Thr Glu Gly

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Lys Arg His Thr Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala Arg Arg Arg Leu Asn

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Val Leu Trp Ala Met Leu Arg Asp His Ala Val Tyr His Pro Ala Thr

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Thr Thr Ala Ala Ala Arg Leu

130 135

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<211> 738

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Modified Mpa

<400> 39

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tggctcagaa accctcatcc agctcagtac ttcacagcca gatgtctcag aatccttcct 180

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ccaagggata ttcctgtcgc tggtatctgg aatggaagtt tgtggacccc agcatgggga 360

ggtattcatg ctatcgcttc caacgcttac cagttccgaa atgtgatccc tgcaagatgg 420

tctgtgagtt cagccgtgtt gccaaactat agacttgttg ctgctctccc catggcctac 480

cataatcagc gaatgaggtt tcggacagat ctgtcctatg gtgtgtacgg gttcgctgaa 540

atcaatccca tcgctctggt tgagaaacct gccctgtctt ggaaatccag actgagacgg 600

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tctcctagac ccgccttg 738

<210> 40

<211> 246

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 40

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Ala Val Leu Pro Asn Tyr Arg Leu Val Ala Ala Leu Pro Met Ala Tyr

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His Asn Gln Arg Met Arg Phe Arg Thr Asp Leu Ser Tyr Gly Val Tyr

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Gly Phe Ala Glu Ile Asn Pro Ile Ala Leu Val Glu Lys Pro Ala Leu

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Ser Trp Lys Ser Arg Leu Arg Arg Lys Asn Ser Ser Ile Ala Leu Ala

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Asn Met Glu Asp Gly Gly Ser Val Gly Arg Ser Asn Asp Ile Pro Gly

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Arg Arg Ala Arg Phe Ile Gly Glu Lys Ala Glu Asp Pro Pro Ala Pro

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Ser Pro Arg Pro Ala Leu

245

<210> 41

<211> 833

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vaccine polypeptide

<400> 41

Met Gln Ile Phe Val Lys Leu Pro Leu Leu Thr Ile Gly Asp Gln Phe

1 5 10 15

Pro Ala Tyr Glu Leu Thr Ala Leu Ile Ala Gly Asp Leu Ser Lys Val

20 25 30

Asp Ala Lys Gln Pro Gly Asp Tyr Phe Thr Thr Val Thr Ser Glu Asp

35 40 45

His Ala Gly Lys Trp Arg Val Val Phe Phe Trp Pro Lys Asp Phe Thr

50 55 60

Gly Pro Glu Ile Ala Thr Phe Gly Lys Leu Asn Asp Glu Phe Glu Asp

65 70 75 80

Arg Asp Ala Gln Val Leu Gly Val Ser Ile Asp Ser Glu Phe Val His

85 90 95

Phe Asn Trp Arg Ala Gln His Glu Asp Leu Lys Asn Leu Pro Phe Pro

100 105 110

Met Leu Ser Asp Ile Lys Arg Glu Leu Ser Leu Ala Thr Gly Val Leu

115 120 125

Asn Ala Asp Gly Val Ala Asp Arg Ala Thr Phe Ile Val Asp Pro Asn

130 135 140

Asn Glu Ile Gln Phe Val Ser Val Thr Ala Gly Ser Val Gly Arg Asn

145 150 155 160

Val Glu Glu Val Leu Arg Val Leu Asp Ala Leu Gln Ser Asp Glu Leu

165 170 175

Cys Ala Cys Asn Trp Arg Lys Gly Asp Pro Thr Leu Asn Ala Thr Glu

180 185 190

Leu Leu Lys Ala Ser Ala Leu Gly Ser Ile Val Gly Gln Thr Tyr Arg

195 200 205

Glu Val Glu Val Val Leu Val Asp Gly Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu

210 215 220

Asp Ile Ala Asn Ser Phe Arg Pro Glu Leu Gly Ser Arg Leu Val Val

225 230 235 240

His Ser Gly Pro Asp Asp Gly Pro Tyr Asp Ala Met Asn Arg Gly Val

245 250 255

Gly Val Ala Thr Gly Glu Trp Val Leu Phe Leu Gly Ala Asp Asp Thr

260 265 270

Leu Tyr Glu Pro Thr Thr Leu Ala Gln Val Ala Ala Phe Leu Gly Asp

275 280 285

His Ala Ala Ser His Leu Val Tyr Gly Asp Val Val Met Arg Ser Thr

290 295 300

Lys Ser Arg His Ala Gly Pro Phe Asp Leu Asp Arg Leu Leu Phe Glu

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Thr Asn Leu Cys His Gln Ser Ile Phe Tyr Arg Arg Glu Leu Phe Asp

325 330 335

Gly Ile Gly Pro Tyr Asn Leu Arg Tyr Arg Val Trp Ala Asp Trp Asp

340 345 350

Phe Asn Ile Arg Cys Phe Ser Asn Pro Ala Leu Ile Thr Arg Tyr Met

355 360 365

Asp Val Val Ile Ser Glu Tyr Asn Asp Met Thr Gly Phe Ser Met Arg

370 375 380

Gln Gly Thr Asp Lys Glu Phe Arg Lys Arg Leu Pro Met Tyr Phe Trp

385 390 395 400

Val Ala Gly Trp Glu Thr Cys Arg Arg Met Leu Ala Phe Leu Lys Asp

405 410 415

Lys Glu Asn Arg Arg Leu Ala Leu Arg Thr Arg Leu Ile Arg Val Lys

420 425 430

Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Ala Glu Pro Arg Ile Arg Arg His Arg

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Thr Tyr Tyr Asp Arg Lys Arg Thr Glu Gly Lys Arg His Thr Gln Ala

530 535 540

Val Leu Ala Leu Ala Arg Arg Arg Leu Asn Val Leu Trp Ala Met Leu

545 550 555 560

Arg Asp His Ala Val Tyr His Pro Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Arg

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580 585 590

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Pro Trp Ala Pro Phe Ile Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn Pro His Pro

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Ile Gly Ala Gln Gly Gly Ser Ala Ala Lys Leu Leu Met Ser Gly Ala

645 650 655

Pro Ile Glu Tyr Val Leu Lys Asp Ser Ala Val Trp Met Phe Lys Phe

660 665 670

Asp Ile Gly Gly Thr Pro Arg Asp Ile Pro Val Ala Gly Ile Trp Asn

675 680 685

Gly Ser Leu Trp Thr Pro Ala Trp Gly Gly Ile His Ala Ile Ala Ser

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Asn Ala Tyr Gln Phe Arg Asn Val Ile Pro Ala Arg Trp Ser Val Ser

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Ser Ala Val Leu Pro Asn Tyr Arg Leu Val Ala Ala Leu Pro Met Ala

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Tyr Gly Phe Ala Glu Ile Asn Pro Ile Ala Leu Val Glu Lys Pro Ala

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Leu Ser Trp Lys Ser Arg Leu Arg Arg Lys Asn Ser Ser Ile Ala Leu

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Gly Arg Arg Ala Arg Phe Ile Gly Glu Lys Ala Glu Asp Pro Pro Ala

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Asp

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Gly Pro Glu Ile Ala Thr Phe Gly Lys Leu Asn Asp Glu Phe Glu Asp

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Asn Glu Ile Gln Phe Val Ser Val Thr Ala Gly Ser Val Gly Arg Asn

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Gly Val Ala Thr Gly Glu Trp Val Leu Phe Leu Gly Ala Asp Asp Thr

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355 360 365

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485 490 495

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545 550 555 560

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565 570 575

Thr Ala Ala Ala Arg Leu Lys Leu Arg Arg Gly Glu Arg Pro Met Ser

580 585 590

Leu Gly Gln Val Phe Asp Pro Arg Ala Asn Ala Leu His Ser Phe Pro

595 600 605

Leu Thr Gly Arg Met Pro Trp Ala Pro Phe Ile Val Ser Ser Trp Leu

610 615 620

Arg Asn Pro His Pro Ala Gln Tyr Phe Thr Ala Arg Cys Leu Arg Ile

625 630 635 640

Leu Pro Gly Leu Trp Ile Gly Ala Gln Gly Gly Ser Ala Ala Lys Leu

645 650 655

Leu Met Ser Gly Ala Pro Ile Glu Tyr Val Leu Lys Asp Ser Ala Val

660 665 670

Trp Met Phe Lys Phe Asp Ile Gly Gly Thr Pro Arg Asp Ile Pro Val

675 680 685

Ala Gly Ile Trp Asn Gly Ser Leu Trp Thr Pro Ala Trp Gly Gly Ile

690 695 700

His Ala Ile Ala Ser Asn Ala Tyr Gln Phe Arg Asn Val Ile Pro Ala

705 710 715 720

Arg Trp Ser Val Ser Ser Ala Val Leu Pro Asn Tyr Arg Leu Val Ala

725 730 735

Ala Leu Pro Met Ala Tyr His Asn Gln Arg Met Arg Phe Arg Thr Asp

740 745 750

Leu Ser Tyr Gly Val Tyr Gly Phe Ala Glu Ile Asn Pro Ile Ala Leu

755 760 765

Val Glu Lys Pro Ala Leu Ser Trp Lys Ser Arg Leu Arg Arg Lys Asn

770 775 780

Ser Ser Ile Ala Leu Ala Asn Met Glu Asp Gly Gly Ser Val Gly Arg

785 790 795 800

Ser Asn Asp Ile Pro Gly Arg Arg Ala Arg Phe Ile Gly Glu Lys Ala

805 810 815

Glu Asp Pro Pro Ala Pro Ser Pro Arg Pro Ala Leu Arg Ile Pro Asn

820 825 830

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835

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<211> 406

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 43

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Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Leu Ile Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

50 55 60

Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly Arg Thr Val

85 90 95

His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu Gly Lys Thr Asp Ala Lys

100 105 110

Asp Ala Ala Ile Ile Ala Asp Gln Ala Arg Met Arg His Asp Leu Gln

115 120 125

Pro Leu Arg Ala Gly Asp Asp Ile Ala Val Glu Leu Arg Ile Leu Thr

130 135 140

Ser Arg Arg Ser Asp Leu Val Ala Asp Arg Thr Arg Ala Ile Asn Arg

145 150 155 160

Met Arg Ala Gln Leu Leu Glu Tyr Phe Pro Ala Leu Glu Arg Ala Phe

165 170 175

Asp Tyr Asn Lys Ser Arg Ala Ala Leu Ile Leu Leu Thr Gly Tyr Gln

180 185 190

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Leu Arg Lys Arg Lys Ala Arg Asn Ala Asp Thr Val Ala Ala Thr Ala

210 215 220

Leu Gln Ala Ala Asn Ala Gln His Ser Ile Val Pro Gly Gln Gln Leu

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Ala Ala Thr Val Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Ala Leu Asp

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Leu Gly Ala Glu Phe Leu Ala Ala Thr Gly Gly Asp Met Ala Ala Phe

290 295 300

Ala Ser Ala Asp Arg Leu Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala Pro Val Pro

305 310 315 320

Arg Asp Ser Gly Arg Ile Ser Gly Asn Leu Lys Arg Pro Arg Arg Tyr

325 330 335

Asp Arg Arg Leu Leu Arg Ala Cys Tyr Leu Ser Ala Leu Val Ser Ile

340 345 350

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355 360 365

Gly Lys Arg His Thr Gln Ala Val Leu Ala Leu Ala Arg Arg Arg Leu

370 375 380

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<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 44

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<213> Artificial Sequence

<220>

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<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Phosphorylated A4 peptide

<220>

<221> MOD_RES

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<223> PHOSPHORYLATION

<400> 46

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<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Phosphorylated A4 peptide

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(9)

<223> PHOSPHORYLATION

<400> 47

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<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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cttacagctc ttatcgctgg agatctgagt aaggttgacg ccaaacagcc cggcgattat 120

ttcactaccg ttaccagtga ggatcacgca ggtaaatgga gagtcgtctt cttctggcct 180

aaagacttca cctttgtgtg ccctactgag atcgcaacat tcgggaagct gaacgatgag 240

ttcgaagatc gagacgcaca ggttttgggc gtgtctatcg attccgagtt cgtgcacttc 300

aactggagag cacagcatga agatctcaag aaccttccat tccccatgct cagcgacatc 360

aagagagaac tgagcttggc aacaggtgtt ctgaatgctg atggcgttgc tgacagagca 420

acattcattg ttgaccccaa taacgagatc cagttcgttt ccgttactgc tggttctgtc 480

ggtagaaacg ttgaagaggt cctgagagtt ctcgacgcac ttcagagtga tgaactgtgt 540

gcctgcaatt ggcggaaagg agatcctact ctcaatgcca cagagctgct taaagcaagt 600

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ctcgttgttc attctggacc agatgatgga ccatacgacg ccatgaacag aggtgttgga 780

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attggacctt acaacctcag gtacagggtt tgggcagact gggatttcaa catcaggtgc 1080

ttctcgaacc cagctttgat cacacggtac atggatgttg tgatctccga gtacaacgat 1140

atgaccggct tctccatgag acagggaacc gacaaagagt tcaggaagcg cttgccaatg 1200

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gagaacagga gacttgctct caggactaga ctcatcaggg tcaaagcagt gtccaaggaa 1320

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ttcgcatcag ctgacagatt ggctggagtt gcaggtttgg ctccagttcc aagagattca 1500

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tgctatctga gtgctttggt tagcattaga accgacccct ctagtcgaac ctactacgat 1620

aggaagcgga ctgaaggtaa gagacatacc caggcagtgt tggcacttgc tagaagacgg 1680

cttaatgttc tgtgggctat gctgagagat catgccgtgt accatcctgc taccacaaca 1740

gctgctgcta gacttaagct tcgcagaggt gagagaccta tgagtcttgg ccaggtcttt 1800

gatcctagag ctaatgcact gcactctttc cctcttacag gacgcatgcc ttgggctcca 1860

tttatcgtta gttcctggct cagaaaccct catccagctc agtacttcac agccagatgt 1920

ctcagaatcc ttcctggtct ttggattgga gcacagggtg gttccgcagc taagctgttg 1980

atgagtggtg caccaatcga atacgtcctg aaagactcag cagtgtggat gttcaagttc 2040

gacattggag gaacaccaag ggatattcct gtcgctggta tctggaatgg aagtttgtgg 2100

accccagcat ggggaggtat tcatgctatc gcttccaacg cttaccagtt ccgaaatgtg 2160

atccctgcaa gatggtctgt gagttcagcc gtgttgccaa actatagact tgttgctgct 2220

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tccagactga gacggaagaa ctcttccatc gctctcgcaa acatggaaga tggtggtagt 2400

gttggaagga gtaacgacat ccctgggagg agggctagat ttattggtga gaaagccgaa 2460

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ga 2522

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Peptide

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 52

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20 25 30

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<212> PRT

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<220>

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Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu Leu Ile Ala Ala

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20

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

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1 5 10 15

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 55

Ile Pro Gly Ala Thr Val His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 56

Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu Leu Ile Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly Arg Thr Val His His Ala Ala

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Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

35

<210> 57

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 57

Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu Leu Ile Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly Ala Thr Val His His Ala Ala

20 25 30

Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

35

<210> 58

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 58

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

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Glu Leu Ile Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

50 55 60

Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly Arg Thr Val

85 90 95

His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

100 105

<210> 59

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 59

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Leu Ile Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

50 55 60

Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly Ala Thr Val

85 90 95

His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

100 105

<210> 60

<211> 77

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 60

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Asp

1 5 10 15

Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly

20 25 30

Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Ile Ala Leu Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly

50 55 60

Arg Thr Val His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

65 70 75

<210> 61

<211> 77

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 61

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Asp

1 5 10 15

Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly

20 25 30

Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Ile Ala Leu Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly

50 55 60

Ala Thr Val His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

65 70 75

<210> 62

<211> 968

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Vaccine polypeptide

<400> 62

Met Thr Val Thr Glu Val Val Val Ala Gln Pro Val Trp Ala Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala

20 25 30

Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Ala Asn Asp Glu Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Glu Leu Ile Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

50 55 60

Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu Ile Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly Ala Thr Val

85 90 95

His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu Ala Pro Val Lys Gln Thr

100 105 110

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

115 120 125

Gly Pro Met Gln Ile Phe Val Lys Leu Pro Leu Leu Thr Ile Gly Asp

130 135 140

Gln Phe Pro Ala Tyr Glu Leu Thr Ala Leu Ile Ala Gly Asp Leu Ser

145 150 155 160

Lys Val Asp Ala Lys Gln Pro Gly Asp Tyr Phe Thr Thr Val Thr Ser

165 170 175

Glu Asp His Ala Gly Lys Trp Arg Val Val Phe Phe Trp Pro Lys Asp

180 185 190

Phe Thr Gly Pro Glu Ile Ala Thr Phe Gly Lys Leu Asn Asp Glu Phe

195 200 205

Glu Asp Arg Asp Ala Gln Val Leu Gly Val Ser Ile Asp Ser Glu Phe

210 215 220

Val His Phe Asn Trp Arg Ala Gln His Glu Asp Leu Lys Asn Leu Pro

225 230 235 240

Phe Pro Met Leu Ser Asp Ile Lys Arg Glu Leu Ser Leu Ala Thr Gly

245 250 255

Val Leu Asn Ala Asp Gly Val Ala Asp Arg Ala Thr Phe Ile Val Asp

260 265 270

Pro Asn Asn Glu Ile Gln Phe Val Ser Val Thr Ala Gly Ser Val Gly

275 280 285

Arg Asn Val Glu Glu Val Leu Arg Val Leu Asp Ala Leu Gln Ser Asp

290 295 300

Glu Leu Cys Ala Cys Asn Trp Arg Lys Gly Asp Pro Thr Leu Asn Ala

305 310 315 320

Thr Glu Leu Leu Lys Ala Ser Ala Leu Gly Ser Ile Val Gly Gln Thr

325 330 335

Tyr Arg Glu Val Glu Val Val Leu Val Asp Gly Gly Ser Thr Asp Arg

340 345 350

Thr Leu Asp Ile Ala Asn Ser Phe Arg Pro Glu Leu Gly Ser Arg Leu

355 360 365

Val Val His Ser Gly Pro Asp Asp Gly Pro Tyr Asp Ala Met Asn Arg

370 375 380

Gly Val Gly Val Ala Thr Gly Glu Trp Val Leu Phe Leu Gly Ala Asp

385 390 395 400

Asp Thr Leu Tyr Glu Pro Thr Thr Leu Ala Gln Val Ala Ala Phe Leu

405 410 415

Gly Asp His Ala Ala Ser His Leu Val Tyr Gly Asp Val Val Met Arg

420 425 430

Ser Thr Lys Ser Arg His Ala Gly Pro Phe Asp Leu Asp Arg Leu Leu

435 440 445

Phe Glu Thr Asn Leu Cys His Gln Ser Ile Phe Tyr Arg Arg Glu Leu

450 455 460

Phe Asp Gly Ile Gly Pro Tyr Asn Leu Arg Tyr Arg Val Trp Ala Asp

465 470 475 480

Trp Asp Phe Asn Ile Arg Cys Phe Ser Asn Pro Ala Leu Ile Thr Arg

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His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

100 105

<210> 84

<211> 77

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vaccine polypeptide

<400> 84

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Asp

1 5 10 15

Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly

20 25 30

Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala Gly Gly Ala Ala Leu Leu

35 40 45

Ile Ala Leu Leu Ile Ala Ala Gly Gln Arg Leu Leu Tyr Ile Pro Gly

50 55 60

Ala Thr Val His His Ala Ala Gly Ser Tyr Arg Gly Glu

65 70 75

<210> 85

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 85

Glu Leu Ile Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val

1 5 10 15

<210> 86

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 86

Asp Arg Lys Arg Thr Glu Gly Lys Arg His Thr Gln Ala Val Leu

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<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 87

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1 5 10 15

<210> 88

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 88

Ala Lys Glu Val Met Ala Leu Asp Thr Glu Ile Gly Asp Thr Asp

1 5 10 15

<210> 89

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 89

Ala Leu Asp Thr Glu Ile Gly Asp Thr Asp Ala Met Ile Glu Glu

1 5 10 15

<210> 90

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 90

Gly Arg Ile Ser Gly Asn Leu Lys Arg Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Arg

1 5 10 15

Leu Leu Arg Ala Cys Tyr Leu Ser Ala Leu Val Ser Ile Arg Thr Asp

20 25 30

Pro Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Asp

35 40

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 91

Asn Lys Ser Arg Ala Ala Leu Ile Leu Leu Thr Gly Tyr Gln Thr Pro

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 92

Asn Leu Lys Arg Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Arg Leu Leu Arg Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Leu

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 93

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<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 94

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Cys

1 5 10

<210> 95

<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 95

Cys Asn Leu Lys Arg Pro Arg Arg Tyr Asp Arg

1 5 10

<210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 96

Cys Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg

1 5 10

<210> 97

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 97

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Cys

1 5 10 15

<210> 98

<211> 16

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 98

Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Cys

1 5 10 15

<210> 99

<211> 16

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<400> 99

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1 5 10 15

<210> 100

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu

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<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

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1 5 10

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

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Met Val Ile Asn Asp Asp Leu Gln Arg

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

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<220>

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Met Val Ile Asn Asn Asp Ala Glu

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

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<222> (1)..(1)

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<220>

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

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<220>

<221> MOD_RES

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

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<222> (1)..(1)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

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<222> (1)..(1)

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<220>

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<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

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<210> 114

<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

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<220>

<221> MOD_RES

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Asn Leu Arg Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Arg

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<210> 115

<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

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<222> (10)..(10)

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<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> 8branchedPolylysineOctamer

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<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

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Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg

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<211> 7

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> AMIDATION

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Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro

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<211> 9

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

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Ser Ile Arg Ser Asp Pro Ser Ser Arg

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<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

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<400> 120

Tyr Ser Ile Arg Ser Asp Pro Ala Ser Arg

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<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

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<400> 121

Val Ser Val Arg Tyr Asp Pro Ser Ser Arg

1 5 10

<210> 122

<211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> AMIDATION

<400> 122

Ile Ala Ile Arg Thr Asp Pro Ala Ser Arg

1 5 10

<210> 123

<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<400> 123

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Cys

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<210> 124

<211> 12

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<400> 124

Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Cys

1 5 10

<210> 125

<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<400> 125

Asn Leu Lys Arg Pro Arg Arg Tyr Asp Arg Cys

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<210> 126

<211> 11

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<400> 126

Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg Cys

1 5 10

<210> 127

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> AMIDATION

<400> 127

Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10 15

<210> 128

<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> AMIDATION

<400> 128

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

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<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> AMIDATION

<400> 129

Met Val Ile Asn Asp Asp Leu Gln Arg Ile Ile Leu Phe Leu

1 5 10

<210> 130

<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> AMIDATION

<400> 130

Met Ser Ile Asn Asp Asp Ala Gln Lys Leu Lys Asp Arg Leu

1 5 10

<210> 131

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Amide BSA conjugated

<400> 131

Cys Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10 15

<210> 132

<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> AMIDATION

<400> 132

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10

<210> 133

<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> AMIDATION

<400> 133

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg

1 5 10

<210> 134

<211> 21

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> ACETYLATION

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> BSA conjugated

<400> 134

Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr Trp Ala Ile

1 5 10 15

Asp Gly Lys Lys Cys

20

<210> 135

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> AMIDATION

<400> 135

Lys Lys Gly Ala Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

1 5 10 15

Trp Ala Ile Asp

20

<210> 136

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> AMIDATION

<400> 136

Lys Lys Gly Ala Ala Gly Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

1 5 10 15

Trp Ala Ile Asp

20

<210> 137

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> AMIDATION

<400> 137

Lys Lys Gly Ser Thr Val Ala Thr Met Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

1 5 10 15

Trp Ala Ile Asp

20

<210> 138

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> AMIDATION

<400> 138

Lys Lys Gly Gln Ala Val Thr Arg Leu Ala Asp Gly Gly Glu Val Thr

1 5 10 15

Trp Ala Val Asp

20

<210> 139

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> AMIDATION

<400> 139

Lys Lys Gly Phe Glu Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Thr Glu Val Ala

1 5 10 15

Thr Ser Pro Leu

20

<210> 140

<211> 16

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Amide BSA conjugated

<400> 140

Cys Tyr Leu Ser Ala Leu Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg

1 5 10 15

<210> 141

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> AMIDATION

<400> 141

Tyr Leu Ser Ala Leu Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg

1 5 10 15

<210> 142

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> AMIDATION

<400> 142

Tyr Leu Ser Ala Leu Val Ser Ile Arg Thr Asp Pro Ser Ser Arg

1 5 10 15

<210> 143

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> AMIDATION

<400> 143

Tyr Leu Ser Ala Leu Tyr Ser Ile Arg Ser Asp Pro Ala Ser Arg

1 5 10 15

<210> 144

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> AMIDATION

<400> 144

Tyr Leu Ser Ala Leu Val Ser Val Arg Tyr Asp Pro Ser Ser Arg

1 5 10 15

<210> 145

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium paratuberculosis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Biotinyl

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> PHOSPHORYLATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)

<223> AMIDATION

<400> 145

Tyr Leu Ser Ala Gln Ile Ala Ile Arg Thr Asp Pro Ala Ser Arg

1 5 10 15

<210> 146

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 146

Met Val Ile Asn Asp Asp Ala Gln Arg Leu Leu Ser Gln Arg Val Asp

1 5 10 15

Ala Gly Lys Ala Asp His Tyr Ala Val Thr Thr Leu Ala Asp Gly Gly

20 25 30

Glu Val Thr Trp Ala Ile Asp Leu Asn Ala

35 40