一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法

技术领域

本发明涉及一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法，属于禽白血病检测技术领域。

背景技术

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的鸡的肿瘤性疾病之一，自Roloff于1968年报道了欧洲发生的一例鸡“淋巴肉瘤”以来，禽白血病多发于禽类，给养禽业造成巨大的经济损失。p27蛋白是gag基因编码的禽白血病病毒的群特异性抗原，高度保守，是ALV 核心衣壳蛋白的主要成分，有许多易于检测的病毒抗原位点。在外源性ALV(A， B，C，D，J)各亚群间同源性高达90％。p27蛋白含量高，占病毒总蛋白成分的 30％以上，是制备检测抗体的首选抗原。

发明内容

基于上述，本发明提供一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接 ELISA方法，方法制备周期短，成本低，特异性及重复性好，敏感性高，具有良好的可靠性。

本发明的技术方案是：一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接 ELISA方法，包括以下步骤：

1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为免疫原，制备兔源、鼠源多克隆抗体；

2)对包被兔源多克隆抗体的酶标板进行洗涤，37℃封闭1h，洗板；

3)加入待检血清进行孵育，洗板；

4)加入鼠源多克隆抗体进行孵育，洗板；

5)加入酶标二抗进行孵育，洗板；

6)加入TMB显色液显色，最后加入显色终止液，终止反应；

7)利用酶标仪测定步骤6)酶标板孔中液体OD450nm值，根据临界值判定阴阳性。

可选的，所述禽白血病病毒为病毒RSA株。

可选的，所述一对引物的引物序列如下：

p27-EcoR I-F：CG

p27-Xba I-R：GC

可选的，所述包被兔源多克隆抗体的浓度为4μg/mL，包被条件为37℃2h 后4℃过夜。

可选的，所述待检血清的反应条件为37℃作用1h。

可选的，所述鼠源多克隆抗体的稀释倍数为1:400，反应条件为37℃作用0.5 h。

可选的，所述酶标二抗的反应时间为37℃作用1h。

可选的，所述显示的条件为37℃作用20min.

可选的，所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD

本发明的有益效果是：本发明建立的检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法，采用ALV p27蛋白制备兔源多克隆抗体和鼠源多克隆抗体，具有制备周期短，成本低，特异性及重复性好，敏感性高，可靠性好等优点，能够检测到禽白血病群特异性抗原，且与常见的禽类病毒不反应，为禽白血病的诊断、防控奠定了基础。

附图说明

图1细胞上清PCR扩增(A)、质粒菌液PCR鉴定(B)与双酶切鉴定(C)图谱， A：1，2：细胞沉淀，3：阴性对照；B：1，2，3，4：质粒菌液，5：阴性对照； C：1，2：重组质粒；

图2重组p27蛋白的SDS-PAGE鉴定，M：预染的蛋白分子量标准；1：菌液上清；2：菌体沉淀；

图3 ALV p27蛋白纯化结果，M：预染的蛋白分子量标准；1-5：50mmol/L 咪唑洗脱的杂蛋白；6-7：400mmol/L咪唑洗脱的纯化蛋白；8-9：500mmol/L咪唑洗脱的蛋白；

图4 p27重组蛋白的his单抗验证，M：预染的蛋白分子量标准；1，2分别为：已纯化、未纯化ALV p27蛋白；3：pColdⅠ；

图5兔抗ALV p27阳性血清的Western blot验证，M：预染的蛋白分子量标准；1：ALVp27蛋白；2：空白对照；

图6兔抗p27多抗纯化结果，M：预染的蛋白分子量标准；1：兔抗p27多抗纯化结果；

图7鼠抗p27多抗纯化结果，M：预染的蛋白分子量标准；1：鼠抗p27多抗纯化结果；

图8纯化的兔抗ALV p27多抗的Western blot验证，M：预染的蛋白分子量标准；1：ALV p27蛋白；2：空白对照。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

1、方法

1.1、P27基因引物的设计

根据GenBank中ALV RSA(GenBank登录号：M37980)株p27基因序列，设计了一对特异性扩增P27基因的引物，引物序列为：

p27-EcoR I-F：CG

p27-Xba I-R：GC

上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，目的基因扩增片段为757bp，下划线处分别为EcoR I、Xba I酶切位点。

1.2、原核表达载体pColdⅠ-ALV-A-P27的构建

取接种RSA株病毒后的DF-1细胞沉淀提取病毒RNA，并以此为模板反转录为cDNA进行ALV-A P27基因的PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳鉴定后，纯化回收PCR产物，将回收产物与原核表达载体pColdⅠ分别用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，并于16℃连接4h(连接酶SolutionI)，然后转化至大肠埃希菌 DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养 16～24h，挑单菌落摇菌12～14h，经菌液PCR进行鉴定，鉴定为阳性者，提取质粒进行双酶切验证，将验证为阳性的质粒命名为pColdⅠ-ALV-A-P27。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min；56℃退火30s；72℃延伸2min，共进行30个循环；最后72℃再延伸10min。

用设计的特异性引物对接种ALV的细胞沉淀进行扩增，产物经电泳检测，扩增出了约750bp大小条带(图1)。产物经纯化、连接、转化后，用菌液PCR 鉴定，也出现了预期大小的条带(图1)。提取鉴定结果为阳性的菌液的质粒，对重组质粒进行双酶切鉴定，结果出现了750bp和4700bp左右的两条特异性条带(图1)，将此重组质粒命名为pColdⅠ-ALV-A-P27。

1.3、重组蛋白的诱导表达

将重组质粒pColdⅠ-ALV-A-P27转化BL21感受态细胞，涂布Amp抗性平板，挑取单克隆37℃摇过夜后，按1：100的比例转接到5mL新鲜的LB液体培养基(含Amp 50μg/mL)中，37℃摇菌至OD

取经超声裂解离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，上清和沉淀在26kD处有特异性蛋白条带，与预期结果一致。表明重组蛋白在上清与沉淀中都有表达，但多以包涵体的形式进行表达。许多外源蛋白高水平表达后，往往以不溶的、无生物活性的包涵体形式存在。包涵体是新生肽链形成时，折叠中间体分子之间产生了不当的相互作用，造成中间体聚集在一起，形成的不溶的物质。本发明中P27蛋白在超声破碎后的上清和沉淀中均有表达，但多以包涵体的形式进行表达，这与现有文献的研究结果正好相反，究其原因可能是由于本发明中诱导温度偏低且使用的是冷休克表达载体pCold I所致。低温条件下菌体生长缓慢，蛋白质合成速率也相应的变慢，这样新合成的蛋白质就有充分的时间折叠，同时较低的培养温度重组蛋白的降解速率也会降低，重组蛋白的稳定性就会提高。然而过低的培养温度会导致重组蛋白基本停止表达或表达量极少。冷休克表达载体pCold I-IV，是利用冷休克基因cspA启动子设计的高效率蛋白质表达载体。CspA是一种冷休克蛋白，培养温度为37℃时几乎不表达，而当低温培养时能够有效地高效地调控重组蛋白的表达。

1.4、ALV p27蛋白的纯化

用咪唑PBS洗涤纯化，具体步骤如下：

(1)取3mL镍柱装入层析柱，用5mL 50mM PBS平衡镍柱；

(2)将超声裂解的加入层析柱，反复上样5次；

(3)用5mL 50mM咪唑PBS(沉淀表达的话咪唑PBS中都需要加入8mol 尿素，下同)洗涤镍柱，用1.5mL离心管每管收集1mL收集5管；

(4)用5mL 400mM咪唑PBS洗涤镍柱，用4mL离心管每管收集2.5mL 收集2管；

(5)用5mL 500mM咪唑PBS洗涤镍柱，用4mL离心管每管收集2.5mL 收集2管；

(6)洗涤液经SDS-PAGE进行验证。

在鉴定了ALV p27蛋白表达形式后，选择了菌液上清进行纯化，纯化后的结果如图3，由图可知ALV p27蛋白在400mmol/L咪唑浓度时洗脱量最大且条带单一。

1.5、ALV p27蛋白的Western blot鉴定

将ALV p27进行SDS-PAGE电泳后利用蛋白湿转仪将蛋白转至PVDF膜上，方法如下：

(1)SDS-PAGE电泳结束后，去除多余的胶，剪下与胶大小一致的PVDF 膜和滤纸，将PVDF膜置甲醇内活化1min后放入转膜缓冲液中备用。按负极- 垫子-凝胶-PVDF膜-垫子-正极的顺序于电转仪30v恒压转膜2h；

(2)电转结束后，将膜放入含5％脱脂奶粉的TBST中37℃恒温封闭1h；

(3)弃去脱脂奶粉后TBST洗膜3次，每次5-10min；

(4)分为三张膜，分别滴加1:1000倍稀释的His单抗、1:1000的兔抗p27 阳性血清、1:1000的纯化后的兔抗p27多抗，4℃摇床孵育过夜；

(5)回收一抗，TBST洗膜3次，每次5-10min；

(6)分别滴加1:1000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠，37℃孵育1h；

(7)弃去二抗，TBST洗膜3-5次，每次5-10min；

(8)ECL显色：将ECL超敏显色试剂盒中的A液和B液按同等比例稀释，滴加到PVDF膜上，避光显色2min，边缘吸干后置于仪器内显影并拍摄。

用His单抗作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠抗体为二抗，结果如图4。图中结果显示ALV p27重组蛋白能特异性的与his单抗结合且条带大小一致。

1.6、ALV p27蛋白的浓度测定鉴定

用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，具体步骤如下：

(1)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，将稀释液按20、19、18、16、12、8、4将上孔补足到20μL，即标准品浓度分别为0、 0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL；

(2)检测孔每孔加20μL样品；

(3)每孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30min；

(4)用酶标仪测定波长540-595nm之间的吸光度；

(5)绘制标准曲线计算测定样品浓度。

根据BCA试剂盒说明书进行测定，并绘制了标准曲线，按照标准曲线得出公式计算出纯化的兔源p27多抗浓度为2mg/mL。

1.7、ALV p27蛋白兔源、鼠源抗血清的制备

将ALV p27纯蛋白作为免疫原，以500μg/只的剂量免疫新西兰大白兔，100 ug/只免疫小鼠。制备兔源、鼠源多克隆抗体，步骤如下：

(1)取上述需要的蛋白量加入等体积的弗氏完全佐剂(第一次免疫使用弗氏完全佐剂)混合，使其充分混匀，然后将乳化彻底的免疫原用1mL一次性无菌注射器进行背部皮下多点注射免疫；

(2)间隔初次免疫14d后，进行第二次免疫，操作同上；

(3)第二次免疫14d后，进行第三次免疫，操作同上；

(4)第三次免疫间隔7d后，进行第四次免疫；

(5)在第四次免疫后7d，对新西兰大白兔耳静脉采全血，小鼠则进行眼球采血，在4℃，3500r/min离心10min分离血清，如果发现未析出完全，可进行重复操作，并对高免血清检测效价；

(6)当高免血清效价达到要求时即可通过心脏进行新西兰大白兔采血，小鼠照样进行眼球采血。

1.8、兔源、鼠源免疫血清效价的测定

免疫效果可由高免血清效价判定，多克隆抗体效价的测定常常采用间接 ELISA法，具体操作步骤如下：

(1)包被：将包被原稀释至1μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，或37℃培养箱内孵育2h；

(2)洗涤：倒去酶标孔内溶液，甩干，PBST洗3次，每次3min；

(3)封闭：每孔加200μL封闭液PBST，置于培养箱内37℃封闭2h；

(4)一抗倍比稀释；

(5)加一抗：酶标板洗好后，加梯度稀释好的一抗，100μL/孔，37℃培养箱内孵育30min；

(6)加二抗：酶标板洗好后，把HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(兔二抗)稀释2500倍加样，100μL/孔，37℃恒温烘箱内孵育30min；

(7)显色：酶标板洗好后，加TMB显色液，100μL/well，37℃恒温烘箱内孵育15min；

(8)终止：2M H

(9)读板：于酶标仪处读取OD

以P/N(阳性孔/阴性孔)≥2.1时抗体的稀释倍数作为兔、鼠抗血清的效价。

使用间接ELISA方法对兔源、鼠源ALV p27高免血清进行效价测定，由表1可知兔抗p27多抗血清效价达到1:320000，由表2可知鼠抗p27多抗血清效价达到1:64000。

表1兔源p27免疫血清效价测定结果

表2兔源p27免疫血清效价测定结果

1.9、兔源、鼠源抗ALV p27蛋白多抗血清的Western blot鉴定

方法同ALV p27蛋白的Western blot鉴定。

用1:1000倍稀释的兔抗ALV p27阳性血清作为一抗，HRP标记的山羊抗兔抗体为二抗，结果如图5。

1.10、兔源、鼠源多抗血清的纯化

具体操作步骤如下：

(1)准确吸取制备好的兔抗血清5mL，在4℃10000r下，离心10min，将上清吸出，加入50mL离心管中，再加入10mL pH 4.8的60mmol/L醋酸钠缓冲液，搅拌均匀；

(2)在室温下搅拌30min，并在期间逐滴加入辛酸，一般1mL稀释后的血清加入33μL的辛酸，然后静置5h(≥2h)，使其充分沉淀；

(3)将所得混合液在4℃，9500r/min离心30min，弃沉淀，保留上清，将上清液经滤纸过滤后，向上清中加入1/10体积的10×PBS缓冲液，调节pH值至 7～8；

(4)在4℃下将饱和硫酸铵缓慢地搅拌加入到上述混合液中，使溶液饱和度变成50％，搅拌至少30min，4℃静置1h以上；

(5)将混合液4℃9500r/min离心30min，弃去上清并保存沉淀；

(6)用适量的PBS溶解沉淀，并将溶液装入透析袋，放入大体积的PBS 中，4℃透析72h，透析期间更换3～5次PBS缓冲液；

(7)透析完全后，在4℃、10000r下，离心10min，弃去不溶性沉淀蛋白，最后将抗体分装至-20℃保存备用。

1.11、兔源、鼠源多克隆抗体纯度的测定

按照原核表达SDS-PAGE方法进行操作。

纯化结果如图6，按照相同方法，用醋酸-醋酸钠缓冲液②，第一步加入33μL /mL混合液加入辛酸后离心沉淀在底部，加入1/10体积的10×PBS缓冲液将pH 调到7～8，第二步饱和硫酸铵沉淀也是在底部。透析后经SDS-PAGE电泳验证结果，结果如图6。图中只出现两条带，分别是IgG的一条重链和一条轻链，约位于55kD和26kD处，说明抗体纯化成功。

按照已经摸索好的纯化抗体的条件对鼠源ALV p27多克隆抗体进行纯化，纯化结果如图7，图中也出现IgG的一条重链和一条轻链。

1.12、兔源、鼠源抗p27多抗浓度的测定

本文多抗浓度的测定采用BCA法。根据BCA试剂盒说明书进行测定，计算出纯化的兔多克隆抗体浓度为4.58mg/mL。

1.13、经辛酸-硫酸铵纯化的兔抗ALV p27多抗的Western blot鉴定

方法同ALV p27蛋白的Western blot鉴定。用1:600倍稀释的纯化的兔抗ALV p27多抗作为一抗，HRP标记的山羊抗兔抗体为二抗，结果如图8，纯化的兔源ALV p27多抗有良好的特异性。

2、双抗夹心间接ELISA方法的优化

2.1兔源多克隆抗体与鼠源多克隆抗体最佳工作浓度的确定

方阵试验确定抗P27兔源多克隆抗体与P27鼠源多克隆抗体最佳工作浓度。具体步骤如下：

(1)包被：用pH 9.6包被缓冲液将P27兔源多克隆抗体做8，4，2，1，0.5， 0.25，0.125，0.0625μg/mL 8个稀释梯度，100μL进行包被，横向包被12孔， 4℃包被过夜，用PBST振荡洗涤3次，每次3min，最后一次在吸水纸上拍干；

(2)封闭：5％脱脂奶粉封闭液，100μL/孔，除去各孔内的气泡，37℃作用 2h，洗涤3次后拍干；

(4)加样：将ALV病毒液和正常细胞上清(DF-1)相间加入酶标板中，100μL/ 孔，同时设置PBS空白对照，37℃作用1h，洗涤3次后拍干；

(5)加检测抗体：PBS稀释液将鼠源多克隆抗体做1：400，1：800，1：1600， 1：3200，1：6400，1：12800稀释，100μL/孔，每个稀释度做2列，37℃作用1h，洗涤3次后拍干；

(6)加HRP标记山羊抗小鼠二抗：加入1：10 000(V：V)倍PBS稀释的HRP 标记山羊抗小鼠酶标二抗，100μL/孔，37℃作用1h，洗涤3次后拍干；

(7)显色：加入底物(TMB)显色剂，100μL/孔，混匀，室温下避光显色15min；

(8)终止：加入2mol/L硫酸终止液，100μL/孔。

(9)测定：空白孔进行调零后，检测各孔的OD

(10)结果判定标准：以P/N值最大时，抗ALV p27兔源多克隆抗体和鼠源多克隆抗体的最大稀释度作为最佳工作浓度。

由表3看出选择兔源多抗包被浓度为4μg/mL，鼠源多抗稀释倍数为1:400为最佳包被抗体浓度和最佳检测抗体稀释倍数。

表3包被抗体与检测抗体最佳工作浓度的确定

2.2、酶标抗体工作浓度的确定

按以上优化好的条件封闭完成后加入ALV病毒液和正常细胞上清(DF-1)， 100μL/孔，37℃作用1h，洗涤后，加入最佳工作浓度的鼠源多克隆抗体，37℃作用1h，洗涤3次；将HRP标记的山羊抗小鼠做1：2 500，1：5 000，1：10 000， 1：20 000稀释，每组设3个阴性和阳性对照作为平行重复，100μL/孔，37℃作用1h，洗涤3次；加TMB显色15min，加入终止液终止反应。以P/N值最大为最佳酶标抗体工作浓度。

由表4看出选择酶标抗体稀释倍数为1:2500为最佳条件。

表3. 13酶标二抗稀释倍数的确定

2.3包被条件的确定

选择37℃2h，4℃过夜，37℃2h后4℃过夜共3种包被条件，每个条件做 3个重复，其他操作步骤同2.1。计算P/N值，取P/N最大值的包被条件为最佳包被条件。

由表5可知3个包被条件中4℃过夜为最佳条件。

表5包被时间的确定

2.4、封闭时间的确定

选择5％脱脂奶粉进行60min，90min，120min进行封闭时间的摸索，其他操作步骤同2.1。计算P/N的值，取P/N最大值为最佳优化条件。

由表6可知3个封闭条件中37℃封闭1h为最佳条件。

表6封闭时间的确定

2.5、抗原最佳作用时间的确定

选择30min，60min，90min进行抗原最佳作用时间的摸索，其他操作步骤同2.1。测定OD

由表6可知3个抗原作用时间条件中37℃作用1h为最佳条件。

表6抗原作用时间的确定

2.6检测抗体最佳作用时间的确定

由表7可知3个检测抗体作用时间条件中37℃作用0.5h为最佳条件。

表7鼠源抗体作用时间的确定

2.7酶标抗体最佳作用时间的确定

酶标抗体最佳稀释度的摸索选择30min，60min，90min进行最佳二抗作用时间的摸索，其他操作步骤同2.1。计算P/N的值，取P/N最大值为最佳优化条件。

由表8可知3个酶标抗体作用时间条件中37℃作用1h为最佳条件。

表8酶标二抗作用时间的确定

2.7、最佳显色时间的确定

选择10min，15min，20min进行最佳显色时间的摸索，其他操作步骤同2.1。计算P/N的值，取P/N最大值为最佳显色时间。

由表9可知3个显色时间条件中37℃作用20min为最佳条件。

表9显色时间的确定

2.8、阴阳性临界值的确定

取80份IDEXX试剂盒检测己确定的阴性血清，用已建立的间接ELISA方法检测，测定其OD

ALV p27双抗夹心ELISA反应条件优化结果如表10，按照该条件对80份阴性样品进行测定，由检测的数据统计，检测数据的平均数(X)为0.283，SD为0.0479，临界值为0.427。因此判定，OD

表10 ALV p27双抗夹心ELISA反应条件

3、检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法的具体步骤包括：

1)用禽白血病病毒RSA株p27基因序列设计一对引物以扩增p27基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白上清表达，上清表达经过纯化后作为免疫原，制备兔源、鼠源多克隆抗体；

2)对包被兔源多克隆抗体的酶标板进行洗涤，37℃封闭1h，洗板；

3)加入待检血清进行孵育，洗板；

4)加入鼠源多克隆抗体进行孵育，洗板；

5)加入酶标二抗进行孵育，洗板；

6)加入TMB显色液显色，最后加入显色终止液，终止反应；

7)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD450nm值，根据临界值判定阴阳性。

4、试验验证

4.1特异性实验

对FAdV、NDV、MDV、ALV进行检测，在检测的样品中仅ALV检测出阳性，特异性试验结果如表11，说明该方法具有良好的特异性。

表11 ALV p27双抗夹心ELISA特异性

4.2敏感性实验

用该实验中建立的ELISA方法对稀释样品做平行实验，该方法在1:160倍稀释是还是阳性，试验结果见表12，说明该方法的敏感性较强。

表12 ALV p27双抗夹心ELISA敏感性

4.3符合性实验

取待检测确定的61份泄殖腔棉拭子，92份细胞上清，92份蛋清做检测，92份血浆，其中IDEXX试剂盒检测出16份阳性泄殖腔棉拭子，阳性率26.23％(16/61)；细胞上清4 份阳性，阳性率4.35％(4/92)；蛋清20份阳性，阳性率21.74％(20/92)，血浆55份阳性，阳性率59.78％(55/92)。自己建立异源双抗夹心ELISA试剂盒检测出24份阳性泄殖腔棉拭子，与IDEXX试剂盒符合的有16份，阳性符合率100％(16/16)；细胞上清检测出5份阳性，其中4份与IDEXX试剂盒符合，符合率100％；蛋清检测出40份阳性，其中有17份阳性符合IDEXX检测结果，符合率85％(17/20)；血浆45份阳性，有28份符合IDEXX检测结果，符合率为50.91％(28/55)。

4.4重复性试验

按照优化好的反应条件进行ALV p27双抗夹心ELISA方法批内和批间差异试验，批内差异试验结果见表13。由表可知该ALV p27双抗夹心ELISA方法批内差异小于15％，有良好的重复性。

表13 ALV p27双抗夹心ELISA批内差异

批间差异试验结果见表14。由表可知该ALV p27双抗夹心ELISA方法批间差异小于15％，有良好的重复性。

表14 ALV p27双抗夹心ELISA批间差异

核苷酸序列表：

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一种检测禽白血病群特异性抗原的双抗夹心间接ELISA方法

<160> 2

<210> 1

<211> DNA

<212> 30

<213> 人工序列

<400> 1

CGGAATTCAT GCCTGTAGTG ATTAAGACAG 30

<210> 2

<211> DNA

<212> 28

<213> 人工序列

<400> 2

GCTCTAGACC TAGGGCTGGA TAGCAGAC 28