融合基因RIL-7重组牛痘病毒及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及融合基因RIL-7重组溶瘤牛痘病毒及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

1、免疫治疗日益成为肿瘤治疗的重要手段

总体而言，目前肿瘤罹患率和死亡率居高不下。现有的肿瘤治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗、中医等传统医学治疗手段等，然而其疗效亟待提升。

肿瘤病理过程中，肿瘤细胞与抗肿瘤免疫的相互作用，共同决定着肿瘤的发生和进展。肿瘤微环境中免疫细胞(尤其是抗肿瘤免疫的主力军T细胞)的数量和功能状态是影响肿瘤免疫治疗效果和患者转归的关键要素之一。依据肿瘤浸润T细胞的存在与否，将肿瘤分为“冷肿瘤”(即肿瘤组织内部和外周均缺乏T细胞等免疫细胞)和“热肿瘤”(即肿瘤组织内有大量免疫细胞浸润，T细胞等免疫细胞处于激活或耗竭状态)；依据肿瘤微环境中免疫细胞的数量和功能，可将免疫炎症型(即“热肿瘤”)、免疫豁免型(是指T细胞等免疫细胞仅能到达肿瘤细胞的外围基质，而不能迁移到肿瘤组织内)和免疫沙漠型(即“冷肿瘤”)。如果使得肿瘤微环境中具有数量足够、功能强大和作用持久的T细胞等免疫细胞，那将极大提高肿瘤的治疗效果。

由此，免疫治疗为肿瘤医治提供了新手段，也为肿瘤患者带来了新希望。肿瘤免疫治疗按技术原理可分为主动免疫治疗、被动免疫治疗以及在此基础上的复合人工手段等。主动免疫治疗是指通过提供肿瘤抗原，启动机体针对肿瘤细胞的主动免疫攻击，例如肿瘤疫苗等手段。被动免疫治疗是指通过抗肿瘤免疫应答产物的输注，使得患者被动获得抗肿瘤能力，例如过继输注T细胞、NK细胞等细胞治疗手段，以及输注PD-1抗体等体液免疫治疗手段。研究者还通过人工手段构建新型肿瘤治疗手段，例如将编码识别肿瘤抗原的抗体可变区和T细胞激活所需的第一信号及第二信号活化区的基因片段组合后导入T细胞，构建嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)等。

2、肿瘤免疫循环各个环节受阻是严重制约肿瘤免疫治疗效果的瓶颈

机体内抗肿瘤免疫效应的实现有赖于持续的肿瘤免疫循环。肿瘤免疫循环包括：①肿瘤细胞被杀死，释放肿瘤抗原；②抗原提呈细胞识别、摄取、加工处理肿瘤抗原；③抗原提呈细胞迁移至邻近淋巴组织器官；④抗原提呈细胞将肿瘤抗原提呈给抗原特异性T细胞，并使之活化、增殖分化为效应性T细胞；⑤效应性T细胞从淋巴组织器官迁移至肿瘤组织；⑥效应性T细胞杀死肿瘤细胞，释放更多肿瘤抗原。这些环节如能周而复始并持续放大即可实现有效的抗肿瘤效应。临床肿瘤治疗或临床实验研究表明，上述免疫治疗技术手段可不同程度地提高肿瘤治疗效果，但又受到严重制约。例如，PD-1单抗的总体有效率约为10％-30％左右，仍需要进一步提升疗效。诸多免疫治疗手段作用于肿瘤免疫循环的环节较为单一，往往顾此失彼。突破性地提升肿瘤免疫治疗效果的创新在于如何有效维持肿瘤免疫循环的持续性。

3、溶瘤病毒的概念、疗效和不足之处

溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)又称为条件性复制病毒或选择性复制病毒(conditionally replicative viruses)，能够选择性感染肿瘤细胞，并在其中复制，而在正常组织细胞中则无复制或杀伤作用。OV在肿瘤细胞内增殖，并裂解、杀死肿瘤细胞；释放出子代病毒颗粒进一步感染周围的肿瘤细胞，同时被OV杀死的肿瘤细胞释放肿瘤抗原可诱导特异性抗肿瘤免疫。由此建立的溶瘤病毒疗法即利用病毒选择性的在肿瘤细胞中复制，继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫效应的新型肿瘤疗法。与其他肿瘤治疗方法相比，溶瘤病毒疗法复制高效、杀伤效果好和毒副作用小。

然而，单一应用溶瘤病毒存在重大缺陷。溶瘤病毒作为病毒进入机体一段时间后，免疫系统发挥抗病毒效应将其清除。另外，病毒的安全性也是考量其临床应用潜能的重要指标。

4、牛痘病毒的优势和不足

溶瘤病毒可分为RNA病毒和DNA病毒。常见的RNA溶瘤病毒包括：新城疫病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒和呼长孤病毒等；常见的DNA溶瘤病毒包括：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒(Vaccinia Virus,VV)等。

牛痘病毒(VV)作为溶瘤病毒使用有巨大优势：①复制速度快，杀瘤能力强；②安全性好，和其它DNA病毒不同，VV仅在细胞质里复制，不会整合到宿主基因组，在基因和遗传层面安全性好；③基因组大，可以插入大片段的外源基因，利于改造；④有IMV(胞内成熟病毒)和EEV(胞外囊膜病毒)两种形态，这在病毒中是绝无仅有；IMV复制比较快，可以作为杀肿瘤的主力，EEV有一层保护性的包膜，使病毒不易被抗体攻击，可以在体内移动较远的距离，感染远处的肿瘤。

但同时，牛痘病毒(VV)作为溶瘤病毒单一使用也有不足之处：①VV在体内最终将被机体抗病毒免疫清除；②VV引发的抗肿瘤免疫应答同样会被患者体内的负性免疫机制所抑制；③VV引发的抗肿瘤免疫的全身性和记忆性优势有待进一步增强。

因此，牛痘病毒需要进行改建并采用抗肿瘤免疫增强因子进行“武装”(即重组入牛痘病毒基因组)，使之在感染肿瘤细胞同时表达多种免疫调控因子，提高溶瘤病毒的抗肿瘤效应，由此获得更为有效且持久的抗肿瘤效能。

5、细胞因子IL-7的优势和不足以及本发明构建的细胞膜锚定型IL-7的优势

白细胞介素-7(Interleukine-7，IL-7)，是一种可溶性细胞因子。人IL-7基因定位于8号染色体，其编码区全长为534bp，编码177个氨基酸残基的多肽，分子量约为20kDa。IL-7主要表达于胸腺、淋巴结、脾、骨髓等淋巴器官的上皮细胞和基质细胞等。IL-7受体(IL-7receptor，IL-7R)由IL-7Rα(CD127)和共同细胞因子受体γ链(CD132)组成。人IL7Rα基因位于5号染色体，编码439个氨基酸残基的多肽，分子量为49.5kDa。IL-7Rα表达于淋系造血细胞(包括T细胞、NK细胞和B淋巴细胞前体)、发育中的T细胞和B细胞以及巨噬细胞等。

IL-7/IL-7R通过激活PI3-K激酶、JAK-STAT等信号通路参与细胞增殖、分化和凋亡的调控。通过IL-7/IL-7R信号通路，可以调节T细胞的发育、分化、增殖及功能。IL-7可促进胸腺细胞发育，刺激初始T细胞增殖，维持T细胞功能多样性，增强效应性T细胞功能，诱导记忆性T细胞形成并延长记忆性T细胞的存活时间，抑制Treg细胞功能，并通过多种途径增强抗肿瘤免疫应答。

细胞因子具有对免疫系统作用高效性、多能性和网络性等诸多特点，是增强抗肿瘤免疫疗效的重要手段，极具临床应用前景。然而，全身性、大剂量使用细胞因子往往会产生各种毒副作用，甚至面临“细胞因子风暴”等潜在风险，这成为制约细胞因子类药物的临床应用的瓶颈。如细胞因子IL-7可增强抗肿瘤免疫效应，但也有其作为细胞因子的毒副作用的潜在风险。

如果通过技术手段在保持IL-7的生物学活性同时将IL-7锚定于细胞膜(即构建细胞膜锚定型IL-7)，那么既可规避野生型IL-7分泌至细胞外发生全身作用，从而提高安全性，又可将锚定型IL-7集中表达于肿瘤微环境中，从而提升局部作用浓度，并以细胞膜分子的形式作用于免疫细胞，从而提高生物学效能。然而，即便进行上述改进，如何实现细胞膜锚定型IL-7在肿瘤微环境中表达和发挥作用又是在应用层面需要解决的难题。

溶瘤病毒能够选择性感染并破坏肿瘤细胞，进而诱发抗肿瘤免疫的特性使其成为肿瘤免疫治疗的新领域，然而溶瘤病毒存在被机体清除的弱点，溶瘤病毒诱发的抗肿瘤免疫又面临抗肿瘤免疫循环已被阻断的共性问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种融合基因RIL-7重组牛痘病毒，及其在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述融合基因RIL-7重组牛痘病毒能够在促进抗肿瘤免疫应答的同时避免潜在的细胞因子风暴等不良反应，突破了抗肿瘤免疫细胞不易进入肿瘤组织以及抗肿瘤免疫易于被患者体内的负性免疫抑制的肿瘤免疫治疗瓶颈。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：融合基因IL-7(RIL-7)重组牛痘病毒，代号VV-RIL-7，是在牛痘病毒母本基因组(基因序列以GenBank:AY243312.1为基准)的第81001bp位置之后插入融合基因RIL-7及调控元件的基因序列后得到的重组牛痘病毒，其中，向牛痘病毒母本基因组中插入的基因序列见S1或S1’。

其中，所述融合基因RIL-7由以下三个基因片段连接而成：片段1为剔除终止密码的IL-7基因序列；片段2为连接肽基因序列，为EA3K刚性连接肽序列，或(G4S)3柔性连接肽序列；片段3为细胞膜锚定基因序列，是剔除起始密码的CD16b的GPI锚定序列；依据片段2连接肽基因的差异，所述融合基因RIL-7的碱基序列见S2或S2’。连接肽基因为EA3K刚性连接肽序列的，所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2，连接肽基因为(G4S)3柔性连接肽序列的，所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2’。

所述VV-RIL-7重组病毒的基因信息为：

1、构建VV-RIL-7重组溶瘤病毒所采用的牛痘病毒母本的基因序列以GenBank:AY243312.1为基准，以下陈述中提及的牛痘病毒母本的基因序列以此为基础。

2、通过重组载体(PV-RIL-7)将融合基因RIL-7与牛痘病毒母本进行同源基因重组。这一过程中，在牛痘病毒母本基因组的第81001bp位置之后，即位于胸苷激酶(TK)基因中间，插入RIL-7及相关调控元件，既破坏了完整的TK基因(敲除TK基因)，又实现了RIL-7的表达。由于相关调控元件中有重组病毒筛选使用的黄荧光蛋白(YFP)基因(基因两侧有loxp序列)，因而将上述重组病毒感染Cre基因转染的293T细胞，删除YFP，由此获得本发明中的RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7。与母本牛痘病毒(VV)的基因组相比，VV-RIL-7基因组中的TK基因内部插入了基因片段S1，S1基因序列如下(带下划线部分序列为RIL-7基因；3’至5’方向；其他序列为启动子等调控元件)：5’-agatcgataaaaattaattaattacccgggtaccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaac

上述S1序列为采用EA3K刚性连接肽序列为连接肽基因的，即所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2，如果采用(G4S)3柔性连接肽序列连接形成RIL-7，即所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2’，以此建立重组病毒VV-RIL-7，与母本牛痘病毒(VV)的基因组相比，VV-RIL-7基因组中的TK基因内部插入了基因片段S1’，S1’基因序列如下(带下划线部分序列为RIL-7基因，为3’至5’方向；其他序列为启动子等调控元件)：5’-agatcgataaaaattaattaattacccgggtaccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaac

本发明还公开了融合基因RIL-7的构建，所述融合基因RIL-7由以下三个基因片段连接而成：片段1为剔除终止密码的IL-7基因序列；片段2为连接肽基因，为EA3K刚性连接肽序列，或(G4S)3柔性连接肽序列；片段3为细胞膜锚定基因序列，是剔除起始密码的CD16b的GPI锚定序列；依据片段2连接肽基因的差异，所述融合基因RIL-7的碱基序列见S2或S2’。连接肽基因为EA3K刚性连接肽序列的，所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2，连接肽基因为(G4S)3柔性连接肽序列的，所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2’。

在构建融合基因RIL-7时，如采用EA3K刚性连接肽，所述融合基因RIL-7(采用EA3K刚性连接肽)的基因序列为S2，具体如下：其中片段1为删除终止密码的IL-7的基因序列，采用下划线标示；片段2为EA3K刚性连接肽基因序列，采用斜体表示；片段3为CD16b的GPI锚定序列，采用斜体下划线标示。

在构建融合基因RIL-7时，如采用(G4S)3柔性连接肽，则所述融合基因RIL-7的碱基序列为S2’，具体如下：其中片段1(删除终止密码的IL-7的基因序列)为下划线标示；片段2为(G4S)3柔性连接肽序列，采用斜体表示；片段3(CD16b的GPI锚定序列)为斜体下划线标示。

本发明建立的融合基因RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7，是插入编码细胞膜锚定型白细胞介素-7融合蛋白的基因，并敲除胸苷激酶(TK)基因的重组溶瘤牛痘病毒。所述融合基因RIL-7是由删除终止密码的白细胞介素-7基因、连接肽基因和CD16b细胞膜锚定序列拼接而成的融合基因。

其中，所述细胞膜锚定基因序列是人CD16b的GPI锚定序列。

所述VV-RIL-7由以下方法建立：

1)融合基因RIL-7的构建：通过PCR将删除终止密码的野生型IL-7基因序列、EA3K刚性连接肽序列或(G4S)3柔性连接肽序列，和人CD16b基因的GPI锚定序列拼接为一个新型的融合基因，命名为RIL-7融合基因；

2)融合基因RIL-7两翼导入限制性酶切位点：通过PCR在RIL-7融合基因的两翼导入SdaI和HpaI限制性酶切位点，分离基因片段；

3)牛痘病毒VV同源重组载体粘性末端的制备：使用SdaI和HpaI切割VV同源重组载体PV-1(含黄荧光YFP序列)，分离质粒片段；

4)融合基因RIL-7与VV同源重组载体PV-1粘性末端的连接：连接步骤2)和步骤3)中的回收产物；

5)转化感受态细胞并筛选阳性克隆：步骤4)的连接产物与感受态大肠杆菌共孵育，扩大培养后，抽提重组质粒，并经基因测序确认RIL-7融合基因正确克隆入同源重组载体PV-1，命名为PV-RIL-7；

6)融合基因RIL-7重组入VV基因组：VV在被感染复制的同时，PV-RIL-7与之进行同源重组；RIL-7融合基因片段以及黄荧光YFP序列同时被同源重组入VV基因组，形成重组病毒；与此同时，由于RIL-7插入VV基因组的位置在TK基因内部，TK基因被破坏(即TK基因被删除)；进而筛选单克隆重组VV，获得高纯度重组VV；

7)将所获得高纯度重组VV感染表达cre酶的293T细胞，切除重组VV基因组中的YFP基因，而后筛选单克隆重组VV，获得目的重组VV的种子并纯化。通过基因测序分析，确认正确的RIL-7融合基因重组入VV，获得RIL-7融合基因重组溶瘤牛痘病毒，命名为VV-RIL-7。

本发明还提供融合基因RIL-7重组牛痘病毒，即VV-RIL-7，在制备抗肿瘤药物方面的应用。所述融合基因RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7可单独使用在抗肿瘤药物的制备中，或与其他抗肿瘤药物或手段联合应用。

其中，所述融合基因RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7可用于制备治疗“免疫炎性型”肿瘤组织、“免疫沙漠型”肿瘤组织、“免疫豁免型”肿瘤组织的药物或产品。

其中，所述融合基因RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7可用于制备通过直接注射和结合内镜注射治疗体表肿瘤和深部肿瘤的药物和产品；

所述体表肿瘤包括但不限于黑色素瘤等存在于体表部位的实体瘤；

所述结合内镜注射治疗包括但不限于通过腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜、神经内镜等在清晰观察肿瘤瘤体的基础上，精确进行深部实体瘤的瘤内注射治疗。

其中，所述融合基因RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7可用于制备治疗各个临床分期的肿瘤治疗药物和产品，所述肿瘤包括但不限于胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤。

所述融合基因RIL-7即删除终止密码的白细胞介素-7基因、连接肽基因序列和人CD16b的GPI锚定基因序列所拼接的融合基因。

所述融合基因RIL-7由以下三个基因片段连接而成：片段1为剔除终止密码的IL-7基因序列；片段2为连接肽基因，为EA3K刚性连接肽序列，或(G4S)3柔性连接肽序列；片段3为细胞膜锚定基因序列，是剔除起始密码的CD16b的GPI锚定序列；依据片段2连接肽基因的差异，所述融合基因RIL-7的碱基序列见S2或S2’；

所述融合基因RIL-7可用于CAR-T的改造和制备；还可用于包括腺病毒、疱疹病毒、细小病毒、马拉巴病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、塞内加谷病毒、脊髓灰质炎病毒、甲病毒、寨卡病毒等其他类型的溶瘤病毒的改造和构建。

VV-RIL-7在制备肿瘤药物方面的应用，具有以下几个方面的态势和效果。

1、VV-RIL-7改善肿瘤微环境抗肿瘤免疫态势的应用

肿瘤细胞与抗肿瘤免疫的相互作用，共同决定着肿瘤的发生和进展。肿瘤微环境中免疫细胞(尤其是T细胞)的数量和功能状态是影响肿瘤免疫治疗效果和患者转归的关键要素之一。

VV-RIL-7主要通过溶瘤病毒的特性溶解局部肿瘤组织，启动免疫应答，在肿瘤局部建立肿瘤免疫的炎性环境，通过表达的RIL-7编码蛋白，增强和维持肿瘤组织“炎性环境”T细胞等免疫细胞的抗肿瘤功能状态。因而，VV-RIL-7对于三型免疫状态下的肿瘤组织具有作用：基于肿瘤微环境的免疫分型角度，VV-RIL-7可用于“免疫炎性型”肿瘤组织(即“热肿瘤”，已有T细胞等免疫细胞浸润)，使得“热肿瘤”更“热”，即进一步增强肿瘤微环境的免疫细胞数量和活力；VV-RIL-7可用于“免疫沙漠型”肿瘤组织(即“冷肿瘤”，肿瘤组织内部和周围均缺乏T细胞等免疫细胞)，使得“冷肿瘤”转换为“热肿瘤”，即促进T细胞等免疫细胞向肿瘤组织浸润，同时增强其抗肿瘤活力，也为联合PD-1单抗等免疫治疗创造条件；VV-RIL-7可用于“免疫豁免型”肿瘤组织(T细胞等免疫细胞存在于肿瘤组织外围，但不能浸润至肿瘤组织内部)，不仅促进免疫细胞突破各种障碍进入肿瘤组织，还促进免疫细胞抗肿瘤功能。

2、VV-RIL-7通过直接注射和结合内镜注射治疗体表和深部肿瘤

基于应用(给药)方式，VV-RIL-7可通过直接瘤内注射，用于黑色素瘤等一系列存在于体表部位的实体瘤；VV-RIL-7也可通过腹腔镜、胆道镜、胸腔镜、肠镜、神经内镜等，在清晰观察肿瘤瘤体的基础上，精确进行深部实体瘤的瘤内注射，直接溶解肿瘤细胞的同时激发抗肿瘤免疫应答。

3、VV-RIL-7用于治疗结直肠癌、胰腺癌和黑色素瘤等实体肿瘤的药物中

基于肿瘤类型角度，由于VV-RIL-7以直接溶瘤并启动和增强T细胞等免疫细胞效能为作用原理，因而VV-RIL-7可通过上述给药方式治疗各个临床分期的胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、脑胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤等。

本发明构建了融合基因RIL-7，进而构建重组牛痘病毒VV-RIL-7。为了将具有生物学功能的IL-7锚定于细胞膜并形成稳定的表达产物，通过分子设计，将删除了终止密码的白细胞介素-7基因、连接肽基因序列和删除了起始密码的人CD16b的GPI锚定基因序列进行拼接，构建成一个新型的融合基因，命名为RIL-7；进而将RIL-7重组入牛痘病毒基因组，构建成包含RIL-7基因序列的新型重组牛痘病毒，命名为VV-RIL-7；VV-RIL-7保留了VV的溶瘤特性，并在感染肿瘤细胞后能表达大量RIL-7编码的融合蛋白。RIL-7编码的融合蛋白既保留了IL-7促进抗肿瘤免疫的性能，也因其带有GPI锚定结构而成为膜分子，避免因野生型IL-7作为可溶性分子的全身作用导致的潜在风险，也使得IL-7局限在肿瘤组织(肿瘤微环境)集中发挥增强抗肿瘤免疫的治疗作用。

如前发明背景中所述，重组牛痘病毒如携带野生型IL-7感染肿瘤细胞的话，可使肿瘤细胞表达并分泌大量可溶性IL-7，这些可溶性IL-7可到达全身，增强抗肿瘤免疫效应，但不可避免的，也有其作为细胞因子的毒副作用的潜在风险。本发明中，通过刚性或柔性分子连接肽将野生型IL-7基因和细胞膜锚定基因序列连接，构建融合基因RIL-7，并导入同源重组载体，进而与牛痘病毒发生同源重组，构建重组牛痘病毒VV-RIL-7。与此同时删除了牛痘病毒胸苷激酶(TK)基因，使之更具安全性并进一步增强感染肿瘤细胞的选择性。

VV-RIL-7感染肿瘤细胞后，可在复制的同时表达大量的RIL-7编码的融合蛋白(即细胞膜锚定型IL-7)。由于RIL-7含有GPI锚定序列，RIL-7编码的融合蛋白可被锚定于细胞膜，被局限于肿瘤微环境中发挥作用。这样既可避免潜在的IL-7全身副作用，又可实现肿瘤组织局部IL-7高浓度表达，发挥更强的局部抗肿瘤效能。这是重组牛痘病毒VV-RIL-7的优势。

融合基因RIL-7重组牛痘病毒VV-RIL-7作为病毒本身可发挥直接溶瘤、启动抗肿瘤免疫的作用，其携带RIL-7基因所编码的蛋白可在肿瘤组织局部发挥高效能的免疫增强作用。。

本发明很好地实现了构建融合基因和重组溶瘤病毒，保留原有溶瘤病毒的优势和规避其弱点的技术效果。本发明将删除终止密码的白细胞介素-7基因、连接序列和人CD16b的GPI锚定基因序列拼接为一个融合基因RIL-7。而后将融合基因RIL-7通过同源重组导入牛痘病毒VV，建立重组牛痘病毒VV-RIL-7。重组牛痘病毒VV-RIL-7应用于肿瘤免疫治疗的药物中，在感染肿瘤细胞并获得溶解肿瘤细胞效应和促进肿瘤局部炎性环境的同时，表达锚定于细胞膜的RIL-7编码融合蛋白，使得IL-7活性物质集中且局限表达于肿瘤微环境，在促进抗肿瘤免疫应答的同时避免潜在的细胞因子风暴等不良反应，突破了抗肿瘤免疫细胞不易进入肿瘤组织以及抗肿瘤免疫易于被患者体内的负性免疫抑制的肿瘤免疫治疗瓶颈。

附图说明

图1是导入重组载体PV-1的基因片段以及PV-1载体的结构示意图。

图2是流式细胞术检测重组病毒感染后肠癌细胞MC-38表达的膜锚定型IL-7结果图。

图3是流式细胞术检测重组病毒感染后黑色素瘤细胞B16-F10表面的膜锚定型IL-7结果图。

图4展示了MTT法检测重组溶瘤病毒感染MC-38细胞后对静止T细胞增殖能力的影响。

图5展示了MTT法检测重组溶瘤病毒感染MC-38细胞后对活化T细胞增殖能力的影响。

图6是病毒滴度测定法比较各组重组溶瘤病毒在肿瘤细胞内的增殖能力结果图。

图7展示了MTT法体外检测和比较重组病毒的溶瘤能力。

图8是重组牛痘病毒VV-RIL-7治疗小鼠肠癌腹腔肿瘤模型的疗效观察结果。

图9展示了由两种连接肽连接的融合基因重组牛痘病毒的抗肿瘤效能的比较。

图10是流式细胞术检测重组溶瘤病毒VV-RIL-7等治疗后肿瘤微环境中T细胞的数量和比例图。

图11是细胞内细胞因子染色和流式细胞术检测重组溶瘤病毒VV-RIL-7等治疗后肿瘤微环境中T细胞产生干扰素-γ的结果图。

图12是流式细胞术检测重组溶瘤病毒VV-RIL-7等治疗后肿瘤微环境中T细胞表达PD-1的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

以下借助非限制性实施例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1、重组溶瘤牛痘病毒VV-RIL-7的建立

1)融合基因RIL-7的构建：通过PCR将删除终止密码的野生型IL-7的基因序列、EA3K刚性肽基因序列【或(G4S)3柔性连接肽序列】和人CD16b的GPI锚定基因序列连拼接为一个新型的融合基因，命名为RIL-7融合基因，[备注：后续的相关表述中，EA3K连接的RIL-7简称RIL-7/EA3K；(G4S)3连接的RIL-7简称RIL-7/(G4S)3。]。

2)融合基因RIL-7两翼导入限制性酶切位点：通过PCR在RIL-7融合基因的两翼导入SdaI和HpaI限制性酶切位点，采用回收试剂盒PCR产物后，使用SdaI和HpaI双酶切，凝胶电泳分离基因片段，切取预期大小片段，采用DNA凝胶电泳试剂盒分离基因片段备用。

3)VV同源重组载体粘性末端的制备：使用SdaI和HpaI切割VV同源重组载体PV-1(含黄荧光蛋白YFP基因序列)，凝胶电泳分离基因片段，切取预期大小片段，采用DNA凝胶电泳试剂盒分离质粒片段备用。

4)融合基因RIL-7与VV同源重组载体PV-1粘性末端的连接：采用T4-Liganse试剂盒连接步骤2)和步骤3)中的回收产物，16℃条件下连接2h。

5)转化感受态细胞并筛选阳性克隆：连接产物与感受态DH5α大肠杆菌共孵育30min，而后42℃热冲击90s，迅速加入800μL预冷LB培养基，37℃、125rpm温控摇床中培养90min后，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的半固体LB培养平板，37℃培养过夜，挑选单个菌落，扩大培养后，抽提重组质粒，并经基因测序确认RIL-7融合基因正确插入同源重组载体PV-1，命名为PV-RIL-7。

6)融合基因RIL-7重组入野生型牛痘病毒(VV)的基因组，构建新型重组溶瘤病毒：将绿猴肾细胞CV-1接种于24孔板，培养至丰度为80％左右。将脂质体和PV-RIL-7质粒共孵育20min后，与VV同时加入CV-1细胞培养上清。因此，VV在被感染CV-1细胞中复制的同时，PV-RIL-7与之进行同源重组。而RIL-7融合基因片段以及黄荧光蛋白YFP基因序列可同时被同源重组入VV基因组，同时敲除胸苷激酶(TK)基因，形成重组病毒。

7)筛选单克隆重组VV：消化步骤6)中VV感染和PV-RIL-7质粒转染的CV-1细胞，制备成单细胞悬液。根据重组病毒含有YFP序列，可表达黄荧光蛋白的特点，通过高速流式细胞分选术(sorting)，分选YFP阳性的CV-1细胞群体。以有限稀释法将YFP阳性的CV-1细胞按1个细胞/孔加入预先接种于96孔板的CV-1细胞中，培养72h后，在荧光显微镜下选取含有仅有单个溶斑且YFP阳性CV-1细胞的培养孔，收取细胞并反复冻融，获得含有重组病毒的种子。采用cre酶删除YFP基因后的重组病毒经基因测序确认后命名为VV-RIL-7，并进行后续功能鉴定分析(备注：部分需要YFP作为指示的实验采用未删除YFP的重组病毒)。

8)重组病毒的纯度分析：将步骤7)中所获含重组病毒的CV-1细胞冻融后裂解产物按常规病毒滴度检测法测定病毒滴度(pfu)后，按0.1、1、5MOI加入丰度为80％左右的CV-1细胞，72h后检测病毒溶斑表达YFP的比例，比例为100％方能确认为可用的高纯度重组VV。

9)VV-RIL-7的基因测序分析：取重组病毒VV-RIL-7感染的CV-1细胞，采用DNA纯化试剂盒获取DNA后进行基因测序，确认正确的RIL-7融合基因重组入VV。设立VV-D(敲除TK基因的VV)感染组作为对照。

10)VV-RIL-7感染肿瘤细胞后RIL-7融合基因的表达及细胞膜定位分析：重组病毒VV-RIL-7按不同的MOI浓度感染肠癌细胞MC-38、黑色素瘤细胞B16-F10等，收集病毒感染后的细胞制备单细胞悬液，通过抗IL-7单抗染色和流式细胞术在蛋白水平分析RIL-7融合蛋白是否定位于细胞膜及其表达量。

11)比较重组病毒VV-RIL-7与VV-D(仅敲除TK基因的VV)的杀瘤效应：重组病毒VV-RIL-7按MOI为0、0.1、1、5等浓度感染MC-38等肿瘤细胞，评估重组病毒是否保留了母本病毒的溶瘤能力。

12)VV-RIL-7感染肿瘤细胞后表达的RIL-7融合蛋白的体外功能分析：重组病毒VV-RIL-7按MOI为1、5等浓度感染MC-38等细胞，收集病毒感染后的细胞制备单细胞悬液，与PHA活化的T细胞共培养，在体外检测表达于细胞膜的RIL-7融合蛋白对免疫细胞的刺激作用。

13)采用肿瘤动物膜型分析VV-RIL-7的体内抗肿瘤效应：以MC-38等细胞接种于小鼠腹腔建立晚期、全身性荷瘤小鼠模型，于腹腔注射重组溶瘤病毒VV-RIL-7，观察小鼠的生存期。以MC-38等细胞接种于小鼠皮下构建荷瘤小鼠模型，于瘤内注射重组溶瘤病毒VV-RIL-7，观察肿瘤消长情况。设立实验对照组。备注：因为物种的因素，采用小鼠IL-7基因序列构建的VV-RIL-7进行体内实验验证。

图1是导入重组载体PV-1的基因片段以及PV-1载体的结构示意图。如图1所示，载体中TK 5’和TK 3’序列与牛痘病毒基因组部分序列同源，位于目的基因序列两翼。重组载体构建导入野生型牛痘病毒感染的宿主细胞，TK 5’和TK 3’序列可与野生型牛痘病毒基因进行同源重组，将载体中TK 5’和TK 3’之间的基因序列导入牛痘病毒基因组，构建重组病毒。

其中，MCSn

实施例2重组溶瘤病毒感染肿瘤细胞表达免疫因子RIL-7的测试

图2是RIL-7融合基因重组溶瘤病毒感染MC-38细胞后，采用流式细胞术检测细胞膜IL-7表达的结果图。图2中所示是为了确认重组溶瘤病毒VV-RIL-7所携带的RIL-7基因编码的融合蛋白能否锚定于细胞膜。将VV-RIL-7重组溶瘤病毒感染MC-38细胞后，采用抗IL-7单克隆抗体染色和流式细胞术检测细胞膜IL-7表达。结果显示，重组入RIL-7基因后的VV-RIL-7感染组的肠癌细胞MC38细胞膜表面检测到膜锚定型IL-7的存在，而VV-D(仅敲除TK基因的VV)、重组入编码可溶性IL-7基因的病毒(VV-IL-7)感染后的MC38细胞表面无膜锚定型IL-7的存在。这证明了融合基因RIL-7插入重组病毒VV-RIL-7后，通过感染肿瘤细胞能实现在肿瘤细胞表面表达膜锚定型IL-7融合蛋白。

图3是融合基因RIL-7重组溶瘤病毒感染B16-F10细胞后，采用流式细胞术检测细胞膜IL-7表达的结果图。按不同病毒感染复数(MOI)0、0.1、1、5感染对数生长期的肠癌细胞株MC-38和黑色素瘤细胞B16-F10，24h后消化细胞，制备单细胞悬液，采用兔抗IL-7单克隆抗体和荧光素标记抗兔Ig多抗标记，流式细胞术分析IL-7的表达。这一实验是为了验证来自图2的实验结果的普遍性。采用黑色素瘤细胞B16-F10作为靶细胞，重复图2中的病毒感染过程，得到了类似结果，证实了重组病毒VV-RIL-7感染不同肿瘤细胞后，能实现在肿瘤细胞表面表达膜锚定型IL-7融合蛋白。

图2和图3结果表明，携带融合基因RIL-7的重组牛痘病毒VV-RIL-7感染后的肿瘤细胞能表达膜型IL-7，且表达强度随感染指数(MOI)的增加而提高。该结果确认了本发明构建的重组牛痘病毒可携带RIL-7基因并在感染肿瘤细胞后表达膜型IL-7。

其中，YFP：黄荧光蛋白，用于示踪病毒感染细胞；

VV-D：敲除TK基因的牛痘病毒感染组；

VV-IL-7：VV-IL-7重组牛痘病毒感染组，感染后肿瘤细胞可表达野生型IL-7基因；

VV-RIL-7：VV-RIL-7重组牛痘病毒感染组，感染后肿瘤细胞可表达融合基因RIL-7的编码蛋白(即IL-7、连接肽和GPI锚定区融合蛋白)，该区融合蛋白将被锚定于肿瘤细胞膜。

实施例3生物学活性测试

为了鉴定重组牛痘病毒所携带的融合基因RIL-7表达产物是否具有生物学活性，本实验从脾脏细胞获取T细胞，分为静止T细胞组和PHA活化T细胞组分别接种于96孔板，同时采用不同的重组牛痘病毒按MOI＝1感染MC-38细胞24h后，消化制备单细胞悬液，PBS洗涤后按比例加入静止T细胞组和PHA活化T细胞组，共孵育48h后，采用MTT法检测各组OD(光密度)值。结果表明，携带RIL-7基因的重组牛痘病毒感染后的肿瘤细胞可有效刺激静止和活化T细胞增殖，这一效应可被抗IL-7中和抗体阻断进一步证明了融合基因RIL-7表达产物的生物学作用。

其中：PHA：植物血凝素，用于活化T细胞；

T：T细胞；

A：抗IL-7中和抗体

MC38-VV-D：VV-D感染的MC-38细胞；

MC38-VV-IL-7：VV-IL-7重组牛痘病毒感染MC-38细胞；

MC38-VV-RIL-7：VV-RIL-7重组牛痘病毒感染MC-38细胞。

图4所示的是MTT法检测重组溶瘤病毒感染MC-38细胞后对静止T细胞增殖能力的影响。为了通过体外实验检测重组溶瘤病毒所携带的RIL-7基因编码的膜锚定型IL-7分子对于静止T细胞是否具有生物学活性，将VV-RIL-7感染后的MC-38细胞采用丝裂霉素预处理后，与静止T细胞共培养，采用MTT法检测T细胞增殖能力。结果表明VV-RIL-7感染后的MC-38细胞可以促进T细胞增殖，这一效应可被抗IL-7中和抗体阻断，表明融合基因RIL-7重组入VV后表达的膜锚定型IL-7分子对于T细胞是具有生物学活性的。

图5所示的是MTT法检测重组溶瘤病毒感染MC-38细胞后对PHA活化T细胞增殖能力的影响。为了通过体外实验检测重组溶瘤病毒所携带的RIL-7基因编码的膜锚定型IL-7分子对于活化后的T细胞是否具有生物学活性，将VV-RIL-7感染后的MC-38细胞采用丝裂霉素预处理后，与PHA活化的T细胞共培养，采用MTT法检测T细胞增殖能力。结果表明VV-RIL-7感染后的MC-38细胞可以促进活化T细胞增殖，这一效应也可被抗IL-7中和抗体阻断，进一步表明融合基因RIL-7重组入VV后表达的膜锚定型IL-7分子对于T细胞是具有生物学活性的。

实施例4比较各组重组溶瘤病毒在宿主细胞内的增殖能力

为确认基因重组对牛痘病毒在肿瘤细胞内复制增殖能力的影响，将各重组病毒分别感染MC-38细胞和B16-F10细胞，分别于感染后24h、48h和72h收取细胞，反复冻融并稀释后感染绿猴肾细胞CV-1，通过溶斑法测定病毒产量。如图6所示的是比较各组重组病毒在宿主细胞内的增殖能力，其中，a是感染MC-38细胞的，b是感染B16-F10细胞。结果表明，各组病毒感染肿瘤细胞后产生的病毒滴度无明显差异，说明重组入RIL-7对病毒自身的增殖复制能力无影响。

实施例5体外实验比较基因重组对牛痘病毒杀伤肿瘤细胞能力的影响

为确认本发明中基因重组对病毒溶瘤效应是否产生影响，本实验将各重组病毒按不同MOI(0、0.1、0.5和5)感染MC-38细胞和B16-F10细胞，48h后MTT法检测活细胞比例。如图7所示的是体外实验比较基因重组对牛痘病毒杀伤肿瘤细胞能力的影响，a是感染MC-38细胞的，b是感染B16-F10细胞。结果显示，各组病毒感染肿瘤细胞后产生的溶瘤能力无明显差异，说明重组入RIL-7对病毒自身的溶瘤能力无影响，基因重组并不影响病毒体外杀伤能力。

实施例6重组牛痘病毒VV-RIL-7治疗小鼠肠癌肿瘤模型的疗效检测

本发明中融合基因RIL-7重组入牛痘病毒基因组，构建了新型病毒VV-RIL-7重组牛痘病毒。为了鉴定VV-RIL-7治疗肿瘤的疗效，采用肿瘤细胞MC-38建立小鼠(C57/BL6品系小鼠)肠癌腹腔模型，于肿瘤模型建立第9天，采用重组病毒VV-RIL-7进行腹腔注射治疗，并设立以下对照治疗组：VV-IL-7(插入编码可溶性IL-7的基因、同时敲除TK基因的重组VV)、VV-D(敲除TK基因的重组VV)和磷酸盐缓冲液治疗组(PBS)进行腹腔注射治疗，观察小鼠的生存时间。图8是重组牛痘病毒VV-RIL-7治疗小鼠肠癌腹腔肿瘤模型的疗效观察结果。结果表明(图8a)，和PBS比较，VV-D可有效延长荷瘤小鼠生存时间；与VV-D治疗组比较，野生型IL-7重组牛痘病毒(VV-IL-7)和RIL-7重组牛痘病毒(VV-RIL-7)均可延长荷瘤小鼠生存时间；而VV-RIL-7治疗组疗效优于VV-IL-7组。

为观察上述治疗后产生的抗肿瘤免疫记忆效应(抗肿瘤效应的持久性)，取治愈组小鼠(小鼠存活90天以上)，同时设立正常小鼠作为对照，于小鼠一侧胁腹部皮下注射MC-38细胞(图8b)，对侧注射B16-F10细胞(图8c)，隔天测量肿瘤长径(L)和短径(R)，按公式π/6×L×R×R计算肿瘤体积。结果表明(图8b、c)，MC-38荷瘤小鼠模型肿瘤经重组病毒VV-RIL-7治愈后，采用同样肿瘤(MC-38)接种均不再形成肿瘤，而接种其他肿瘤(B16-F10)仍能形成肿瘤；而相同数量MC-38细胞和B16-F10细胞在对照组C57/BL6品系小鼠中均能形成肿瘤并持续生长。上述结果表明，治愈组小鼠产生了持久且特异性抗肿瘤免疫记忆，而对照组小鼠无抗肿瘤能力，证明了采用重组溶瘤病毒VV-RIL-7可诱发机体产生特异性抗肿瘤免疫记忆。

因此，本发明建立的重组溶瘤病毒VV-RIL-7可提高并引发持久的抗肿瘤能力。

实施例7不同连接肽基因连接而成的RIL-7基因所构建的重组溶瘤牛痘病毒抗瘤效能的比较

由于本发明中，融合基因RIL-7是三个基因片段连接而成：片段1是删除终止密码的野生型IL-7的基因序列；片段2是EA3K刚性连接肽序列或(G4S)3柔性连接肽序列；片段3是CD16b的GPI锚定序列。为了鉴定使用不同的片段2连接成的RIL-7的生物学功能是否存在差异，将采用EA3K刚性连接肽序列构成的RIL-7进一步命名为RIL-7/EA3K，以此建立的重组牛痘病毒命名为VV-RIL-7/EA3K；将采用(G4S)3柔性连接肽序列构成的RIL-7进一步命名为RIL-7/(G4S)3，以此建立的重组牛痘病毒命名为VV-RIL-7/(G4S)3。

为此，本实验首先通过免疫荧光染色和流式细胞术分析，检测VV-RIL-7/(G4S)3和VV-RIL-7/EA3K感染肿瘤细胞后均能产生膜锚定型IL-7，结果表明(图9a)，VV-RIL-7/(G4S)3和VV-RIL-7/EA3K感染MC-38细胞后都产生了膜锚定型IL-7，且其表达水平随MOI的增加而升高。

进而，为了验证和比较VV-RIL-7/(G4S)3和VV-RIL-7/EA3K的抗肿瘤效能，本实验中将小鼠肠癌细胞MC-38(10

实施例8分析重组溶瘤病毒治疗后的肿瘤微环境中T细胞的数量和功能

按照设计思路，重组病毒VV-RIL-7所表达的锚定型IL-7将促进抗肿瘤免疫细胞的功能。为了进一步验证这一设计思路的合理性和所涉及的重组病毒的有效性，本实验选取6-8周龄健康C57/BL6小鼠，通过腹腔注射肠癌细胞株MC-38(10

结果表明：

1.如图10所示流式细胞术分析结果，展示了重组溶瘤病毒VV-RIL-7等治疗后对肿瘤微环境中T细胞数量和比例的影响。采用FS-SS圈门大致确定淋巴细胞群体；对于圈门内的细胞群体进一步采用造血系来源标记分子CD45和T细胞标记分子CD3共同分析T细胞群体(即CD45+CD3+群体)；而后使用CD8和CD4指标圈门分析T细胞群体中的CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群。通过综合分析(三个圈门层次的乘积)，发现：与PBS治疗组相比，单位质量肿瘤组织中所有重组病毒治疗组的T细胞及其亚群比例均增高，VV-RIL-7治疗组优于VV-D治疗组。上述结果说明RIL-7发挥了局部扩增T细胞的作用。

2.如图11所示细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析结果，展示了重组溶瘤病毒VV-RIL-7等治疗后对肿瘤微环境中T细胞产生干扰素-γ的影响。通过对肿瘤组织中的细胞依次进行FS-SS和CD8圈门后，分析CD8+T细胞内抗肿瘤免疫的标志性分子IFN-γ的表达，发现：与PBS治疗组相比，所有重组病毒治疗组的CD8+T细胞表达IFN-γ均有升高，且以VV-RIL-7治疗组升高更为明显。上述结果说明，经重组溶瘤病毒VV-RIL-7治疗后，不仅T细胞数量增加，其抗肿瘤效能也得到提高。

3.如图12所示的流式细胞术分析结果，展示了重组溶瘤病毒VV-RIL-7等治疗后对肿瘤微环境中T细胞表达PD-1的影响。通过对肿瘤组织中的细胞依次进行FS-SS和CD8/CD4圈门后，分析CD8+T细胞和CD4+T细胞表面免疫检查点分子PD-1的表达，发现：相较于PBS、VV-D治疗组，VV-RIL-7治疗组中CD4+T细胞表达PD-1水平下调，然而VV-RIL-7治疗组中T细胞表达PD-1水平即便下调，仍维持于较高水平，这为VV-RIL-7与抗PD-1单克隆抗体联合应用治疗肿瘤提供了的实验依据。

本实施例说明，VV-RIL-7可明显促进抗肿瘤关键成分T细胞向肿瘤组织浸润，并维持抗肿瘤功能状态，且存在与抗PD-1单克隆抗体联合应用的前提。

本发明通过刚性和柔性分子连接肽将野生型IL-7基因和GPI膜锚定(GPI-anchored protein)基因序列链接，构建IL-7-R-GPI融合基因，导入同源重组载体，与牛痘病毒发生同源重组，与此同时敲除牛痘病毒TK基因，使之更具安全性，如此构建重组牛痘病毒VV-RIL-7。VV-RIL-7由于删除了TK基因，安全性更好。VV-RIL-7感染肿瘤细胞后，可在复制的同时表达大量的重组IL-7(RIL-7)融合蛋白。由于RIL-7含有GPI锚定序列，其可被锚定于细胞膜，被局限于肿瘤微环境中发挥作用。这样即可避免潜在的IL-7全身副作用，又可实现肿瘤组织局部IL-7高浓度表达，发挥更强的局部抗肿瘤效能。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 融合基因RIL-7重组牛痘病毒及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130> 0

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1741

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1741)

<400> 1

agatcgataa aaattaatta attacccggg taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 60

aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt 120

taactcaaat gtttgtcttc acagagaaat atagtcctgt gtccactgca aaaaggagta 180

ccatcaccaa gcagaaagag acttggtacc caggtggaga gaatgatgag atggttgaca 240

cggctgcagc tttagctgcc gcctccttag ccgcggcctc cttcgcagcg gcctcttttg 300

cggcagcttc agccttaagg tgttctttag tgcccatcaa aattttattc caacaagttt 360

ttatctcttg taatagtctc tttaggaaac acaagtcatt cagttttttc tgttccttta 420

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tgaccattag aacactctca tattgtttgc catctttacc ttcaatatca caatcagatg 780

atgctactgg caacagaaca aggatcaggg gaggaagtcc aaagatatac ctaaaagaaa 840

catggaacat cctgcagggc cggccattat catcgtgttt ttcaaaggaa aaccacgtcc 900

ccgtggttcg gggggcctag acgtttttta acctcgacta aacacatgta aagcatgtgc 960

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ggcactgggg ttgtgccgcc tttgcaggtg tatcttatac acgtggcttt tggccgcaga 1140

ggcacctgtc gccaggtggg gggttccgct gcctgcaaag ggtcgctaca gacgttgttt 1200

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c 1741

<210> 2

<211> 1645

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<221> misc_feature

<222> (1)..(1645)

<400> 2

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<210> 3

<211> 726

<212> DNA

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<220>

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<222> (1)..(726)

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<210> 4

<211> 699

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(699)

<400> 4

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ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300

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