用于微粒和细胞图案化的任意形状的深亚波长声学操纵

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年4月24日提交的美国临时专利申请号62/837,768的优先权，其内容以其全文通过引用结合在此。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在国家科学基金会的第1711507号资助下在政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。

背景技术

从微米到厘米的尺度上操纵生物物体的方法是许多生物医学应用的基础，包括以下研究：细胞-细胞相互作用(Nilsson J等人，Analytica chimica acta，649(2)，141-157；Sun J等人，Biomaterials，35(10)，3273-3280)、单细胞分析(Wood DK等人，Proceedingsof the National Academy of Sciences，107(22)，10008-10013；Collins DJ等人，Lab ona Chip，15(17)，3439-3459)、药物开发(Kang L等人，Drug discovery today，13(1-2)，1-13)、即时诊断(Gervais L等人，Advanced materials，23(24)，H151-H176；Taller D等人，Lab on a Chip，15(7)，1656-1666；XiaoY等人，PloS one，11(4)，e0154640)、以及组织工程(Puleo CM等人，Tissue engineering，13(12)，2839-2854；Jamilpour N等人，ACSBiomaterials Science&Engineering，2019)。使用光学力(Hu W等人，Lab on a Chip，13(12)，2285-2291；Zhong MC等，Nature communications，4，1768；Ashkin A等人，Nature，330(6150)，769；Zhang H等人，Journal of the Royal Society interface，5(24)，671-690)、磁力(Lim B等人，Nature communications，5，3846)和电动力(Ho CT等人，Lab on aChip，13(18)，3578-3587；Chiang MY等，Science advances，2(10)，e1600964；Cheng IF等人，Biomicrofluidics，1(2)，021503)部署的传统方法是通用的，但是它们造成各种缺陷。光学力可以提供对操纵对象的精确三维(3D)控制，但是遭受了低生产量。磁力被广泛应用，但它需要可能干扰细胞功能和下游分析的磁性颗粒的额外标记。基于电动力的其他方法(如介电电泳和电渗)实施简单，但受到缓冲液不相容性和电干扰的挑战，这可能损害操纵的样品。3D打印(Chia HN等人，Journal of biological engineering，9(1)，4；Panwar A等人，Molecules，21(6)，685)提供了形成复杂的图案化轮廓的另一种手段，但是尚未能够实现对其打印对象的精确控制，因此限制了分辨率。另一方面，声学力提供用于非侵入性、无标记和生物相容性操纵的潜在途径。

在过去，声学操控由于其优异的生物相容性和其控制尺寸跨越亚微米到几毫米的物体的强度吸引了许多关注。具有不同密度和来自周围介质的压缩率的颗粒经历由非均匀声学场分布引起的净声辐射力(ARF)，净声辐射力将它们迁移到低势能区域或高势能区域。对于尺寸比波长小得多的(D<<λ)的颗粒，ARF可以由以下表达式估计(Bruss H，Lab on aChip，12(6)，1014-1021)：

其中，F

因此，在本领域中存在对能够在大面积上产生高分辨率、任意形状的势能阱的声学方法的需要。本发明满足了这种未满足的需要。

发明内容

在一方面中，本发明涉及一种用于操纵颗粒的顺应性膜(compliant membrane，柔性膜)声学图案化装置，该装置包括：压电层；设置在压电层顶部上的图案化层，图案化层包括多个空腔(cavity，腔)，其中，空腔中的每一个由与图案化层的顶表面齐平的膜覆盖；设置在图案化层的顶部上的流体层；浸没在流体中的多个颗粒；布置在流体层的顶部上的覆盖层；以及振荡电源，该振荡电源配置为以振荡频率驱动(actuate)压电层。

在一个实施方式中，压电层包括选自由以下组成的组的材料：锆钛酸铅(PZT)、钛酸钡以及钛酸铋钠。在一个实施方式中，压电层具有约100μm至1000μm的厚度。在一个实施方式中，图案化层包括选自由以下组成的组的材料：塑料、聚合物、橡胶、凝胶、硅酮(silicone，硅树脂)、以及聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一个实施方式中，图案化层具有约10μm至50μm的厚度。在一个实施方式中，膜具有约1μm至5μm的厚度。在一个实施方式中，膜还包括选自由以下组成的组的涂层：不透水涂层、疏水涂层、亲水涂层或功能化涂层。在一个实施方式中，流体层包括选自由以下组成的组的材料：水、细胞培养基、血液、血清以及缓冲溶液。在一个实施方式中，颗粒选自由以下组成的组：珠、纳米颗粒、微粒、细胞(cell)、气泡(bubble，泡状物，泡沫)、微生物、核酸以及蛋白质。在一个实施方式中，空腔包括气体、流体或空气。

在一个实施方式中，该装置还包括控制器，该控制器电连接至振荡电源并且配置为调节振荡频率。在一个实施方式中，该装置还包括温度调节器和温度传感器，其中，温度调节器配置为维持装置的温度。

在另一方面，本发明涉及一种操纵流体中颗粒的方法，包括以下步骤：提供顺应性膜声学图案化(CMAP)平台，该顺应性膜声学图案化平台包括压电层和设置在压电层的顶部上的图案化层，其中，图案化层包括至少一个空气空腔，每个空气空腔覆盖有与图案化层的顶面齐平的膜；将多个颗粒和流体定位在图案化层的顶部上；将覆盖层定位在流体层的顶部上；将电信号传递至压电层，该电信号被转换为机械振动，该机械振动以振荡频率生成声波，声波向上行进穿过图案化层、流体层和覆盖层；以及由通过图案化层和至少一个空气空腔的声波传播的差异在至少一个空气空腔的每一个的上方形成近场声势阱，使得多个颗粒聚集在至少一个空气空腔的每一个的膜上并且与膜共形(conform)。

在一个实施方式中，图案化层、空气空腔、以及膜通过从主模模制、通过注射模制、通过冲压、通过蚀刻、或通过3D打印形成。在一个实施方式中，电信号由电连接至控制器的振荡电源提供。在一个实施方式中，振荡频率为1MHz至5MHz。在一个实施方式中，振荡频率为约3MHz。

在一个实施方式中，该方法还包括维持平台温度的步骤。在一个实施方式中，流体选自由以下组成的组：水、细胞培养基、血液、血清、以及缓冲溶液。在一个实施方式中，多个颗粒选自由以下组成的组：珠、纳米颗粒、微粒、细胞、气泡、微生物、核酸、以及蛋白质。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的示例性实施方式的以下详细描述。然而，应当理解，本发明不限于在附图中示出的实施方式的精确布置和手段。

图1A至图1C描绘了能够使任意形状的深亚波长颗粒图案化的示例性顺应性膜声学图案化(CMAP)装置平台。(图1A)装置组件由作为电源的PZT基板、允许再接以上空气嵌入的PDMS结构的玻璃中间物、以及使用空气空腔选择性地阻挡传入的声学行进波的PDMS结构组成。(图1B)示出了PDMS结构正上方的所得声学辐射势场分布的代表性示意图。(图1C)组件的截面视图示出了PDMS结构的本体区域和膜区域，以及被设计成衰减波传播并且防止波反射回腔室中的PDMS封装。

图2描绘了合成颗粒图案的示例性方法的流程图。

图3A至图3D描绘了研究改变PDMS的材料特性的影响的声学结构相互作用模拟的结果。在振动过程中，当结构的E’从100MPa降低至0.1MPa时，与腔室流体接合的嵌入空气的PDMS结构的表面示出了更平滑的分布图(图3A)和较低阶结构振动模式。这在膜区域尤其明显。(图3B)E’的这种变化引起膜对于以上流体的顺应性，使得本体上流体的向上位移驱使流体朝向下方，使膜变形，反之亦然。模拟了针对水中的10μm聚苯乙烯珠(图3C)和10μm多孔PDMS珠(图3D)在PDMS结构正上方产生的声势图。对于聚苯乙烯珠，高E’产生跨本体区域和膜区域两者的多个势阱，而低E’产生符合膜区域的势阱；注意到所有最小势阱都在膜边缘处产生。相反，具有高压缩率的多孔PDMS珠恢复了潜在分布图并且导致总体更平滑的势图。

图4A和图4B描绘了分析图3C的所得声势分布的贡献因子的结果。辐射电势Eq.2的压力项

图5A至图5D描绘了具有变化的空气空腔宽度的软空气嵌入的PDMS结构的模拟表面位移的结果。为了确定从本体到膜区域中的波衰减的长度，按照图3A至图3D中的模拟模型，探索了空气空腔的不同宽度，大小为25μm至500μm(图5A-图5D)，假定E’的结构为0.1MPa。结果表明，不管膜尺寸如何，从本体传播的波衰减～10μm。

图6A至图6D描绘了在3MHz下循环通过正弦激发的不同相的硬和软空气嵌入的PDMS结构的垂直表面位移的激光多普勒测速法(LDV)测量的结果。使用同心环结构，证明了分别表现出不同表面振动图案的高E’和低E’的硬和软PDMS(图6A)。示出了所制造的样品的SEM截面(图6B)。在激发期间，两个PDMS结构(图6C、图6D)之间的表面轮廓在中心膜处明显不同。硬PDMS结构不仅产生更高阶结构振动模式，而且相对于本体产生更大面积的膜振动。比例尺，50μm。

图7A至图7D描绘了使用同心环形状的硬和软空气嵌入的PDMS结构在水中对微粒进行图案化的结果。为了比较，将硬和软PDMS组合物用于制造同心环结构。硬PDMS结构(图7A)导致跨本体和膜区域的10μm聚苯乙烯珠的多个图案。软PDMS结构(图7B、图7C)使得能够精确地遵循空气空腔的形状的干净的图案化轮廓。在低浓度(图7B)中，珠与最低势阱所在的膜边缘对齐。在高浓度下(图7C)，最初在边缘捕获的珠被推入膜区域，其中存在比边缘可以保持的更多的珠。在混合物中(图7D)，聚苯乙烯和多孔PDMS珠分别迁移到低压和高压的位置，对应于图3C和图3D中模拟的势图。注意到在悬浮膜下方形成有水滴。比例尺，50μm。

图8A至图8C描述了使用数字字符形状的软空气嵌入的PDMS结构在水中图案化微粒的结果以及它们相应的声压模拟。软PDMS实现10μm聚苯乙烯珠的精确和任意图案化(图8A)。尽管在PDMS结构正上方的图案轮廓和模拟压力图(图8B)中都有红色圆圈的附加痕迹，但陷阱与模拟非常一致。使用3D模型几何形状(图8C)进行模拟，该几何形状由具有嵌入的空气空腔的顶部流体和底部PDMS组成，与图3A至图3D中的上述声学结构相互作用模型相似。比例尺，70μm。

图9A至图9D描绘了使用呈数字字符形状的软空气嵌入的PDMS结构在DMEM中HeLa细胞的图案化和生存力评估的结果。(图9A)类似于图8A中的聚苯乙烯珠，HeLa细胞可以使用软PDMS图案化成任意形状。然而，由于PZT的发热，CMAP装置平台在T.E冷却器上操作，以维持腔室温度；测量温度作为时间的函数(图9B)，并且结果示出在约22℃的稳定状态。(图9C)在所施加的3MHz的频率和5Vrms的电压下在装置中连续操作5min之后，与94.52％的对照相比，细胞以96.73％示出了可比的活力。(图9D)此外，来自对照和实验两者的细胞在两天期间(48小时)增殖超过三倍，这证明了CMAP平台的生物相容性。比例尺，70μm。(***测量的试验数目，n＝3)。

具体实施方式

本发明涉及一种能够合成高分辨率、任意形状的能量势阱的近场声学平台。薄的粘弹性膜用于通过选择性地抑制平台上的结构振动来在深的亚波长尺度上调节声学波前。该新的声波波前调节机制(modulation mechanism)对于制造复杂的生物产品非常有效。

应当理解，本发明的附图和描述已经被简化以示出为了清楚地理解本发明相关的元件，同时为了清楚的目的，消除了通常在本领域中发现的许多其他元件。本领域普通技术人员可以认识到，在实现本发明的过程中，其他元件和/或步骤是所期望的和/或要求的。然而，因为这样的元件和步骤在本领域中是众所周知的，并且因为它们不便于更好地理解本发明，所以在本文不提供对这样的元件和步骤的讨论。本公开在本文涉及对本领域技术人员已知的此类元件和方法的所有此类变化和修改。

除非在别处定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试，但是描述了示例性方法和材料。

如本文所使用的，以下术语中的每一个具有在该部分中与其相关的含义。

冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文用于指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。举例来讲，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

当提及可测量的值(如量、持续时间等)时，本文所使用的“约”意在涵盖从指定值的±20％、±10％、±5％、±1％和±0.1％的变化，因为这样的变化是合适的。

贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如从1到6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3、6，以及它们之间的任何整体增量和部分增量。无论范围的宽度如何，这都适用。

液体中微物体的复杂图案化对于许多生物医学应用是至关重要的。在传统观念中，声学方法提供优异的生物相容性，但是由于驻波的性质以及流体与结构振动之间的耦合，声学方法本质上仅限于以低分辨率产生周期性图案。本发明提供了一种能够合成高分辨率、任意形状的能量势阱的顺应性膜声学图案化(CMAP)平台。薄的粘弹性膜用于通过选择性地抑制平台上的结构振动在深的亚波长尺度上调节声学波前。使用声学激发，可实现具有声激发波长的十分之一的线分辨率的微粒和细胞的任意图案。在小至3×3mm

现在参考图1A至图1C，描绘了示例性CMAP平台100。平台100包括平面压电层102、图案化层104、流体层110、以及覆盖层114。压电层102是电连接至振荡电源(诸如，功率放大器)的平面层，该振荡电源由控制器(诸如，函数发生器)控制，该控制器向压电层102馈送交流信号。压电层102将电压转换成以振荡频率生成声波的机械振动，声波行进通过平台100的每个层。压电层102可以由任何合适的压电材料构造，包括但不限于锆钛酸铅(PZT)、钛酸钡、钛酸铋钠等。压电层102可以具有任何合适的厚度。例如，压电层102可以具有约100μm至1000μm的厚度。

图案化层104是设置在压电层102的顶部上的平面层。在图1A和图1C中可见的是，图案化层104包括多个空腔106，每个空腔106形成为期望图案的形状。例如，如图1A所描述的，图案化层104包括各自以数字形状形成的多个空腔106，其中，数字形状从俯视图中是明显的。每个空腔106由与图案化层104的顶表面齐平的膜108覆盖，使得在每个空腔106内包含一定体积的气体、流体或空气。图案化层104和膜108可以各自由任何适合的材料构成，包括但不限于塑料、聚合物、橡胶、凝胶、硅酮、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。图案化层104和膜108可以各自具有任何合适的厚度。例如，图案化层104可以具有约10μm至50μm的厚度，并且膜108可以具有约1μm至5μm的厚度。在一些实施方式中，膜108还可以包括涂层。该涂层可以包括但不限于不透水涂层、疏水涂层、亲水涂层或功能化涂层。

流体层110设置在图案化层104和膜108的顶部上。流体层110可以包括任何合适的流体，包括但不限于水、细胞培养基、血液、血清、缓冲溶液等。流体层110可以具有任何合适的高度或深度，如在约0.5cm至5cm的高度或深度。流体层110包括多个颗粒112，这些颗粒期望被图案化成由图案化层104中的空腔106形成的形状。颗粒112可以包括任何期望的颗粒，包括但不限于珠、纳米颗粒、微粒、细胞、气泡、微生物、核酸、蛋白质等。

覆盖层114是设置在流体层110的顶部上的平面层。覆盖层114衰减声波以最小化波反射并且用来封闭流体层110。覆盖层114可以由任何合适的材料构成，包括但不限于塑料、聚合物、橡胶、凝胶、硅酮、PDMS等。覆盖层114可以具有任何合适的厚度。例如，覆盖层114可以具有约0.5cm至5cm的厚度。

在某些实施方式中，图案化层104、膜108和覆盖层114各自由相同材料构成。在一些实施方式中，图案化层104、膜108和覆盖层114各自由具有与流体层110的声阻抗基本相似的声阻抗的材料构成。在一些实施方式中，图案化层104、膜108、流体层110和覆盖层114中的每一个的声阻抗彼此在25％、20％、15％、10％、5％或1％内。

虽然未示出，但应当理解，平台100包括壳体，该壳体的尺寸适于配合压电层102、图案化层104、流体层110和覆盖层114中的每一个。壳体包括侧壁，使得流体可容纳在壳体内以形成流体层110。在一些实施方式中，壳体包括与图案化层104和覆盖层114的水平表面区域和形状匹配的内部水平表面区域和形状，使得图案化层104和覆盖层114中的每一个齐平地位于壳体内部内。在一些实施方式中，平台100还包括设置在压电层102和图案化层104之间的中间层116。中间层116可以被提供为压电层102与图案化层104之间的物理屏障，以便于使用和清洁，使得一个或多个图案化层104在不污染压电层102的情况下可以被替换。在一些实施方式中，壳体的底表面形成中间层116。中间层116可以由任何合适的材料构成，包括但不限于玻璃、金属、塑料、陶瓷等。中间层116可以具有任何合适的厚度。例如，中间层116可以具有约100μm至1000μm的厚度。

平台100适于任何期望的修改。例如，在一些实施方式中，平台100还分别包括温度调节器和传感器如热电冷却器和热电偶。可以提供温度调节器以维持平台100(如图案化层104和流体层110)的温度以用于某些应用，并且可以提供温度传感器以监测平台100的温度。

本发明还提供了使用本文所描述的CMAP平台来合成颗粒图案的方法。现在参考图2，描述了示例性方法200。方法200从步骤202开始，其中，提供顺应性膜声学图案化(CMAP)平台，该平台包括压电层和设置在压电层的顶部上的图案化层，其中，图案化层包括至少一个空气空腔，每个空气空腔覆盖有与图案化层的顶表面齐平的膜。在步骤204中，将多个颗粒和流体定位在图案化层的顶部上，形成流体层。在步骤206中，将覆盖层定位在流体层的顶部上。在步骤208中，电信号被传递至压电层并且转换为机械振动，该机械振动以振荡频率生成声波，声波向上行进穿过图案化层、流体层和覆盖层。在步骤210中，通过图案化层和至少一个空气空腔的声波传播的差异在至少一个空气空腔的每一个的上方形成近场声势阱，使得多个颗粒积聚在至少一个空气空腔的每一个的膜上并且与膜共形。

图案化层可以使用本领域常用的任何方法来形成。在各种实施方式中，可以使用模制(如用主模)、注塑模制、冲压、蚀刻、3D印刷或其他形式的增材制造等来构造具有空腔和膜的图案化层。

电信号可以由连接至控制器(诸如，函数发生器)的振荡电源(诸如，功率放大器)提供。可以根据振荡频率描述电信号。例如，振荡频率可以为约1MHz至5MHz。在一些实施方式中，振荡频率为约3MHz。在一些实施方式中，该方法还包括维持平台的温度的步骤。可以使用温度调节器来维持温度，并且使用温度传感器来监测温度。

实验实施例

通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，否则提供这些实施例仅用于说明的目的，并不旨在进行限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

在不进行进一步说明的情况下，据信本领域的普通技术人员可以使用以上说明以及以下说明性实施例做出并且利用本发明并且实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施方式具体地指出本发明的示例性实施方式，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。

实现微型物体的复杂图案化的方法对于许多生物医学应用是至关重要的。近年来，声学操作由于其优良的生物相容性已经作为一种有希望的方法的出现来对生物样品进行图案化。然而，当前的声学技术在形成复杂图案时遇到主要技术障碍，并且因此限于生产简单和周期性的物体组装。与其他物理方法相反，使用基于表面声波(SAW)或本体声波(BAW)的当前技术不能实现任意形状的图案。这种屏障源于它们的驻波性质(是内在机制)和其内部的耦合流体结构振动。

本研究证明了克服现有技术的技术障碍并且首次提供形成由现有声学技术不可行的高分辨率、任意形状的复杂图案的能力的新的声学操纵原理。称为顺应性膜声学图案化(CMAP)的原理利用嵌入在弹性体中的声学行波和空气空腔来生成用于图案化的近场势图。在空腔周围形成的顺应性膜以及弹性体的粘弹性性质的组合有效地抑制任何结构振动并且消除高阶模式图案化。因此，可以在CMAP表面上实现任意形状的声势图，以创建与空腔的形状几乎相同的复杂模式。

CMAP在声学操纵领域以及在组织工程领域的潜力是巨大的。CMAP是能够操纵微尺度物体(包括生物细胞)以形成高分辨率、任意形状的复杂组件的最有能力的声学技术。此外，设计和制造CMAP平台的简单性允许相关领域中的研究者容易地将此工具适配用于广泛的影响。

现在描述方法和材料。

图1A至图1C的CMAP装置由PZT基板(锆钛酸铅)、钠钙玻璃、以及顶部和底部PDMS结构组成。来自APC International Ltd.的尺寸为3cm×1cm×0.05cm(L×W×H)且材料类型为841的PZT生成跨装置的声学行进波。在顶部，使用环氧树脂固定尺寸为2cm×2cm×0.1cm(L×W×H)的来自Corning的钠钙载玻片(型号2947-75x50)。玻璃允许软空气嵌入的PDMS结构的容易再接，这使得PZT基板是可重复使用的。以与标准PDMS复制模塑(Friend J等人，Biomicrofluidics，4(2)，026502)类似的方式，使用Sylgard 527和184的混合物以4:1的重量比制造软PDMS结构。主模由MicroChem Corp的SU-8 3025微结构组成，该微结构在使嵌入的空气空腔成形的硅晶片上光刻图案化。通过在Sylgard混合物中覆盖主模并且然后使用覆盖有铝块(～7,500g)的另一片玻璃冲压来进行模制过程。结果，在微结构上形成～2μm厚的弯月面(meniscus)并且其变成PDMS膜(参见图6B中的SEM图像)。对于软PDMS结构，在室温下进行该混合物的固化。对于也在实验中证明的硬PDMS结构，模制过程的不同点在于使用在70℃的烘箱中固化4小时的纯Sylgard 184。随后，将软/硬PDMS结构转移到装置的玻璃层上。然后将微粒或生物物体移液到该结构上并且用厚的PDMS封装。为了使装置的腔室内部的波反射最小化，Sylgard 184的PDMS由于其接近水的声学阻抗用作封装。此外，将封装的厚度设计为1cm，这能够以我们的3MHz的操作频率实现足够的波能衰减，以防止来自环境空气与装置之间的界面的反射(Tsou JK等人，Ultrasound in medicine&biology，34(6)，963-972；Nama N等人，Lab on aChip，15(12)，2700-2709)。

使用CMAP装置的完全设置涉及功率放大器(ENI Model 2100L)、函数发生器(Agilent Model 33220A)、T.E.冷却器(T.E.Technology Model CP-031HT)、超长工作距离显微镜透镜(20×Mitutoyo Plan Apo)、直立显微镜(Zeiss Model Axioskop 2FS)、以及安装的记录照相机(Zeiss Model AxioCam mRm)。PZT基板的表面被丝焊并且电连接至由函数发生器控制以馈送A.C信号的功率放大器。在接收到信号时，PZT将正弦电压变换为机械振动以生成跨装置的声学行波。为了防止来自过度PZT加热的电池损坏，在T.E冷却器设定为12℃下操作该装置。为了监测该装置的腔室的温度，通过PDMS封装插入热电偶(Omega OM-74)并且在该腔室中仅用水再次进行该实验；结果显示在37℃的温育温度以下是稳定的，这表明对于长期操作的适合性。整个组件定位在安装在Zeiss Axioskop上的Mitutoyo显微镜透镜下面。然后通过允许清晰可视化的PDMS封装观察图案化过程，并且使用随附的ZeissAxioCam进行记录。

使用有限元(F.E.)求解器COMSOL多物理学5.3实现声学结构模块以研究由于软/硬空气嵌入的PDMS结构在激发时与室流体相互作用而产生的声势图。图3B提供了由分别模拟水和PDMS的顶部流体和底部固体组成的2D模型几何形状；实心的中心是代表空气空腔的空的空间。使用y方向上的规定位移来激发固体的底边界，模拟PZT沿其厚度的振动模式。在模拟中包括任意的各向同性损耗因子(0.2)以考虑固体的结构阻尼，如在PDMS的情况下。流体中的所得总声压由F.E.求解器(F.E.求解器求解流体与固体之间的界面处的声学结构相互作用)以及流体中的无粘性动量守恒等式(欧拉等式)和质量守恒等式(连续性等式)计算。该模拟假定了具有等熵热力学过程的经典压力声学并且假定了时间谐波。对于谐波声场，

使用有限元(F.E.)求解器COMSOL多物理学5.3实现声压模块以模拟装置腔室内的压力分布。虽然图8C中的3D模型几何形状模拟图3A中的2D模型，但底部固体以流体力学而不是固体力学处理。通过仅考虑材料的阻抗(由声速和密度给出)来模拟波传播，这种替代消除了在声学结构相互作用中涉及的物理复杂性以及额外计算能力。对于软PDMS结构，使用声速和密度的任意值。在固体的底部指定y轴方向上的正常位移，这模拟PZT激发的方向。假设平面波辐射全部围绕顶部流体的边界，从而使得出射平面波能够以最小的反射离开建模域。

切割所制造的PDMS结构以揭示膜的截面，并且使用SEM检查3个膜。测量的厚度为1.09μm、1.14μm和1.33μm，并且它们的平均厚度为约2.18μm。为了简单起见，在模拟中假定2μm的膜厚度。

1μm和10μm荧光绿聚苯乙烯珠均获自Thermo Fisher Scientific，USA。

将10:1的未固化PDMS(使用Sylgard 184(Dow Corning Co.))和固化剂与十二烷基硫酸钠盐在DI水中的1:100质量比的溶液混合。使用涡旋混合器，PDMS溶液在水中的混合物生成不同尺寸的PDMS球形液滴。随后，将该混合物在70℃的烘箱内固化2小时。然后使用40μm尼龙网(Fisher Scientific)的无菌细胞过滤器过滤固化的微孔PDMS珠。

将HeLa细胞(American Type Culture Collection，ATCC)维持在补充有10％(vol/vol)胎牛血清(FBS，Thermo Scientific)、1％青霉素/链霉素(Mediatech)、以及1％丙酮酸钠(Corning))的杜尔贝科改良的必需培养基(DMEM，Corning)中。在37℃和5％CO

现在描述结果。

顺应性膜声学图案化(CMAP)是允许在工程膜附近创建深亚波长分辨率、任意形状的声学势阱的装置平台。如图1A至图1C所示，通过激发使用压电陶瓷PZT(锆钛酸铅)生成的声学行波穿过比波长小得多的空气空腔的期望形状并且嵌入软的粘弹性聚二甲基硅氧烷(PDMS)结构中来实现这种势图。选择PDMS是因为其声学阻抗接近于周围流体(水)的声学阻抗，对于该周围流体，PDMS/水界面处的波反射可以被最小化(Leibacher I等人，Lab on aChip，14(3)，463-470)。利用空气空腔是因为它们与大部分波可以被反射的大多数材料具有大的声学阻抗差异(Lee JH等人，Ocean Engineering，103，160-170)。因此，近场声势阱在空气空腔正上方形成，具有与空腔的尺寸匹配的空间分辨率。在水层顶上的厚的PDMS层用作吸波介质以防止声波反射回去。

在常规声学图案化中遇到的一个主要挑战是使装置结构的设计复杂化的耦合的流体和结构振动。利用CMAP平台，结构诱导的振动的影响被最小化，否则它将干扰预期的声场，并且最终颗粒图案化的形状能够通过使用简单的压力波传播模型来预测。这种创新可以通过结合薄且顺应性的粘弹性PDMS膜以接合空气空腔和上述腔室流体来进行。当压力波传播通过空气嵌入的PDMS结构时，本体中的振动由于两个主要特性而在进入膜中的短距离内衰减。一个特征是膜的薄度和顺应性，该膜的薄度和顺应性不具有足够的刚度来以高频率在顶部驱动和移动流体物质。第二特征源于结构在高频下的材料阻尼，该材料阻尼防止振动能量在膜区域中累积。因此，膜区域上方的流体压力不会随着传播通过本体进入流体的波大幅波动并且与本体中的区域相比保持在相对恒定水平。这在膜上方产生低声压区并且在本体区域与膜区域之间建立压力梯度。由于这个近场压力区取决于从可以被制造成任何尺寸和几何形状的空气空腔获得的膜区域，因此可以实现具有比波长小得多的空间分辨率的任意形状的颗粒图案化。此外，可以使用相同的驱动原理实现大面积图案化；对于PZT基板产生具有均匀强度的平面声波的事实，最大操作区域仅由PZT的可用尺寸限制。简言之，由于CMAP的声势图不依赖驻波的形成，并且由于结构引起的振动而对图的干扰可以被最小化，因此势阱的形状简单地反映了空气空腔的形状。

为了定量理解CMAP工作原理，采用数值模拟研究了PDMS的材料性能与材料性能对结构诱导振动的影响之间的关系。实施COMSOL声学结构相互作用模型，如图3A至图3D所示。模型几何形状考虑了嵌入在PDMS结构中的50μm宽的空气空腔，该空气空腔留下与上方不可压缩的流体(水)接合的2μm悬挂膜。在3MHz的正弦激发频率下，探讨了关系η

通过将PDMS-流体界面附近的所得水压和速度场计入Eq.2估计声辐射势图。对于10μm的聚苯乙烯珠(ρ

相反，对于展现出比水大得多的可压缩性的充气微孔PDMS珠，等式1b中的速度项的贡献变得可忽略。已经显示，当孔隙率从0至30％变化时，PDMS中的声速可以从1000m/s快速下降至40m/s(Kovalenko A等人，Soft matter，13(25)，4526-4532)。基于关系κ

如模拟的，顺应性粘弹性PDMS膜有效地限制从本体传播到膜区域中的结构诱导的振动。这种独特的特征允许尺寸大于传播长度的膜用于CMAP上的任意图案化。在图5中，来自本体的振动从PDMS膜的边缘衰减～10μm(在0.1MPa下的E′)，而无论膜宽度。换言之，通过绕过在常规声学装置中遇到的流体-结构相互作用和声学模式的复杂分析，极大地简化了产生期望的势图的设计过程。

为了评估模拟结果，使用不同杨氏模量E的两种类型的PDMS制造CMAP平台以形成空气嵌入的粘弹性结构，并且然后在其表面上执行激光多普勒振动计(LDV)测量。遵循制造商的说明，使用Sylgard 184(Dow Corning Co.)合成第一类型以产生～1750kPa的E，并且以重量比为4:1的Sylgard 527(Dow Corning Co.)和184的混合物合成第二类型以产生～250kPa的E(Palchesko RN等人，PloS one，7(12)，e51499)。尽管这些是静态模量，但动态模量E’和E”的减小伴随E的减小(Hanoosh WS等人，Malaysian Polymer Journal，4(2)，52-61)。因此，这两种组合物变成硬和软的空气嵌入的PDMS结构，分别代表在100MPa和0.1MPa下的模拟情况。表示PDMS结构(同心环阵列)的示意图(图6A)连同所制造样品的SEM(扫描电子显微镜)截面(图6B)一起示出。在与模拟中设定的那些操作条件类似的操作条件下驱动，分别在声学激发的周期上测量硬和软PDMS结构(图6C和图6D)的表面垂直位移。对于硬PDMS结构，相90度和270度的表面轮廓显示出深入传播到膜中心的结构扰动，其激发高阶结构振动模式，类似于在50-100MPa下针对E’的模拟结果，图3C。然而，对于相同相的软PDMS结构，膜中心处的位移分布图是平滑的并且类似于在0.1-1MPa之间的范围处的模拟E’的那些，图3A。在此值得注意的是，除了动态模量与静态模量之间的差异之外，PDMS厚度的变化可以改变其机械特性(mechanical property，力学性能)(Xu W等人，Langmuir，27(13)，8470-8477)。

在声流学领域中，任意颗粒图案化已经成为主要复杂情况，其中图案化分辨率和轮廓分别由可获得的波长尺寸和有限的周期性声学势图限制。在SAW的情况下，由于跨装置表面的波传播的削弱，也限制了图案化的面积。可替换地，使用本文中所描述的CMAP平台的新声学图案化机制克服了这些挑战。如在图7A至图7D中所展示的，使用现有的硬和软空气嵌入的PDMS同心环结构以3MHz的操作频率和5Vrms的电压将水中的10μm聚苯乙烯珠图案化。虽然这两种结构都展示了符合膜/空气空腔形状的图案，但图7A中的硬PDMS结构在本体区域中展现了另外的捕获轮廓。这通过以下模拟(图3C)来说明：100MPa下高E’的PDMS结构在本体区域中产生额外的亚稳势阱，这符合实验结果(图7A)，其显示了产生的远离膜边缘～20μm的另外的阱。相反，图7B至图7D中的软PDMS结构示出了仅在膜边缘处的捕获轮廓。对于在0.1MPa下低E’的模拟PDMS结构，图3C，波传播到膜中的有效阻尼提供了对以上流体运动的膜顺应性，其中并且仅在产生势阱的地方。在低浓度的珠中，图7B，在膜边缘处开始捕获，其中最低声势存在，如之前解释的。在跨越3×3mm

为了进一步评估CMAP在任意图案化中的能力，制造了由数字字符组成的另一组软空气嵌入的PDMS结构。在高浓度下，图8A，水中的10μm聚苯乙烯珠完全填充膜区域，然而，具有在字符“1”、“6”和“8”中尤其明显的另外的迹线。这是由于当本体区域的尺寸超过声学波长时，相邻空气空腔之间的波干扰。以红色圈出的这些迹线被声压模拟很好地捕获，图8B，声压模拟仅考虑了所产生的所有装置现象中的压力方面；没有说明流体结构相互作用的影响。深蓝色表示反映最低声势区域的绝对压力的最低值。图8C示出了在模拟中使用的3D模型几何形状；该几何形状是根据所制造的软PDMS结构用真实尺寸构造的。实验结果与模拟结果之间的密切相似性反映了使用CMAP机制来设计形成任意声势分布的设备的简单性。

类似于聚苯乙烯珠，细胞的图案化高度取决于软空气嵌入的PDMS结构的表面位移、以及颗粒及其周围环境的密度和可压缩性，这产生声势图。这里选择HeLa细胞以证明CMAP平台的生物相容性。因为在DMEM中的典型细胞(ρ

已经在确定细胞活力和增殖中评估了用于细胞图案化的多种声学方法，并且已经证实在MHz级声场中的现有方法是生物相容的(Ding X等人，Proceedings of theNational Academy of Sciences，109(28)，11105-11109；Evander M等人，Analyticalchemistry，79(7)，2984-2991；Bazou D等人，Toxicology in Vitro，22(5)，1321-1331；Leibacher I等人，Microfluidics and Nanofluidics，19(4)，923-933)。CMAP装置平台以类似的MHz操作顺序提供了可比的结果。为了防止由于在CMAP装置平台上的热累积导致的潜在的热损坏，使用设定在12℃的T.E冷却器操作设备，以控制腔室温度。图9B示出了在3MHz的操作频率和5Vrms的电压下作为时间函数的温度。操作需要约5分钟才能达到稳定状态(约22℃)，低于37℃的细胞培养的温度。此外，遵循制造商的方案，使用台盼蓝(ATCC)的生存力评估和使用血细胞计数器(Hausser Scientific Reichert Bright-Line)的细胞计数在相同实验条件下对装置中操作的HeLa细胞上进行5分钟；结果显示与对照在94.52％的活力水平相比在96.73％的相似活力水平，图9C。细胞增殖的评估也显示了有希望的结果。实验后，将细胞的一部分孵育48小时(从第1天到第3天)。使用血细胞仪，在第1天和第3天，实验组和对照组的细胞密度接近，这都表明细胞密度增加超过三倍，图7D。该增加对应于约24小时的HeLa细胞倍增时间(Boisvert FM等人，Molecular&Cellular Proteomics，11(3)，M111-011429)。

CMAP平台是实现微粒和生物物体的深亚波长、任意形状图案的有力工具。这些是通过使用悬浮的薄且顺应的PDMS膜实现的，该膜将结构诱导振动的影响最小化，并且在不抵消预期的声势图的情况下适用于周围的流体运动。该膜可以具有任何几何形状，使得任意形状的图案化成为可能。此外，PZT和软的空气嵌入的PDMS结构两者可以基于潜在的声学驱动原理被放大用于更大的区域图案化。

这里值得注意的是，由于Eq.2中的ARF包括在实际应用中通常耦合的速度项和压力项两者，因此难以设计针对利用两个项的声学图案化而优化的装置。CMAP平台主要设计用于基于压力项的声学图案化。微粒如聚苯乙烯珠和大多数与水具有相似密度但不同压缩性(f

虽然可以引起声流力(acoustic streaming force)ASF(BrusH，Lab on a Chip，12(1)，20-28)以平衡ARF并干扰图案化，但实验结果表明当操作频率高于3MHz并且颗粒大小是10μm或更大时，ARF是驱动力。在操作开始时，仅在圆形膜的中心处观察到流动涡流并且在边缘附近微弱地延伸至～25μm。另一方面，遍布该装置的10μm聚苯乙烯珠朝向膜边缘迁移，其中它们被牢固地捕获，尽管如由1μm珠所示的流体的稍后大量移动。这种强的捕获效应意味着ARF对于10μm珠的图案化的主导强度。观察到的本体移动的现象可以被称为全局流动，该全局流动是在上PDMS盖由于PZT的热生成而热膨胀时由腔室的体积变化引起的。因为上部PDMS盖(～1cm)基本上比底部软空气嵌入的PDMS结构(～27μm)厚，所以体积变化应当主要由盖的膨胀引起。尽管10μm聚苯乙烯珠和HeLa细胞分别在空气空腔外漂移，但这些是腔上方的势阱所能容纳的过量目标。注意，此类漂移主要由全局流动引起，因为ASF仅在膜边缘附近有效。漂移是有利的，因为在空腔外部没有过多的目标的情况下它们导致总体更干净的图案化轮廓。图像中的模糊可能是由于导致结构变形的PDMS的热膨胀引起的，结构变形影响显微镜聚焦。除了全局流动之外，10μm珠和HeLa细胞的图案显示出与在图8B中模拟的压力分布的一致性，这进一步降低了声流的重要性。

选择3MHz作为操作频率，因为它是抑制声流流动足够高的值并且是避免额外的声学加热足够低的值。例如，当操作频率降低至0.5MHz时，10μm聚苯乙烯珠可以遵循1μm珠的流线，在膜边缘附近以涡流形式循环。这导致不稳定的图案化和难以实现期望轮廓。另一方面，虽然以更高频率操作可以将流动流最小化，但其伴随有在PDMS中更大的能量衰减以及由此需要管理的额外热生成(Tsou JK等人，Ultrasound in medicine&biology，34(6)，963-972)。

虽然CMAP平台依赖于顺应性的粘弹性PDMS膜来提供图案化中的突破，但该膜太薄(约2μm)以致于上方流体可以穿透。这通过图7A至图7D所示的膜区域下方的液滴证实。现有文献还证明，PDMS本质上是多孔的，这使得水分子能够扩散通过(Verneuil E等人，EPL(Europphysics Letters)，68(3)，412；Randall GC等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，102(31)，10813-10818)。考虑到装置操作期间的额外的声振动，流体可能已经渗透过产生液滴的薄膜。液滴的累积也可能影响颗粒图案化；如果累积足够的液滴(例如，填充空气空腔)，则膜将不再是流体顺应性的并且图案化轮廓将变形。为了避免这样的问题，可以应用薄膜涂层或表面处理以防止水渗透，同时保持膜的顺应特性。

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