技术领域
本发明属于生物抗菌、纳米医药和海洋抑菌防污技术领域，具体涉及一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法。
背景技术
微纳米马达具有可控性好、靶向性高、扩散能力强等优异性能，因而在高效抗菌、药物可控运输释放、肿瘤诊疗和海洋抑菌防污领域有着广泛的应用前景。然而，如何高效驱动微纳米马达和有效调控其运动行为是当前研究的焦点，也是其在生物医学领域应用的必要条件。目前，微纳米马达主要有三种驱动方式：外场驱动、生物活体驱动和生物/化学反应驱动。鉴于生物体系中的特定要求和实际可操作性，生物酶因其高效的催化性能和良好的生物相容性，成为生物抗菌和生物医学领域中驱动微纳米马达运动的重要选择之一。尽管一些生物酶马达已经实现了概念上的制备和优化，但尚缺乏在分子水平上对生物酶的催化过程与其驱动的微纳米马达运动行为相互作用关系的深入剖析，因此难以精确调控生物酶马达的运动行为。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前脂肪酶驱动微纳米马达的运动行为难以精确调控的问题，提供一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，该方法基于变构激活思想来实现提高脂肪酶马达的催化效率和运动可控性的目的。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，所述方法步骤如下：
步骤一：使用辛烷基三乙氧基硅烷对MSNPs进行表面疏水改性；
步骤二：将生物酶固定于步骤一获得的MSNPs改性表面，得到生物酶马达；
步骤三：将天然小分子表面活性剂与生物酶马达溶液混合均匀。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
1、通过两种方式实现变构激活，即控制固定化生物酶的构象、生物酶结构中“盖子”的开启状态。
2、能够简单、高效地调控生物酶马达的运动行为，发展一种新型的调控生物酶运动的方法。
3、本发明基于变构激活的策略来调节生物酶的催化效率，从而调控生物酶驱动的微纳米马达的运动行为，具有操作简单、反应灵敏、可控性强、成本低等优点。
附图说明
图1为表面改性后的介孔二氧化硅纳米粒子表面固定脂肪酶的示意图；其中，亲水修饰的表面固定脂肪酶为不可控的构象；而疏水表面的能够将脂肪酶朝向完全固定，即脂肪酶的亲水部分朝外；
图2为制备MSNPs的扫描电子显微镜照片；
图3为亲水基底修饰脂肪酶之后的红外光谱表征图；
图4为疏水基底修饰脂肪酶之后的红外光谱表征图；
图5为疏水MSNPs制备的脂肪酶马达在10mg/mL磷脂溶液中通过构象和脂肪酶盖子开关调控后的脂肪酶运动轨迹图；
图6为不同情况调控脂肪酶马达运动行为的扩散系数统计图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
本发明首次报道利用变构激活的策略来调控微纳米马达的运动行为，其驱动原理在于脂肪酶能够催化溶液中的甘油三酯底物，产生底物的分解产物的浓度梯度，从而带来局部扩散泳，驱动纳米粒子的运动。然而，目前尚无调节脂肪酶马达运动能力的方法。根据驱动原理可见，提高脂肪酶催化效率是提高脂肪酶马达运动能力的有效方法。所以，本发明设计利用变构激活的两种方式：调控脂肪酶的构象和调控脂肪酶结构中盖子的开启过程来分别提高脂肪酶的催化效率，以实现调控脂肪酶马达运动行为的目的。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，所述方法步骤如下：
步骤一：使用辛烷基三乙氧基硅烷对MSNPs(介孔二氧化硅纳米粒子)进行表面改性；
步骤二：将生物酶固定在步骤一获得的改性后的MSNPs表面，得到生物酶马达；
步骤三：将天然小分子表面活性剂与生物酶马达溶液混合均匀即可，利用天然小分子表面活性剂调控生物酶马达的运动行为。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，步骤一中，对MSNPs进行表面改性的具体操作为：
(1)将MSNPs分散在EtOH中，制得MSNPs分散液，超声处理10～15分钟；
(2)将辛烷基三乙氧基硅烷配置成水溶液；
(3)将(2)的水溶液加入到(1)的MSNPs溶液中，置于旋转摇床在40～50℃下剧烈搅拌20～24小时，然后离心清洗并干燥。具体地，可进行多次的离心清洗，目的在于对产物进行清洗纯化，除去多余的辛烷基三乙氧基硅烷，可依次在乙醇中洗涤2～3次(3500～4500转/min，10～12分钟/次)和在水中洗涤2～3次(3500～4500转/min，10～12分钟/次)，每次洗涤之间超声15～20分钟；加入辛烷基三乙氧基硅烷的水溶液，就可对应得到疏水性表面的MSNPs(如图1所示)；最后干燥的目的在于获得粉末状的MSNPs(图2)，利于后续反应确定MSNPs悬浮液的浓度，以上步骤为调控脂肪酶在基底材料上的构象提供了基础。
具体实施方式三：具体实施方式二所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，(1)中，溶液浓度为2mg/mL；(2)中，水溶液浓度为2vol.％。
具体实施方式四：具体实施方式二所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，(3)中，(2)的水溶液与(1)的MSNPs溶液的体积比为10μL：1mL。
具体实施方式五：具体实施方式一所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，步骤二中，所述生物酶为脂肪酶、尿素酶或过氧化氢酶中的一种。脂肪酶可以是天然存在的或者是细菌代谢合成或其他工业方法合成的，虽然结构相似，但氨基酸序列不同，尿素酶或过氧化氢酶也能够通过一些抑制剂来实现调控马达的运动行为。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，步骤二中，固定生物酶的操作具体为：
(1)将利用辛烷基三乙氧基硅烷修饰后的MSNPs分散于900μL PBS中，离心10分钟，并超声处理20分钟；
(2)将10mM含有生物酶的PBS溶液加入到(1)的溶液中；
(3)将混合物在室温下以1400～1500转/min的速度置于涡旋振荡器上过夜；
(4)通过离心(3500～4500转/min，10～12分钟)，并用PBS将获得的纳米马达洗涤3次，过程为1分钟的涡旋和3分钟的超声处理。
具体实施方式七：具体实施方式六所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，(1)中，MSNPs的浓度为5mg/mL。
具体实施方式八：具体实施方式六所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，(2)中，控制生物酶在混合溶液中的浓度为8～10mg/mL。
具体实施方式九：具体实施方式一所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，步骤三中，所述天然小分子表面活性剂的浓度为10～15mg/mL。
具体实施方式十：具体实施方式一或九所述的一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，步骤三中，所述天然小分子表面活性剂为卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸等极性磷脂中的一种。
实施例1：
一种基于变构激活策略调控生物酶马达运动行为的方法，所述方法步骤如下：
步骤一：对MSNPs进行表面疏水改性的具体操作为：
(1)将MSNPs分散在EtOH中，终浓度为2mg/mL，超声处理15分钟；
(2)将辛烷基三乙氧基硅烷配置成水溶液，浓度为2vol.％；
(3)将(2)的水溶液加入到(1)的MSNPs溶液中，体积比为10μL：1mL，置于旋转摇床在50℃下将混合物剧烈搅拌20小时，然后离心清洗并干燥。具体地，可进行多次的离心清洗，目的在于对产物进行清洗纯化，除去多余的辛烷基三乙氧基硅烷，可依次在乙醇中洗涤3次(3500～4500转/min，12分钟/次)和在水中洗涤3次(3500～4500转/min，12分钟/次)，每次洗涤间隔中超声15分钟；加入的为辛烷基三乙氧基硅烷的水溶液，对应得到的为疏水性表面的MSNPs(如图1所示)。
步骤二：固定生物酶的操作具体为：
(1)将MSNPs分散于900μLPBS中，浓度为5mg/mL，离心10分钟，并超声处理20分钟；
(2)将10mM含有生物酶的PBS溶液加入到(1)的溶液中，控制脂肪酶在混合溶液中的浓度为9mg/mL；
(3)将混合物在室温下以1400转/min的速度置于涡旋振荡器上过夜；
(4)通过离心(3500～4500转/min，10～12分钟)，并用PBS将获得的纳米马达洗涤3次，过程为1分钟的涡旋和3分钟的超声处理。
此步骤中，由于MSNPs表面具有辛烷基三乙氧基硅烷，其表面体系为疏水体系，利用的是亲疏水相互作用，将脂肪酶固定于MSNPs表面，使得脂肪酶的亲水基团朝向溶液，疏水基团朝向基底MSNPs(图4，根据图中1637cm
检测脂肪酶马达运动行为：在溶液中分别加入0、1、10和100mM的甘油三乙酯作为底物燃料驱动马达，然后检测其扩散系数和运动轨迹。该步骤中体现的是小分子表面活性剂对脂肪酶马达运动行为的调控。
步骤三：将天然小分子表面活性剂和脂肪酶马达溶液混合均匀即可，利用天然小分子表面活性剂调控脂肪酶马达的运动行为。所述天然小分子表面活性剂的浓度为10～15mg/mL，利用Python软件进行运动行为追踪(图5)，记录到两种马达的运动行为，从而计算得到扩散系数等性质参数(图6)。该步骤的原理是由于磷脂小分子具有两亲性，使脂肪酶分子的盖子相结合，保证其处于打开状态，从而提高催化效率促进马达运动。
步骤三中利用磷脂小分子开启脂肪酶的催化盖子，通过对比可以得到以下结论：
一、在疏水性MSNs表面的脂肪酶马达具有更快的运动行为，其单位时间内的扩散效率比亲水基底制备的脂肪酶马达高(对照组为亲水表面修饰，所用试剂为3-氨丙基-三乙氧基硅烷)；
二、卵磷脂能提高以上两种不同亲疏水基底的脂肪酶马达，可以实现对运动行为的调控。
本发明开展脂肪酶马达的实验，下表为加入不同磷脂小分子之后脂肪酶马达扩散系数的增加比例。
对比例1：
本对比例与实施例的不同之处在于：步骤一中，使用3-氨丙基-三乙氧基硅烷对MSNPs(介孔二氧化硅纳米粒子)进行表面改性；加入的为3-氨丙基-三乙氧基硅烷的水溶液，对应得到亲水性表面的MSNPs(如图1所示)；在亲水MSNPs体系中，利用的是静电引力，固定化脂肪酶具有随机构象(图3，根据图中1637cm
机译： 用于优化驾驶时机动车辆性能的方法，涉及通过模型预测在驾驶表面上行驶时的车辆运动行为，并基于预测的运动行为设置机动车辆的底盘
机译： 运动行为分析器，运动行为分析系统，运动行为分析方法和运动行为分析程序
机译： 基于在多次喷射修改的操作状态下的运动行为来确定燃料喷射器的运动行为
