一种具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食用菌多糖研究领域，特别涉及一种具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1及其制备方法和应用。

背景技术

食用菌多糖具有多种功能活性，包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖血脂等，其中，免疫调节活性是多糖被研究得最广泛、最深入的生理活性，多糖可通过直接或间接方式激活巨噬细胞、T/B淋巴细胞、促进和补充干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等多种方式来调节和改善机体的免疫系统，并与其他抗癌、抗病毒等功能相关，因此多糖在功能性食品以及药物开发上具有重要应用价值。

点柄乳牛肝菌(Suillus granulatus)，别名松蘑、栗壳牛肝菌，属于担子菌门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、牛肝菌目(Boletales)，是油松林地的常见外生菌根，其广泛分布于云南、四川、贵州、黑龙江等省区，点柄乳牛肝菌含有多糖、麦角固醇、人体必需氨基酸、微量元素等多种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功能活性。但目前对点柄乳牛肝菌多糖的链结构解析及免疫调节活性未做深入研究。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖。

本发明的另一目的在于提供一种上述具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖的制备方法；本发明以点柄乳牛肝菌子实体为研究对象，通过热水浸提和分级醇沉提取，经DEAE离子交换柱以及分子筛进行分离纯化并研究其生物活性，解析了点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1新成分的单糖组成、糖苷键连接方式、链结构等。

本发明的再一目的在于提供一种上述具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1，该点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的主要重复单元的结构如下所示，重均分子量为150.75kDa：

所述点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的糖含量为94.84wt％。

所述点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1主要由摩尔比为2.4:28.2:1.0的甘露糖、葡萄糖和木糖组成。

上述的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的制备方法，包括以下步骤：

(1)将粉碎过筛的点柄乳牛肝菌粉末脱脂处理，干燥后得到点柄乳牛肝菌脱脂粉末；

(2)向点柄乳牛肝菌脱脂粉末中加去离子水，提取多次，过滤后合并上清液，减压浓缩，得浓缩液；

(3)浓缩液经分级醇沉、复溶沉淀、除蛋白、透析、冷冻干燥后获得粗多糖冻干粉；

(4)取粗多糖冻干粉配置成粗多糖溶液，经离子交换柱分离洗脱，苯酚硫酸法测定，收集目标组分峰洗脱产物，经浓缩、透析、冷冻干燥后获得SGP2组分；

(5)将SGP2组分经分子筛进一步分离，采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，收集目标组分峰洗脱产物，合并后的溶液经浓缩、透析、冷冻干燥后得到点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1。

所述步骤(1)具体按照以下步骤：将点柄乳牛肝菌子实体超微粉碎后过100目筛，得点柄乳牛肝菌粉末，按照料液比1g：20mL，向粉末中加入95vt％的乙醇，75℃提取2h，重复操作一次，过滤后收集沉淀并在60℃烘干，得到点柄乳牛肝菌脱脂粉末；

所述步骤(2)具体按照以下步骤：按照料液比1g：20-40mL，向点柄乳牛肝菌脱脂粉末中加去离子水，90℃提取2h，得水提液，重复操作2次，脱脂棉纱过滤后合并上清液，60℃减压浓缩，得浓缩液；

所述步骤(3)具体按照以下步骤：向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30vt％，在4℃静置3h沉淀不溶性多糖，以转速6000r/min离心10min收集上清液；继续往上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为80vt％，4℃下醇沉16h，在4℃以转速6000r/min离心10min收集沉淀；将沉淀物溶解于去离子水中，得到多糖溶液；向多糖溶液中加入同等体积的Sevage试剂，所述Sevage试剂为体积比为4:1的氯仿-正丁醇混合液，倾入分液漏斗中剧烈震摇30min，在4℃以转速6000r/min离心10min分层，取上清，重复除蛋白直到两相分界处无白色絮状物，并旋蒸去除有机溶剂；随后将去除蛋白的多糖溶液采用3500Da透析袋透析72h，冷冻干燥得到粗多糖。

所述步骤(4)具体按照以下步骤：将粗多糖配制成浓度为25mg/mL的溶液，经DEAE-Sepharose fast flow离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为4min/管，使用全自动部分收集器收集，采用苯酚-硫酸法检测多糖的含量，收集0.1M NaCl溶液洗脱组分，浓缩后采用3500Da透析袋透析72h，冷冻干燥得SGP2组分；

所述步骤(5)具体按照以下步骤：将SGP2组分配制成浓度为8mg/mL的溶液，经Sephacryl S-300HR凝胶渗透柱分离纯化，用0.1M NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为8min/管，使用全自动部分收集器收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集第一个组分峰，再经浓缩、3500Da透析袋透析72h、冷冻干燥后得到点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1。

上述的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1在制备功能性食品及免疫调节剂药物中的应用。

所述功能性食品及免疫调节剂药物具有增强巨噬细胞活力及吞噬能力，和/或增加巨噬细胞ROS及NO产生量，和/或增加巨噬细胞的细胞因子和趋化因子产生量功效的活性。

所述细胞因子包括TNF-α、IL-6；所述趋化因子包括MCP-1。

上述方法中，与传统醇沉提取方法相比，本发明的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1通过分级醇沉提取出不同组分的多糖，并除掉点柄乳牛肝菌中不溶性多糖(30vt％乙醇浓度醇沉)，降低后续得到的可溶性多糖(80vt％乙醇浓度醇沉)分离纯化难度。

所述免疫调节剂可被模式识别受体TLR2识别，通过促进巨噬细胞的ROS和/或NO和/或细胞因子和/或趋化因子的产生量发挥其免疫调节功能。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

1、本发明以点柄乳牛肝菌为研究对象，通过热水浸提和分级醇沉提取，经DEAE离子交换柱和分子筛进行分离纯化制备出点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1，并确定其具体的活性用途；

2、与传统醇沉提取方法相比，本发明的点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的提取方法优势在于使用分级醇沉，不同浓度的乙醇可提取出不同组分的多糖，除去点柄乳牛肝菌中不溶性多糖，使后续得到的可溶性多糖纯度较高，达到94.84wt％。

3、经测定，点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的重均分子量为150.75kDa，主要由甘露糖、葡萄糖、木糖组成，摩尔比为：2.4:28.2:1.0，具有糖类化合物以及α-异构吡喃糖的特征吸收峰，并结合甲基化和核磁分析，解析SGP2-1的化学结构，确定点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1为新物质；

4、点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1在40-320μg/mL浓度范围内，与对照组相比，可显著增强巨噬细胞RAW264.7细胞增殖和吞噬中性红的能力；可显著促进巨噬细胞RAW264.7产生ROS和NO；可显著增加巨噬细胞RAW264.7细胞因子(TNF-α、IL-6)和趋化因子(MCP-1)等的产生量；SGP2-1在320μg/mL浓度时，可被模式识别受体TLR2识别，激活巨噬细胞并促进ROS、NO、细胞因子和趋化因子的产生，发挥其免疫调节功能。

附图说明

图1是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的DEAE离子交换柱层析洗脱图；

图2是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的Sephacryl S-300HR凝胶柱洗脱图；

图3是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的紫外吸收光谱；

图4是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的HPGPC图；

图5是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的单糖组成图；

图6是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的红外光谱图；

图7是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的

图8是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的

图9是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的HH-COSY图谱；

图10是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的HSQC图谱；

图11是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的HMBC图谱；

图12是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性影响图；

图13是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的影响图；

图14是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7产生ROS影响(A)流式细胞仪分析图、(B)荧光显微图像；

图15是点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对RAW 264.7细胞培养上清(A)NO、(B)TNF-α、(C)IL-6、(D)MCP-1分泌及(E)iNOS、(F)TNF-α、(G)IL-6、(H)MCP-1mRNA表达的影响；

图16是TLR2和TLR4抗体对经点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1诱导的巨噬细胞RAW264.7产生NO影响图；

图17是TLR2和TLR4抗体对经点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1诱导的巨噬细胞RAW264.7产生IL-6影响图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

(一)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的制备

将点柄乳牛肝菌子实体超微粉碎后过100目筛，获得点柄乳牛肝菌粉末，按照料液比1g：20mL向粉末中加入95vt％的乙醇，75℃提取2h，重复操作一次，过滤后收集沉淀并在60℃烘干，得到点柄乳牛肝菌脱脂粉末；

按照料液比1g：20-40mL向点柄乳牛肝菌脱脂粉末中加去离子水，90℃提取2h，得水提液，重复操作2次，脱脂棉纱过滤后合并上清液，60℃减压浓缩，得浓缩液；

向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30vt％，在4℃静置3h沉淀不溶性多糖，离心收集上清液，所述的离心条件为以转速6000r/min离心10min；继续往上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为80vt％，4℃下醇沉16h，离心收集沉淀，所述的离心条件为在4℃以转速6000r/min离心10min，将沉淀溶解于去离子水中，得到多糖溶液；

向多糖溶液中加入同等体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)，倾入分液漏斗中剧烈震摇30min，离心分层，取上清，重复除蛋白直到两相分界处无白色絮状物，并旋蒸去除有机溶剂，所述的离心条件为在4℃以转速6000r/min离心10min；随后将去除蛋白的多糖溶液采用3500Da透析袋透析72h，冷冻干燥得到粗多糖。

将粗多糖配制成浓度为25mg/mL的溶液，经DEAE-Sepharose fast flow离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱时间为4min/管，采用苯酚-硫酸法检测多糖的含量，洗脱曲线如图1所示，用全自动部分收集器收集0.1M NaCl溶液洗脱组分，浓缩后采用3500Da透析袋透析72h，冷冻干燥得到SGP2组分；

将SGP2组分配制成浓度为8mg/mL的溶液，经Sephacryl S-300HR凝胶渗透柱分离纯化，用0.1M NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为8min/管，使用全自动部分收集器收集，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量并绘制洗脱曲线，如图2所示，根据洗脱曲线收集第一个组分峰，再经浓缩、3500Da透析袋透析72h，冷冻干燥后得到点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1。

二)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的糖含量测定

以葡萄糖为标准品，准确称取10mg葡萄糖标品，溶于10mL蒸馏水中，使标准溶液浓度为1mg/mL，准确吸取0.05、0.04、0.03、0.02、0.01mL的标准溶液于离心管中，用蒸馏水补足至0.5mL，备用。采用苯酚硫酸法测定多糖含量，步骤如下:吸取150μL糖溶液于1.5-2mL离心管中，加入75μL6wt％苯酚，经涡旋振荡器混匀，加入375μL浓硫酸，混匀，冰上静置3min，沸水浴10min，冷却至室温，测定其在490nm处的吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。将SGP2-1配制为0.1mg/mL溶液，经苯酚硫酸法步骤测定，根据标准曲线y＝8.8482x+0.0996(R

三)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的紫外光谱分析

取一定量上述所得点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1溶于蒸馏水中，制成浓度为1mg/mL的溶液，在U-2910分光光度计上扫描分析，波长范围为200-400nm，结果如图3所示，其在260nm和280nm均无特征吸收峰，表明SGP2-1中不含核酸和蛋白质。

四)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的分子量的测定

上述所得点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的分子量通过Waters ACQUITY APC测得，该系统配备Waters ACQUITY APC AQ 900和ACQUITY APC AQ 450柱(2.5μm×4.6mm×150mm)，柱温为35℃，流动相为NaNO

五)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的单糖组成分析

取2mg上述所得点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1，用1mL的2M三氟乙酸在110℃水解6h，然后用0.5M PMP衍生化，PMP衍生物在Agilent 1200系列HPLC系统(G1311A Quat泵，G1329AALS进样器，G1315D DAD检测器)上进行分析。

GC-MS条件：Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm×5μm),检测温度为30℃，检测波长为250nm，流速为0.8mL/min，流动相为磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH6.5)和乙腈(84:16，v:v)的混合物。

其中标准品为：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。结果如图5所示。

由GC-MS结果可知，点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的单糖组成主要由甘露糖、葡萄糖、木糖组成，其摩尔比为：2.4:28.2:1.0。

六)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的红外光谱分析

将2mg上述所得点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1与100mg干燥的溴化钾粉末混匀，充分研磨后压片，在4000-400cm

七)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的甲基化分析

将上述所得点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1样品置于反应瓶中，加入DMSO，快速加入NaOH粉末，封闭，在超声作用下溶解，再加入碘甲烷反应，最后终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，用1mL的2M三氟乙酸水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2mL双蒸水，60mg硼氢化钠还原8h，加入冰醋酸中和，旋蒸，101℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。二氯甲烷层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用GCMC-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品。

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m×0.25mm×0.25μm；程序升温条件为：起始温度120℃，以4℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。结果如下表1所示。

表1-点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1甲基化分析结果

八)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1的核磁共振分析

将50mg上述所得点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1溶于0.5mL重水(D

表2-点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1中各糖残基的氢、碳信号归属

结合单糖组成、红外光谱、甲基化和核磁共振分析得SGP2-1的基本重复单元的结构如下：

分析结果表明：SGP2-1主链主要以→4)-α-D-Glcp-(1→组成，而端基α-D-Glcp→通过O-6键连接在主链上。

实施例2

一)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7的毒性影响

将RAW264.7细胞以5×10

二)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7的中性红吞噬实验

将RAW264.7细胞以2.5×10

三)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7释放活性氧(ROS)的影响

将RAW264.7细胞以1×10

四)点柄乳牛肝菌SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7产生NO、细胞因子、趋化因子及相关基因表达的影响

将RAW264.7细胞以5×10

五)点柄乳牛肝菌多糖SGP2-1对巨噬细胞RAW264.7表面模式识别受体的识别

取RAW264.7细胞(5×10

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。