用于治疗核纤层蛋白病的组合物及方法

相关申请案的交叉引用

本申请案主张2019年2月28日申请的美国临时申请案第62/812,021号的优先权。前述申请案以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

通过由于常用替代性剪接，LMNA基因编码至少三种同种型(核纤层蛋白(lamin)A、核纤层蛋白C及核纤层蛋白AΔ10)。两个主要同种型核纤层蛋白A及核纤层蛋白C为纤维核薄层(位于核包膜的内膜与DNA之间的复合分子接口)的组成性组分。核纤层蛋白A及核纤层蛋白C具有在机械核膜维持至基因调节范围内的不同生理作用。LMNA基因中的许多突变引起称为核纤层蛋白病的一系列疾病。这些疾病包括至少八个经充分表征的表型，其中一些受限于骨胳肌或表皮，而其他为多系统的。

扩张型心肌症为LMNA相关疾病的大家族中的疾病中的一种。扩张型心肌症的发生率在1:2500名个体至1:250名个体范围内。扩张型心肌症的特征在于左心室或两个心室的扩张及减弱的收缩以及减弱的收缩性功能。尽管为罕见疾病，扩张型心肌症表现出严重的健康负荷，通常引起心律不齐、血栓栓塞及在疾病的任何阶段的猝死。没有用于扩张型心肌症或其他LMNA相关核纤层蛋白病的特定治疗。

需要用于核纤层蛋白病(例如扩张型心肌症)的新颖治疗。

发明内容

在一些实施方案中，本文提供可用于治疗例如扩张型心肌症的核纤层蛋白病的组合物及方法。

在一些实施方案中，本发明提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含可操作地连接至具有少于500bp的调节组件的核苷酸序列，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽、(b)核纤层蛋白C多肽、或(c)核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或(a)-(c)中的任一者的生物活性变体及/或片段。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的核酸构建体，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽、(b)核纤层蛋白C多肽、或(c)核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或(a)-(c)中的任一者的生物活性变体及/或片段，其中该核苷酸序列包含至少一个(但非所有)LMNA基因的非编码序列。在某些实施方案中，非编码序列为内含子。在某些实施方案中，核苷酸序列包含至少一个(但非所有)与野生型人类LMNA基因的内含子1至11对应的内含子。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子10对应的内含子。在某些实施方案中，与内含子10对应的内含子包含与SEQ ID NO:79的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子8对应的内含子。在某些实施方案中，与内含子8对应的内含子包含与SEQ ID NO:77的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子9对应的内含子。在某些实施方案中，与内含子9对应的内含子包含与SEQ ID NO:78的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子11对应的内含子。在某些实施方案中，与内含子11对应的内含子包含与SEQ ID NO:80的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子9及10对应的内含子。在某些实施方案中，核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子8、9、10及11对应的内含子。在某些实施方案中，核酸构建体包含至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子8至11对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7对应的内含子。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型人类LMNA基因的内含子10对应的内含子，且缺少与野生型人类LMNA基因的内含子1至7对应的内含子。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型人类LMNA基因的内含子8至11对应的内含子，且缺少与野生型人类LMNA基因的内含子1至7对应的内含子。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型人类LMNA基因的内含子9及10对应的内含子，且缺少与野生型人类LMNA基因的内含子1至8及11对应的内含子。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型人类LMNA基因的内含子10对应的内含子，且缺少与野生型人类LMNA基因的内含子1至9及11对应的内含子。在某些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至调节组件。在某些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至具有少于或等于400个碱基对(bp)、300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp的调节组件。在某些实施方案中，调节组件为以下者中的任一者或其组合：SEQ ID NO:30至58中的任一者、CBA、CMV、SCP、SERpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP、CMVe、CAG或EFS。在某些实施方案中，调节组件为SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、CBA或minCMV中的任一者或其组合。在某些实施方案中，调节组件为SEQ ID NO:33。在某些实施方案中，调节组件为CBA。

在某些实施方案中，调节组件为minCMV。在某些实施方案中，调节组件为细胞类型选择性的。在某些实施方案中，调节组件在心肌细胞中选择性表达。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含为SEQ ID NO:1至10中的任一者的序列或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽或其生物活性片段。在某些实施方案中，核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽或其生物活性片段。在某些实施方案中，核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽或其生物活性片段。在某些实施方案中，核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽或其生物活性片段及包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽或其生物活性片段。在某些实施方案中，核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽或其生物活性片段及包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽或其生物活性片段。在某些实施方案中，核苷酸序列进一步包含多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，本发明提供一种包含编码核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列的核酸构建体，其中该构建体至少包含野生型人类LMNA基因的内含子8或内含子11。在一些实施方案中，内含子8包含与SEQ ID NO:77的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，内含子11包含与SEQ ID NO:80的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子10。在一些实施方案中，内含子10包含与SEQ ID NO:79的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子9。在一些实施方案中，内含子9包含与SEQ ID NO:78的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，核苷酸序列包含野生型人类LMNA基因的内含子8及11。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子8。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子11。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子9及10。在一些实施方案中，核苷酸序列包含野生型人类LMNA基因的内含子8、9、10及11。在一些实施方案中，核酸构建体缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7对应的内含子。在一些实施方案中，核酸构建体缺少野生型人类LMNA基因的内含子1至7。在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子9，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7对应的内含子。在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含野生型人类LMNA基因的内含子10，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7对应的内含子。在一些实施方案中，核酸构建体包含野生型人类LMNA基因的内含子8至11，且缺少野生型人类LMNA基因的内含子1至7。在一些实施方案中，调节组件具有少于或等于500个碱基对。在一些实施方案中，调节组件具有少于或等于900个碱基对。在一些实施方案中，调节组件具有少于或等于800个碱基对(bp)、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp。在一些实施方案中，调节组件为以下者中的任一者或其组合：SEQ ID NO:30至58中的任一者、SEQ ID NO:102、CBA、CMV、SCP、SERpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP、CMVe、Myh6、肌间线蛋白(Desmin)、cTnT、α-MHC、MLC-2、CAG或EFS。在一些实施方案中，调节组件为SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、CBA或minCMV中的任一者或其组合。在一些实施方案中，调节组件为SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，调节组件为CBA。在一些实施方案中，调节组件为minCMV。在一些实施方案中，调节组件为细胞类型选择性的。在一些实施方案中，调节组件在心肌细胞中选择性表达。在一些实施方案中，调节组件为Myh6、肌间线蛋白、cTnT、α-MHC或MLC-2中的任一者或其组合。在一些实施方案中，调节组件为cTNT。在一些实施方案中，cTNT调节组件包含SEQ ID NO:101。在一些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3或SEQID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含为SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:8的序列或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码氨基酸序列与SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核纤层蛋白A多肽及氨基酸序列与SEQ IDNO:13的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列编码核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽，该核纤层蛋白A多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，该核纤层蛋白C多肽包含与SEQ IDNO:13的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的核苷酸构建体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的核苷酸构建体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子11。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的核苷酸构建体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8及内含子11。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步编码野生型LMNA基因的内含子9及10中的一或多者。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的核苷酸构建体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8至11。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致。在一些实施方案中，核苷酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的序列或其密码子优化变体及/或片段。在一些实施方案中，核苷酸序列编码：a)具有与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽及b)具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列编码：a)具有与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽及b)具有与SEQID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:12至19或21中的任一者或多者的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列不包含与野生型LMNA基因的内含子1至7对应的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至调节组件。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至具有少于900bp的调节组件。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至具有少于或等于900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp的调节组件。在一些实施方案中，调节组件为以下者中的任一者或其组合：SEQ ID NO:30至58中的任一者、SEQ ID NO:102、CBA、CMV、SCP、SERpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP、CMVe、Myh6、肌间线蛋白、cTnT、α-MHC、MLC-2、CAG或EFS。

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所提供的核酸构建体中的任一者的病毒载体。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽，(b)核纤层蛋白C多肽，或(c)核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或(a)至(c)中的任一者的生物活性变体及/或片段。在某些实施方案中，核苷酸序列包含LMNA基因的至少一个非编码区域。在某些实施方案中，非编码区域为内含子。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子10。在某些实施方案中，病毒载体包含本申请所提供的核酸构建体，其中核苷酸序列进一步编码野生型LMNA基因的内含子8、9及11中的一或多者。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子9及10。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8至11。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含为SEQ ID NO:1至10中的任一者的序列或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A多肽的核苷酸序列，该核纤层蛋白A多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A多肽的核苷酸序列，该核纤层蛋白A多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白C多肽的核苷酸序列，该核纤层蛋白C多肽包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其生物活性片段至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码(a)具有与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽及(b)具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码(a)具有与SEQ IDNO:21的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽，及(b)具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽。在某些实施方案中，病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:12至21或24的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列不包含与野生型LMNA基因的内含子1至7对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含可操作地连接至调节组件的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含可操作地连接至具有少于或等于400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp的调节组件的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件为以下者中的任一者或其组合：SEQID NO:30至58中的任一者、CBA、CMV、SCP、SERpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP、CMVe、CAG或EFS。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件为SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、CBA或minCMV中的任一者或其组合。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件为SEQ ID NO:33。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件为CBA。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件为minCMV。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件为细胞类型选择性的。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件在神经元细胞、视网膜细胞、肾细胞、骨胳肌细胞、脂肪细胞或心肌细胞中选择性表达。在某些实施方案中，病毒载体包含调节组件，该调节组件在心肌细胞中选择性表达。在某些实施方案中，病毒载体包含进一步包含多腺苷酸化信号的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体为腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体。在某些实施方案中，AAV载体为AAV6、AAV9、scAAV6或scAAV9。在某些实施方案中，AAV载体包含进一步包含5'AAV反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)序列及3'AAV ITR序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供一种病毒载体，其包含编码核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列，其中该核苷酸序列至少包含野生型人类LMNA基因的内含子8或内含子11。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子11。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8及内含子11。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步编码野生型LMNA基因的内含子9及10中的一或多者。在一些实施方案中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体，该核苷酸序列编码：(a)野生型LMNA基因的外显子1至12；及(b)野生型LMNA基因的内含子8至11。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQID NO:8的核苷酸序列或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致。在一些实施方案中，核苷酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8的序列或其密码子优化变体及/或片段。在一些实施方案中，核苷酸序列编码：a)具有与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽及b)具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列编码：a)具有与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白A多肽及b)具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:12至19或21中的任一者或多者的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，核苷酸序列不包含与野生型LMNA基因的内含子1至7对应的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至调节组件。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至具有少于500bp的调节组件。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至具有少于900bp的调节组件。在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至具有少于或等于800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp的调节组件。在一些实施方案中，调节组件为以下者中的任一者或其组合：SEQ ID NO:30至58中的任一者、SEQ ID NO:102、CBA、CMV、SCP、SERpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP、CMVe、Myh6、肌间线蛋白、cTnT、α-MHC、MLC-2、CAG或EFS。在一些实施方案中，调节组件为SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、CBA或minCMV中的任一者或其组合。在一些实施方案中，调节组件为SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，调节组件为CBA。在一些实施方案中，调节组件为minCMV。在一些实施方案中，调节组件为细胞类型选择性的。在一些实施方案中，调节组件在神经元细胞、视网膜细胞、肾细胞、骨胳肌细胞、脂肪细胞或心肌细胞中选择性表达。在一些实施方案中，调节组件在心肌细胞中选择性表达。在一些实施方案中，调节组件为Myh6、肌间线蛋白、cTnT、α-MHC或MLC-2中的任一者或其组合。在一些实施方案中，调节组件为cTNT。在一些实施方案中，cTNT调节组件包含SEQ ID NO:101。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，病毒载体为腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、scAAV1、scAAV2、scAAV5、scAAV6、scAAV8或scAAV9。在一些实施方案中，核苷酸序列进一步包含5'AAV反向末端重复(ITR)序列及3'AAVITR序列。

在一些实施方案中，本发明提供一种病毒颗粒，其包含如本文所提供的病毒载体中的任一者。在某些实施方案中，病毒颗粒包含AAV的壳体蛋白。在某些实施方案中，AAV的壳体蛋白为AAV6或AAV9。

在一些实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含如本文所提供的核酸构建体、病毒载体或病毒颗粒中的任一者。

在一些实施方案中，本发明提供医药组合物，其包含如本文所提供的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒或宿主细胞中的任一者；及一或多种医药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗受试者中的核纤层蛋白病的方法，其包含向有需要的受试者投予治疗有效量的如本文所提供的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物中的任一者。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于在受试者中表达(a)核纤层蛋白A多肽、(b)核纤层蛋白C多肽或(c)核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或(a)-(c)中的任一者的生物活性变体及/或片段的方法，其包含向该受试者投予治疗有效量的如本文所提供的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物中的任一者。

在一些实施方案中，本发明提供一种用于增加受试者中的(a)功能性核纤层蛋白A多肽、(b)功能性核纤层蛋白C多肽或(c)功能性核纤层蛋白A多肽及功能性核纤层蛋白C多肽或(a)-(c)中的任一者的生物活性变体及/或片段的表达的方法，其包含向该受试者投予治疗有效量的如本文所提供的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物中的任一者。

在某些实施方案中，根据本文所揭示的方法中的任一者治疗的受试者患有核纤层蛋白病。在某些实施方案中，核纤层蛋白病为以下者中的任一者或多者：恰克-马里-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎缩症(Emery-Dreifussmuscular dystrophy)、家族性部分脂质营养不良、哈钦森-吉尔福德氏早年衰老症候群(Hutchinson-Gilford progeria syndrome)、肢带型肌肉萎缩症、LMNA相关先天性肌肉萎缩症、下颌末端(mandibuloacral)发育不良、心律失常性(arrhythmogenic)右心室心肌病、家族性心房微颤、左心室致密化不全(noncompaction)或扩张型心肌症。在某些实施方案中，核纤层蛋白病为扩张型心肌症。在某些实施方案中，将本文所提供的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物中的任一者经心肌内、静脉内、肌内、鞘内、皮下、全身性或局部投予至心肌中。在某些实施方案中，将本文所提供的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物中的任一者经静脉内或全身性投予。

附图简单说明

本发明的新颖特征在随附权利要求中细致阐述。将参考阐述利用本发明原理的说明性实施方案及其随附附图通过以下详细描述来获得对本发明的特征及优势的更优选理解：

[图1]说明用于表达核纤层蛋白A的完整病毒载体基因组构建体的载体图谱。病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体，该腺相关病毒(AAV)载体包含CMV启动子、具有SEQ ID NO:31的增强子、包含核纤层蛋白A的外显子1至12的核纤层蛋白同种型A插入序列及多腺苷酸化序列信号。

[图2]说明用于表达核纤层蛋白C的完整病毒载体基因组构建体的载体图谱。病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体，该腺相关病毒(AAV)载体包含CMV启动子、具有SEQ ID NO:31的增强子、包含核纤层蛋白C的外显子1至10的核纤层蛋白同种型C插入序列及多腺苷酸化序列信号。

[图3]说明用于表达核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的完整病毒载体基因组构建体(微小基因1)的载体图谱。病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体，该腺相关病毒(AAV)载体包含CMV启动子，具有SEQ ID NO:31的增强子，包含核纤层蛋白A/C的外显子1至12、核纤层蛋白A/C的内含子8至11的核纤层蛋白同种型A/C插入序列及多腺苷酸化序列信号。

[图4]说明用于表达核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的完整病毒载体基因组构建体(微小基因2)的载体图谱。病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体，该腺相关病毒(AAV)载体包含CMV启动子，具有SEQ ID NO:31的增强子，包含核纤层蛋白A/C的外显子1至12、核纤层蛋白A/C的内含子9及10的核纤层蛋白同种型A/C插入序列及多腺苷酸化序列信号。

[图5]说明用于表达核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的完整病毒载体基因组构建体(微小基因3)的载体图谱。病毒载体包含腺相关病毒(AAV)载体，该腺相关病毒(AAV)载体包含CMV启动子，具有SEQ ID NO:31的增强子，包含核纤层蛋白A/C的外显子1至12、核纤层蛋白A/C的内含子10的核纤层蛋白同种型A/C插入序列及多腺苷酸化序列信号。

[图6]为展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C同种型均产生自HEK293细胞中的LMNA微小基因构建体1的西方墨点分析。

[图7]为表明LMNA微小基因构建体能够在HEK293T细胞(左侧)及iPS心肌细胞(右侧)中均表达核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者的mRNA表达水平的图示。

[图8]为展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C同种型均产生自活体外微小基因构建体1(293T细胞)、及活体内心脏及肝脏组织(下图来自24周大的野生型及杂合型Lmna+～雄性小鼠模型动物的心脏组织)中的西方墨点分析。

[图9]为展示当用携带微小基因构建体1的AAV病毒给药时LMNA

[图10A及图10B]展示当通过RNAseq测量时核纤层蛋白A及核纤层蛋白C同种型在用携带微小基因构建体1的AAV9处理的小鼠中的活体内表达。图10A展示在普遍存在的启动子控制下核纤层蛋白A及核纤层蛋白C在心脏及肝脏中的表达。图10B展示在心脏特异性启动子(cTNT)控制下核纤层蛋白A及核纤层蛋白C在心脏及肝脏中的表达。

[图11A至11C]为各自并入鸡β肌动蛋白启动子的数种不同构建体的简化示意图。在图11A中，构建体包含CBA启动子，包含核纤层蛋白A/C的外显子1至12、核纤层蛋白A/C的内含子8至11的核纤层蛋白同种型A/C插入序列及多腺苷酸化序列信号。在图11B中，构建体包含CBA启动子，包含核纤层蛋白A/C的外显子1至12、核纤层蛋白A/C的内含子9及10的核纤层蛋白同种型A/C插入序列及多腺苷酸化序列信号。在图11C中，构建体包含CBA启动子，包含核纤层蛋白A/C的外显子1至12、核纤层蛋白A/C的内含子10的核纤层蛋白同种型A/C插入序列及多腺苷酸化序列信号。

[图12]为展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C同种型在HEK293细胞中编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的LMNA微小基因构建体中的表达的西方墨点分析。

[图13]为表明在CMV启动子下编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的LMNA微小基因构建体能够在HEK293T细胞中表达核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的mRNA表达水平的图示。特别是的在HEK293T细胞中表达核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者的编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的LMNA微小基因。

具体实施方式

核纤层蛋白A及核纤层蛋白C为纤维核薄层(位于核包膜的内膜与DNA之间的复合分子接口)的组成性组分。核纤层蛋白A及核纤层蛋白C具有在机械核膜维持至基因调节范围内的不同生理作用。通过常用替代性剪接LMNA基因编码至少三种同种型(核纤层蛋白A、核纤层蛋白C及核纤层蛋白A△10)。LMNA含有十二个外显子，其通过外显子10的替代性剪接产生核纤层蛋白C及前核纤层蛋白A(成熟核纤层蛋白A的前体)的转录物。两种同种型的前566个氨基酸(由外显子1至10编码)相同，但其羧基末端序列相异。前核纤层蛋白A在C末端处含有额外98个特有氨基酸(由外显子11至12编码)，而核纤层蛋白C以外显子10序列终止且具有6个独特C末端氨基酸。前核纤层蛋白A经处理以形成核纤层蛋白A，一种646个氨基酸长蛋白。同时，核纤层蛋白C由572个氨基酸组成。

人类中的LMNA突变引起多种疾病，包括心肌病、肌肉萎缩症及早老症。已识别超过500种致病突变，其中一些引起例如扩张型心肌症的疾病。扩张型心肌症的特征在于左心室或两个心室的扩张及减弱的收缩以及减弱的收缩性功能。扩张型心肌症的发生率在1:2500名个体至1:250名个体范围内。尽管为罕见疾病，扩张型心肌症表现出严重的健康负荷，通常引起心律不齐、血栓栓塞及在疾病的任何阶段的猝死。截至2014年，已在LMNA基因中识别出165种扩张型心肌症相关突变(Tesson F.Cardiol J.2014；21(4):331-42)。这些突变包括错义/无意义突变、剪接突变、少量缺失、少量插入、少量插入缺失、总体缺失或总体插入。大部分引起扩张型心肌症的LMNA突变为存在于整个基因中的产生突变核纤层蛋白A/C蛋白的常染色体显性错义突变。

本发明涵盖用于治疗、预防或抑制扩张型心肌症及其他核纤层蛋白病的组合物及方法。在一个方面中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或前述任一者的密码子优化变体及/或片段。在一个方面中，本发明提供一种包含核苷酸序列的病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；或前述任一者的密码子优化变体及/或片段。在另一方面中，本发明提供一种核酸，其包含可操作地连接至以下者中的任一者或组合的核苷酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、CBA及/或minCMV，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽或其密码子优化变体及/或其片段。在另一方面中，本发明提供一种核酸，其包含可操作地连接至以下者中的任一者或组合的核苷酸序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、CBA及/或minCMV，该核苷酸序列编码(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段或其密码子优化变体及/或其片段。在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗受试者中的核纤层蛋白病的方法，其包含投予本文所揭示的核酸、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物中任一的一或多者。

使用本文所提供的核酸、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞、医药组合物及方法可治疗或预防广泛多种核纤层蛋白病。使用本发明的核酸、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞、医药组合物及方法可治疗或预防的核纤层蛋白病包括(但不限于)恰克-马里-杜斯氏病、埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎缩症、家族性部分脂质营养不良、哈钦森-吉尔福德氏早年衰老症候群、肢带型肌肉萎缩症、LMNA相关先天性肌肉萎缩症、下颌末端发育不良、致心律不整型右心室心肌病、家族性心房微颤、左心室致密化不全及扩张型心肌症。

A.通用技术

除非本文中另外定义，否则本文中所列举的科学及技术术语应具有本领域技术人员通常所理解的含义。一般而言，与本文所述的药理学、细胞及组织培养、分子生物学、细胞及癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白及核酸化学结合使用的命名法及其技术为所属领域中熟知且常用者。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。

除非另有指示，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，其完全处于所属技术领域的范围内。此类技术完整解释于以下文献中，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell编,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Sambrook及Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow及Lane Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1998)；Coligan等,Short Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(2003)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wile及Sons,1999)。

酶促反应及纯化技术根据制造商的说明书如所属领域中通常所实行或如本文所描述执行。本文所述的与分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学、及医学及医药化学结合使用的命名法、及其实验室程序及技术为所属领域中熟知且常用的。标准技术是用于化学合成及化学分析。

B.定义

在本说明书及实施方案通篇中，措词「包含(comprise)」或例如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」的变体应理解为暗示包括所述整数或整数群但不排除任何其他整数或整数群。

应理解在本文中描述的任何地方的实施方案皆用语言「包含」描述，或还提供用术语「由组成」及/或「基本上由组成」所描述的类似实施方案。

术语「包括」用以意谓「包括(但不限于)」。「包括」及「包括(但不限于)」可互换使用。

在术语「例如(e.g./for example)」之后的任何实例并不意谓为穷尽性或限制性的。

除非另外为情形所需，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。

借助于实例，「组件」意谓一种组件或大于一种组件。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围及参数为近似值，但实施方案中所阐述的数值尽可能精确地报导。然而，任何数值均固有地含有因其对应测试量测值中发现的标准偏差所必然引起的某些误差。此外，本文中所揭示的所有范围应理解为涵盖任何及所有其中所包含的子范围。举例而言，「1至10」的陈述范围应视为包括最小值1与最大值10之间(且包括)的任何及所有子范围；即，以最小值1或更大(例如1至6.1)开始且以最大值10或更小(例如5.5至10)结束的所有子范围。

在本发明的方面或实施方案根据马库什群组(Markush group)或其他替代群组描述的情况下，本发明不仅涵盖整体列出的整个群组，而且还单独地涵盖群组的每一成员及主群组的所有可能子群，且还涵盖缺乏一或多个群组成员的主群组。本发明还设想明确排除本发明中的群组成员中任一者的一或多者。

如本文所使用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式「一(a/an)」及「该」意欲还包括复数形式。此外，就实施方式及/或申请专利范围中使用的术语「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其变化形式的程度而言，此类术语意欲以类似于术语「包含」的方式为包括性的。

除非另有指示，否则术语「核纤层蛋白A」在本文中用以指前核纤层蛋白A多肽及/或成熟核纤层蛋白A多肽。术语涵盖通过前核纤层蛋白A的转译后修饰(例如自前核纤层蛋白A的羧基末端移除18个氨基酸以形成成熟核纤层蛋白A)所形成的所有核纤层蛋白A多肽。术语包括所有生物活性核纤层蛋白A蛋白、其片段或变体。

术语「AAV」为腺相关病毒的缩写，且可用于指代病毒自身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语涵盖所有血清型、亚型以及天然存在及重组形式两者。缩写「rAAV」指重组腺相关病毒。术语「AAV」包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10及其杂合体，禽类AAV、牛类AAV、犬类AAV、马类AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV及绵羊类AAV。AAV的各种血清型的基因组序列，以及自然末端重复序列(TR)的序列、Rep蛋白及壳体子单元的序列为所属领域中已知的。此类序列可发现于文献中或例如GenBank的公共数据库中。如本文所用的「rAAV载体」指包含不属于AAV来源的多核苷酸序列(即与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，典型地为用于细胞的遗传转化的所关注序列。一般而言，异源多核苷酸通过至少一个，且一般通过两个AAV反向末端重复序列(ITR)侧接。ITR序列为所属领域中很好理解的术语且指发现于反向中的病毒基因组的末端处的相对短的序列。rAAV载体可为单股(ssAAV)或自补的(scAAV)。「AAV病毒」或「AAV病毒颗粒」指由至少一个AAV壳体蛋白及壳体化多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒。若颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组，例如待递送至哺乳动物细胞的转殖基因以外的多核苷酸)，则其典型地称为「rAAV病毒颗粒」或简称为「rAAV颗粒」。

术语「约(about)」或「大致(approximately)」意谓在如由本领域技术人员所测定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或测定该值，即测量系统的限制。举例而言，根据所属领域中的实践，「约」可意谓在一个或大于一个标准偏差的范围内。或者，「约」可意谓高于或低于既定值至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。

术语「测定(determining)」、「测量(measuring)」、「估量(evaluating)」、「评估(assessing)」、「检定(assaying)」、「分析(analyzing)」及其语义上的同义词在本文中可互换使用以指任何测量形式，且包括确定组件是否存在(例如检测)。这些术语可包括定量及/或定性测定两者。评估可为相对或绝对的。

「表达盒」指包含一或多种可操作地连接至编码序列(例如基因)的调节组件的用于表达的核分子。

术语「有效量」或「治疗有效量」指足以影响如下文所定义的预期应用，包括(但不限于)疾病治疗的本文所述的组合物的量。治疗有效量可根据预期治疗应用(于细胞中或活体内)，或所治疗的受试者及疾病病况(例如受试者的体重及年龄、疾病病况的严重程度)，投予方式等而改变，其可由本领域技术人员容易地确定。该术语也适用于将在目标细胞中诱导特定反应的剂量。具体剂量将取决于选择的特定组合物、待遵循的给药方案、其是否与其他化合物组合投予、投予时机、其所投予的组织及运载其的物理递送系统而变化。

核苷酸或肽序列的「片段」指短于全长或参考DNA或蛋白序列的序列片段。

当提及例如蛋白、多肽、核酸及/或多核苷酸的分子时如本文所用的术语「生物活性」意谓分子保持至少一个实质上与全长或参考蛋白、多肽、核酸及/或多核苷酸的生物活性类似的生物活性(功能性或结构性)。举例而言，「生物活性」核纤层蛋白A或核纤层蛋白C蛋白或其片段或变体将保留至少一个实质上分别与全长或参考野生型核纤层蛋白A或核纤层蛋白C蛋白类似的活性。

术语「宿主细胞」、「宿主细胞系」及「宿主细胞培养物」可互换使用且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括「转化体」及「经转化细胞」，其包括初级经转化细胞及由其衍生的后代，不考虑继代的数目。后代的核酸含量与母细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与针对最初转化细胞所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变型后代。

如本文所用的术语「人类衍生的」指发现于人类基因组(或人类基因组构建)中的序列或与其同源的序列。同源序列可为具有与人类基因组的区域相比有至少80％序列一致性(例如如通过BLAST所测量)的区域的序列。举例而言，与人类序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的序列视为人类衍生的。在一些情况下，调节组件含有人类衍生序列及非人类衍生序列以使得整个调节组件与人类基因组序列具有低一致性，而调节组件的一部分与人类基因组中的序列具有100％序列一致性(或局部序列一致性)。

术语「活体外」指发生于受试者体外的事件。举例而言，活体外测试涵盖受试者体外的任何测试操作。活体外测试涵盖基于细胞的测试，其中采用存活或死亡细胞。活体外测试也涵盖无细胞测试，其中不采用完整细胞。

术语「活体内」指发生于受试者体内的事件。

「经分离」核酸指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外，存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处，或仅含有编码序列。

如本文所用，「可操作地连接(operably linked)」、「可操作连接(operablelinkage)」、「可操作地连接(operatively linked)」或其语义上的同义词指基因组件，例如启动子、增强子、多腺苷酸化序列等的并接，其中组件呈允许其以预期方式操作的关系。举例而言，若调节组件帮助引发编码序列的转录，则调节组件(其可包含启动子及/或增强子序列)可操作地连接至编码区。在调节组件与编码区之间可存在中间残基，只要维持此功能关系即可。

「医药学上可接受的载剂」指医药调配物或组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。医药学上可接受的载剂包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语「医药调配物」或「医药组合物」指呈准许其中所含活性成分的生物活性有效的形式，且不含有对调配物将投予的受试者有不可接受毒性的额外组分的制剂。

术语「调节组件」指能够影响(例如增加、减少或调整)可操作地连接的序列(例如基因)的表达的核酸序列或基因组件。调节组件包括(但不限于)启动子、增强子、抑制子、静止子、绝缘子序列、内含子、UTR、反向末端重复(ITR)序列、长末端重复序列(LTR)、稳定性组件、转译后反应组件或polyA序列或其组合。调节组件可在DNA及/或RNA水平下，例如通过调整转录阶段、转录后阶段的基因表达或转译阶段的基因表达；通过调整翻译水平(例如稳定用于翻译的mRNA的稳定性组件)、RNA裂解、RNA剪接、及/或转录终止；通过向增加基因表达的编码区补充转录因子；通过提高产生RNA转录物的速率、提高产生RNA的稳定性及/或提高蛋白自RNA转录物合成的速率；及/或通过防止RNA分解及/或提高其稳定性以促进蛋白合成来起作用。在一些实施方案中，调节组件指增强子、抑制子、启动子或其组合，尤其增强子加启动子组合或抑制子加启动子组合。在一些实施方案中，调节组件衍生自人类序列。

术语「受试者(subject)」及「个体(individual)」在本文中可互换使用以指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人类。本文所描述的方法可适用于人类治疗学、兽医学应用及/或疾病或病况的动物模型中的临床前研究。

如本文所用，术语「治疗(treat/treatment)」、「疗法」等指获得所需药理学及/或生理学功效，包括(但不限于)缓解、推迟或减缓进展；减少影响或症状；预防发作；预防复发；抑制、减轻疾病或病症的发作；获得关于疾病、病症或医学病况的有益或所需结果，例如治疗效益及/或预防效益。如本文所用的「治疗」涵盖对哺乳动物，尤其人类的疾病的任何治疗，且包括：(a)防止疾病出现于易患有疾病或处于获得疾病的风险下但尚未诊断患有该疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即，遏制其发展；及(c)缓解疾病，即，促使疾病消退。治疗效益包括根除或改善所治疗的潜在病症。而且，经由根除或改善与潜在病症相关的一或多种生理症状来达成治疗益处，从而观测到受试者的改善，尽管该受试者仍可能罹患潜在病症。在一些情况下，为了预防效益，向处于罹患特定疾病风险下的受试者，或向报告疾病的生理症状中的一或多者，即使尚未得到此疾病的诊断的受试者投予组合物。本发明的方法可用于任何哺乳动物。在一些情况下，治疗可引起症状的减少或停止。预防性功效包括推迟或消除疾病或病况的出现；推迟或消除疾病或病况的症状发作；减缓、阻止或逆转疾病或病况的进展；或其任何组合。

核苷酸序列的「变体」指与最常见野生型DNA序列(例如通过GenBank存取编号提及的cDNA或序列)或指定参考序列相比具有基因改变或突变的序列。

如本文所用的「载体」指一种核酸分子，其可用于介导与其连接的另一核酸分子递送至其可复制或表达的细胞中。该术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入至已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够导引可操作地连接其的核酸的表达。此类载体在本文中称为「表达载体」。载体的其他实例包括质粒及病毒载体。

一般而言，「序列一致性」或「序列同源性」可互换使用，分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应性。两个或两个以上序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定其「一致性百分比」，也称为「同源性百分比」来比较。与参考序列(例如核酸或氨基酸序列)的一致性百分比可计算为两个最佳比对序列之间精确相配物的数目除以参考序列的长度且乘以100。当为了序列一致性测定相配物的数目时未将保守取代视为相配物。应了解，当第一序列(A)的长度不等于第二序列(B)的长度时，A:B序列的一致性百分比将不同于B:A序列的一致性百分比。序列比对(例如出于评估一致性百分比的目的)可由任何适合的比对算法或程序执行，包括(但不限于)尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(参见例如可于全球信息网ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上获得的EMBOSS Needle比对器)、BLAST算法(参见例如可于全球信息网blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上获得的BLAST比对工具)、史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)(参见例如可于全球信息网ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/上获得的EMBOSS Water比对器)及Clustal Omega比对程序(参见例如全球信息网clustal.org/omega/及F.Sievers等,Mol Sys Biol.7:539(2011))。最佳比对可使用所选算法的任何适合的参数，包括预设参数来评估。BLAST程序基于Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)的比对方法及如Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；及Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)中所论述的比对方法。

除非另有指示，否则本文所用的所有术语具有其对于本领域技术人员所意味的相同含义且本发明的实践将采用分子生物学、微生物学及重组DNA技术的常规技术，其在本领域技术人员的的认知内。

C.核酸构建体

1.核纤层蛋白构建体

本文提供核酸构建体，其包含编码核纤层蛋白A、核纤层蛋白C、核纤层蛋白A及核纤层蛋白C(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白C(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含可操作地连接至调节组件的转殖基因，其中该转殖基因编码(a)核纤层蛋白A(或其生物活性变体或片段)；(b)核纤层蛋白C(或其生物活性变体或片段)；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段。在某些实施方案中，转殖基因包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，转殖基因包含编码核纤层蛋白C(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，转殖基因包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者(或其生物活性变体或片段)或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。

在一些情况下，核酸构建体包含核酸，该核酸编码以准许转殖基因在目标细胞(例如心肌细胞(cardiomyocyte)或心肌细胞(myocardiocyte)，这些术语在本文中可互换使用)中的转录、翻译及/或表达的方式可操作地连接至调节组件的序列。转殖基因(异源核酸序列)可衍生自任何生物体。在某些实施方案中，转殖基因衍生自人类。在某些实施方案中，转殖基因编码核纤层蛋白A(或其生物活性变体或片段)的成熟形式。在某些实施方案中，转殖基因编码前核纤层蛋白A (prelamin A)(或其生物活性变体或片段)。在某些实施方案中，转殖基因编码核纤层蛋白C(或其生物活性变体或片段)。在某些实施方案中，转殖基因编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者(或其生物活性变体或片段)。在某些实施方案中，转殖基因编码前核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者(或其生物活性变体或片段)。在一些实施方案中，转殖基因编码一种多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，转殖基因编码一种多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，转殖基因编码一种多肽，该多肽包含与SEQID NO:13的氨基酸序列或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。

在某些实施方案中，核酸构建体可包含一或多种转殖基因。在一些实施方案中，转殖基因包含多于一种LMNA剪接变体(例如核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者)或衍生自多于一种LMNA剪接变体的片段。此可使用携带两个或两个以上异源序列的单一核酸构建体或使用携带编码两个或两个以上LMNA剪接变体(例如核纤层蛋白A及核纤层蛋白C)的单一序列的单一核酸构建体来实行。在一些实施方案中，转殖基因包含仅一种LMNA剪接变体(例如核纤层蛋白A或核纤层蛋白C)或衍生自一种LMNA剪接变体的片段。预期两个或两个以上各自携带一或多种编码至少一种LMNA剪接变体的异源序列的核酸构建体可分开或一起使用(例如在相同或不同病毒载体中)。在一些实施方案中，除LMNA基因、其剪接变体或片段以外，核酸构建体也可编码另外的蛋白、肽、RNA、酶或催化性RNA。

在某些实施方案中，本文所揭示的核酸构建体中的任一者包含编码野生型LMNA基因(例如SEQ ID NO:81至93)的外显子1至12及野生型LMNA基因(例如SEQ ID NO:77至80)的内含子8至11。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码野生型LMNA基因(例如SEQ ID NO:81至93)的外显子1至12及野生型LMNA基因(例如SEQ ID NO:78及79)的内含子9及10。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码野生型LMNA基因(例如SEQ ID NO:81至93)的外显子1至12及野生型LMNA基因(例如SEQ ID NO:79)的内含子10的核苷酸序列。

在某些实施方案中，核酸构建体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:1至10中的任一者的核酸序列及与前述任一者及前述任一者的片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含核苷酸序列，该核苷酸序列为SEQ ID NO:1至10中的任一者的序列或其密码子优化变体及/或片段。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少60％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少65％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少70％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少75％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少82％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少85％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少87％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少91％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少92％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少93％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ IDNO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少94％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少96％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少97％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少98％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少99％一致的核苷酸序列。

在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12或21的多肽序列的SEQ ID NO:1至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12或21的多肽序列的SEQ ID NO:6至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:13的多肽序列的SEQ ID NO:2至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:13的多肽序列的SEQ ID NO:7至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:3至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:4至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ IDNO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:5至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:8至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:9至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含与编码SEQ IDNO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:10至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。

在某些实施方案中，核酸构建体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:3至5中的任一者的核酸序列及/或与前述任一者及前述任一者的片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含为SEQ ID NO:3至5中的任一者的序列或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少60％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ IDNO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少65％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少70％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少75％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少82％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少85％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少87％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少91％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少92％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少93％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少94％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少96％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少97％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少98％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少99％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段100％一致的核苷酸序列。

在某些实施方案中，核酸构建体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码包含SEQ IDNO:12至21及24中的任一者的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽，及与前述任一者至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的多肽。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少60％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少65％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少70％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少75％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少80％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少82％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少85％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少87％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少90％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ IDNO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少91％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少92％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少93％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少94％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少95％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少96％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少97％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少98％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少99％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段100％一致的多肽的核苷酸序列。

在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:12或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQID NO:21或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:13或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A且还编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A具有与SEQ ID NO:12或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，该核纤层蛋白C具有与SEQ ID NO:13或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A且还编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A具有与SEQ IDNO:21或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列,该核纤层蛋白C具有与SEQ ID NO:13或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A及核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:12及/或13的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A及核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:21及/或13的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A且还编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A具有SEQID NO:12的氨基酸序列，该核纤层蛋白C具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A且还编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列，该核纤层蛋白C具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不包含一或多种、两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上、十种或十种以上或十一种或十一种以上来自野生型LMNA基因的内含子。在某些实施方案中，核酸构建体不包含与野生型LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体不包含与野生型LMNA基因的内含子1至8及11(例如SEQ ID NO:70至77及80)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体不包含与野生型LMNA基因的内含子1至9及11(例如SEQ ID NO:70至78及80)对应的核苷酸序列。

在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含一或多种、两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上、十种或十种以上或十一种或十一种以上的内含子(例如SEQ ID NO:70至80)。在某些实施方案中，一或多种内含子对应于来自野生型LMNA基因的内含子，例如野生型人类LMNA基因。在其他实施方案中，一或多种内含子为合成内含子。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得核苷酸序列能够以剪接依赖性方式编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的成熟mRNA。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生比编码核纤层蛋白A的成熟mRNA更多的编码核纤层蛋白C的成熟mRNA。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生比编码核纤层蛋白C的成熟mRNA更多的编码核纤层蛋白A的成熟mRNA。在某些实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生约相同水平的编码核纤层蛋白A的成熟mRNA及编码核纤层蛋白C的成熟mRNA。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型LMNA基因的内含子8至11(例如SEQID NO:77至80)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型LMNA基因的内含子9及10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与野生型LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一个(但非所有)野生型人类LMNA基因的内源性内含子。在一些实施方案中，核酸构建体包含至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子9至10(例如SEQID NO:78及79)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子9至10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子9至10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至8及11(例如SEQ ID NO:70至77及80)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子10(例如SEQ IDNO:79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，核酸包含与野生型人类LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至9及11(例如SEQ ID NO:70至78及80)对应的内含子。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子8对应的内含子包含与SEQ ID NO:77至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子9对应的内含子包含与SEQ ID NO:78至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子10对应的内含子包含与SEQ ID NO:79至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子11对应的内含子包含与SEQ ID NO:80至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。

在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子8。在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子9。在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子10。在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子11。在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子9及10。在一些情况下，核酸构建体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子8、9、10及11。

在某些实施方案中，核酸构建体包含有包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的核苷酸序列：SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者的核酸序列及与前述中的任一者或多者至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含核苷酸序列，该核苷酸序列为SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者的序列或其生物活性变体及/或片段。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少60％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少65％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少70％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少75％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少82％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少85％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少87％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少91％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少92％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少93％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少94％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少96％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少97％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少98％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少99％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸构建体包含与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段100％一致的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明的转殖基因包含这些序列的变体，其中此类变体可包括错义突变、无义突变、重复、缺失及/或添加。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:3中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:4中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:5中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:6中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ IDNO:7中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:8中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:9中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:10中所示的特定核酸序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12或21的多肽序列的SEQ ID NO:1至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12或21的多肽序列的SEQ ID NO:6至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:13的多肽序列的SEQ ID NO:2至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:13的多肽序列的SEQ ID NO:7至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:3至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:4至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:5至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:8至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:9至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，变体包含核酸构建体，该核酸构建体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:10至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列。

本领域技术人员应了解与核酸互补的核酸序列及核酸的变体也在本发明的范围内。核酸序列可为单股(编码或反义)或双股的，且可为DNA(基因体或合成的)、cDNA或RNA分子。RNA分子包括mRNA分子。其它的编码或非编码序列可(但不必要)存在于本发明的核酸序列内，且核酸序列可(但不必要)连接至其他分子及/或载体材料。在其他实施方案中，本发明的核酸序列可经分离、重组及/或与异源核苷酸序列融合。在一些实施方案中，本文所揭示的任何核苷酸(例如SEQ ID NO:1至10或其变体或片段)经密码子优化(例如为了人类表达而经密码子优化)。在一些实施方案中，转殖基因编码相对于野生型多肽(例如包含SEQID NO:12、13或21的氨基酸序列的多肽)具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代、缺失及/或添加的生物活性核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，转殖基因编码相对于野生型多肽(例如包含SEQ ID NO:12、13或21的氨基酸序列的多肽)具有1、2、3、4或5个氨基酸缺失的生物活性核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，转殖基因编码相对于野生型多肽(例如包含SEQ ID NO:12、13或21的氨基酸序列的多肽)具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的生物活性核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C多肽。在一些实施方案中，转殖基因编码相对于野生型多肽(例如包含SEQ ID NO:12、13或21的氨基酸序列的多肽)具有1、2、3、4或5个氨基酸插入的生物活性核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C多肽。

本领域技术人员将会认识到，由于基因密码的简并，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些带有与任何天然基因的核苷酸序列的最小同源性。尽管如此，本发明尤其预期因密码子使用的差异而改变的多核苷酸(即，密码子优化)。举例而言，通过一种以上三重态指定多种氨基酸。指定相同氨基酸的密码子或同义语(例如CAU及CAC为组氨酸的同义语)可引起不影响蛋白的氨基酸序列的「沉默」突变。本领域技术人员应了解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白的核酸的一或多个核苷酸(至多约3％至5％的核苷酸)中的这些变异可存在于既定物种的成员中。任何及全部此类核苷酸变异及所得氨基酸多态性在本发明的范围内。此外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因为由于核苷酸的一或多个突变(例如缺失、添加及/或取代)而改变的内源基因。所得mRNA及蛋白可(但不必要)具有经改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(例如杂合、扩增及/或数据库序列比较)来识别。

本发明的核酸/多核苷酸可使用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成方法为所属领域中所熟知且不必详细描述于本文中。本领域技术人员可使用本文所提供的序列及商用DNA合成器以产生所需DNA序列。在其他实施方案中，本发明的核酸还包括在高度严格条件下杂合至SEQ ID NO:1至10中的任一者(或其变体或片段)中所阐述的任何核苷酸序列或与其互补的序列的核苷酸序列。本领域技术人员将容易地理解可改变促进DNA杂合的适当严格条件。举例而言，其可在约45℃下以6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)执行杂合，随后在50℃下进行2.0x SSC洗涤。举例而言，洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃下约2.0xSSC的低严格度至50℃下约0.2x SSC的高严格度。另外，洗涤步骤中的温度可自室温(约22℃)下的低严格度条件增加至约65℃下的高严格度条件。可改变温度及盐两者，或温度或盐浓度可保持恒定，而使另一变量变化。在一个实施方案中，本发明提供在室温下6x SSC的低严格度条件下杂合，随后在室温下在2x SSC下洗涤的核酸。

如本文所提供，本文所揭示的任何LMNA转殖基因或其片段(例如编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的基因)可用以矫正或改善基因缺陷，这些基因缺陷可包括LMNA的正常变异基因产物以低于正常水平表达的缺陷或未表达功能变体的缺陷。在一些实施方案中，转殖基因序列编码单一LMNA同种型或其生物活性片段。本发明进一步包括使用多种转殖基因，例如两种或两种以上编码两种或两种以上LMNA同种型或其生物活性片段的转殖基因。在一特定实施方案中，不同LMNA同种型(例如核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C或其生物活性片段或变体)可通过利用单核苷酸序列的替代性剪接由同一转殖基因编码。在某些情形下，不同转殖基因可用以编码不同LMNA同种型或其生物活性片段(例如核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C或其生物活性片段或变体)。或者，多种不同LMNA同种型(例如核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C或其生物活性片段或变体)可由同一转殖基因编码。在一些实施方案中，单一转殖基因包括编码多种LMNA同种型(例如核纤层蛋白A及核纤层蛋白C或其生物活性片段或变体)的DNA，其中每个蛋白或其功能性片段的DNA通过一或多个内部核糖核酸酶进入位点(IRES)或自裂解2A肽分隔。在一些实施方案中，当编码子单元中的每一者的DNA的尺寸较小时，例如，编码子单元的DNA及IRES的总尺寸小于五千碱基，此为所期望的。作为IRES的替代物，DNA可通过一或多个在转译后事件中自分裂的编码2A肽的序列分隔。参见例如MX.Donnelly,等,J.Gen.Virol,78(Pt 1):13-21(1997年1月)；Furler,S.,等,Gene Ther.,8(11):864-873(2001年6月)；Klump H.,等,Gene Ther.,8(10):811-817(2001年5月)。此2A肽显著地小于IRES，使得其较适合在空间为限制因素时使用。在一些实施方案中，一或多种自裂解2A肽选自由T2A、P2A、E2A及F2A组成的组。

2.调节组件

在某些实施方案中，本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C构建体为核酸构建体的一部分，除核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列以外该核酸构建体还包含一或多种调节组件。在例示性实施方案中，本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C构建体为核酸构建体的一部分，该核酸构建体包含定位于核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C构建体的上游的启动子，以便能够驱动核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列在细胞中的表达。

在一个实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含启动子，该启动子包含与SEQID NO:30至69或100至102(如下文表3及4中所示)中的任一者至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列。在一个实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含启动子，该启动子具有可操作地连接至本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列中的任一者(例如包含SEQ ID NO:1至5(如下文表1中所示)中的任一者或其功能性片段的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列)的SEQ ID NO:30至69或100至102(如下文表3及4中所示)中的任一者。在一个实施方案中，核酸构建体包含启动子，该启动子包含与SEQ ID NO:102至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列。在一个实施方案中，核酸构建体包含具有SEQ ID NO:102的序列的启动子。在另一实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含调节组件，该调节组件具有两种或两种以上(例如两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上或2、3、4或5种)可操作地连接至本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列中的任一者(例如包含SEQ ID NO:1至5(如下文表1中所示)中的任一者或其功能性片段的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列)的SEQ ID NO:30至69或100至102(如下文表3及4中所示)中的任一者的组合。

在某些实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含启动子，该启动子具有可操作地连接至本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列中的任一者(例如包含SEQ IDNO:1至5(如下文表1中所示)中的任一者或其功能性片段的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列)的SEQ ID NO:30至69或100至102(如下文表3及4中所示)中的任一者。在某些实施方案中，启动子序列产生的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列在哺乳动物细胞中的表达相对于来自CMV启动子的相同核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列在相同类型的哺乳动物细胞中的表达水平大至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍或75倍，或至少20至90倍、20至80倍、20至70倍、20至60倍、30至90倍、30至80倍、30至70倍、30至60倍、40至90倍、40至80倍、40至70倍、40至60倍、50至90倍、50至80倍、50至70倍、50至60倍、60至90倍、60至80倍、60至70倍、70至90倍、70至80倍、80至90倍。在某些实施方案中，启动子序列驱动核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列在高百分比心肌细胞中的表达，例如含有核酸构建体的心肌细胞的至少20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更大，或至少20至90％、20至80％、20至70％、30至90％、30至80％、30至70％、40至90％、40至80％、40至70％、50至90％、50至80％、50至70％、60至90％、60至80％、60至70％、70至90％、70至80％、80至100％、80至95％、80至90％、90至100％或90至95％表达核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C构建体。在某些实施方案中，启动子序列驱动核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列在高百分比肝细胞中的表达，例如含有核酸构建体的肝细胞的至少20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更大，或至少20至90％、20至80％、20至70％、30至90％、30至80％、30至70％、40至90％、40至80％、40至70％、50至90％、50至80％、50至70％、60至90％、60至80％、60至70％、70至90％、70至80％、80至100％、80至95％、80至90％、90至100％或90至95％表达核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C构建体。

在一个实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含具有可操作地连接至核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:30至69或100至102中的任一者的启动子，该核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列包含(i)SEQ ID NO:1至5中的任一者，(ii)与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ ID NO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:33的启动子：(i)SEQ ID NO:1至5中的任一者，(ii)与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ ID NO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:44的启动子：(i)SEQ ID NO:1至5中的任一者，(ii)与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ ID NO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:35的启动子：(i)SEQ ID NO:1至5中的任一者，(ii)与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ ID NO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一例示性实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:44的启动子：(i)SEQ ID NO:3，(ii)与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ IDNO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一例示性实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:44的启动子：(i)SEQ ID NO:4，(ii)与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ IDNO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一例示性实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:44的启动子：(i)SEQ ID NO:5，(ii)与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ IDNO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一例示性实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:35的启动子：(i)SEQ ID NO:3，(ii)与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ IDNO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一例示性实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:35的启动子：(i)SEQ ID NO:4，(ii)与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ IDNO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一例示性实施方案中，本发明的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ ID NO:35的启动子：(i)SEQ ID NO:5，(ii)与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ IDNO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在一个实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含选自由以下组成的组的启动子：细胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、CBA启动子(例如SEQ ID NO:61)的上游使用的CMV增强子、超核启动子(super core promoter，SCP)启动子、SerpE_TTR启动子(例如SEQ ID NO:63)、Proto1启动子(例如SEQ ID NO:64)、最小CMV(minCMV)启动子、伦敦大学学院杂合肝特异性启动子(University College Londonhybrid liver-specific promoter，UCL-HLP)启动子、CMV增强子(CMVe)、CMV早期增强子/CBA(CAG)启动子、Myh6启动子、肌间线蛋白启动子、心脏肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)启动子、α-肌凝蛋白重链(alpha-myosin heavy chain，α-MHC)启动子、肌凝蛋白轻链2(myosin light chain 2，MLC-2)启动子、SEQ ID NO:102及EF1a短(EF1a short，EFS)启动子，启动子可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列(i)SEQ IDNO:1至5中的任一者，(ii)与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ IDNO:12、13及21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列的蛋白。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ ID NO:12、13及21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。在一个实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含具有可操作地连接至包含以下者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列的SEQ IDNO:30至58或100至102中的任一者的启动子：(i)SEQ ID NO:1至5中的任一者，(ii)与SEQID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，或(iii)前述任一者的功能性片段。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列为编码蛋白的序列，该蛋白具有与野生型核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白序列(例如SEQ ID NO:12、13及/或21)至少90％、95％、98％、99％或100％一致的序列。在某些实施方案中，此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列可包含(i)SEQ ID NO:1至5中的任一者，或(ii)与SEQ IDNO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，其中此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C序列编码例如具有SEQ ID NO:12、13及/或21中的一或多者的全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在某些实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含已经截短以编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白的功能性片段的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列。例示性经截短核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列可包含与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，其中此类核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的功能性片段。在某些实施方案中，本文所揭示的核酸构建体包含已经截短以编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白的功能性片段的变体核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列。例示性经截短核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列可包含与SEQ ID NO:1至5中的任一者具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的序列，其中此类经截短变体核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的功能性片段。

在某些实施方案中，本文所述的核酸构建体在启动子的添加物中包含另一调节组件，例如(例如)与转录起始或终止相关的序列、增强子序列及有效RNA处理信号。例示性调节组件包括例如内含子、增强子、UTR、稳定性组件、WPRE序列、Kozak共同序列、转译后反应组件或多腺苷酸化(polyA)序列或其组合。调节组件可用以在基因表达的转录阶段、转录后阶段或转译阶段调节基因表达。在RNA水平，调节可在转译(例如使mRNA稳定以用于转译的稳定性组件)、RNA裂解、RNA剪接及/或转录终止的水平进行。在各种实施方案中，调节组件可将转录因子募集至编码区，其增加所关注的细胞类型中的基因表达选择性、增加RNA转录物的产生速率、增加所产生RNA的稳定性及/或增加自RNA转录物的蛋白合成速率。

在一个实施方案中，本文所述的核酸构建体进一步包含增强子序列。例示性增强子序列包括例如En34增强子(来自人类载脂蛋白肝控制区的34bp核增强子)、EnTTR增强子(来自甲状腺素转运蛋白的100bp增强子序列)、α1-微球蛋白/比库宁(bikunin)前体增强子、ABPS增强子(来自α1-微球蛋白/比库宁前体的100bp末梢增强子变成42bp的缩短版)或该ApoE增强子。参见例如WO 2018/126116及Wu等,Mol Therapy 16(2):280-289(2008))。在另一实施方案中，适合增强子序列为包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的内含子序列。在某些实施方案中，在本文所述的核酸构建体中增强子序列位于转殖基因及启动子的上游或启动子与转殖基因之间。

在某些实施方案中，本文所述的核酸构建体进一步包含polyA序列。适合polyA序列包括例如长度为约75bp的人工polyA(PA75)(参见例如WO 2018/126116)、牛生长激素polyA、SV40早期polyA信号、SV40晚期polyA信号、兔β血球蛋白polyA、HSV胸苷激酶polyA、鱼精蛋白基因polyA、腺病毒5EIb polyA、生长激素polyA或PBGD polyA。在某些实施方案中，在本文所述的核酸构建体中polyA序列位于转殖基因的下游。

在某些实施方案中，适合于根据本文所述的核酸分子使用的调节组件包含少于900bp、850bp、800bp、750bp、700bp、650bp、600bp、550bp、500bp、450bp、400bp、350bp、300bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、145bp、140bp、135bp、130bp、125bp、120bp、115bp、110bp、105bp、100bp、95bp、90bp、85bp、80bp或75bp，或从约80至300bp、80至275bp、80至250bp、80至200bp、80至150bp、80至125bp、80至120bp、80至115bp、80至110bp、80至105bp、80至100bp、85至300bp、85至275bp、85至250bp、85至200bp、85至150bp、85至125bp、85至120bp、85至115bp、85至110bp、85至105bp、85至100bp、90至300bp、90至275bp、90至250bp、90至200bp、90至150bp、90至125bp、90至120bp、90至115bp、90至110bp、90至105bp、90至100bp、95至300bp、95至275bp、95至250bp、95至200bp、95至150bp、95至125bp、95至120bp、95至115bp、95至110bp、95至105bp、95至100bp、100至300bp、100至275bp、100至250bp、100至200bp、100至150bp、100至125bp、100至120bp、100至115bp、100至110bp或100至105bp。在例示性实施方案中，适合于根据本文所述的核酸分子使用的调节组件包含约100至120bp、约117bp或约100bp。

在某些实施方案中，本文所述的包含核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核酸序列及调节组件的核酸构建体适合于封装于AAV载体(例如包含少于约4.7Kb)中。在某些实施方案中，本文所述的包含核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核酸序列及调节组件的核酸构建体包含约4,450至4,550bp、4,450至4,540bp、4,450至4,530bp、4,450至4,520bp、4,450至4,510bp、4,450至4,500bp、4,460至4,550bp、4,460至4,540bp、4,460至4,530bp、4,460至4,520bp、4,460至4,510bp、4,460至4,500bp、4,470至4,550bp、4,470至4,540bp、4,470至4,530bp、4,470至4,520bp、4,470至4,510bp、4,470至4,500bp、4,480至4,550bp、4,480至4,540bp、4,480至4,530bp、4,480至4,520bp、4,480至4,510bp、4,480至4,500bp、4,490至4,550bp、4,490至4,540bp、4,490至4,530bp、4,490至4,520bp、4,490至4,510bp或4,490至4,500bp，或包含约4,498bp或约4,515bp。在例示性实施方案中，此类核酸构建体编码全长核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白，例如具有SEQ ID NO:12、13及/或21中的一或多者的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C蛋白。

在另一实施方案中，适用于本文的转殖基因包括报告子序列，其在表达后产生可侦测信号。此类报告子序列包括(但不限于)编码以下者的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8)、流感血球凝集素蛋白及所属领域中熟知的其他存在或可通过常规方法产生针对其的高亲和力抗体的物质，及包含与尤其来自血球凝集素或Myc的抗原标签域适当融合的膜结合蛋白的融合蛋白。这些编码序列在与驱动其表达的调节组件相关时，提供通过常规方法可侦测的信号，常规方法包括酶促、放射性、比色、荧光或其他光谱检定，荧光活化细胞分选检定及免疫检定，包括酶联免疫吸附检定(ELISA)、放射免疫检定(RIA)及免疫组织化学。举例而言，在标记序列为LacZ基因的情况下，通过针对β-半乳糖苷酶活性的检定来侦测携带信号的载体的存在。在转殖基因为绿色荧光蛋白或荧光素酶的情况下，携带信号的载体可通过光度计中的颜色或光产生而目视测量。

D.表达载体

在某些实施方案中，可将核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核苷酸序列或本文所述的表达构建体并入表达载体中。

表达载体可用以经由转染或转导将核酸分子递送至目标细胞。载体可为整合型或非整合型载体，参考载体将表达盒或转殖基因整合至宿主细胞的基因组中的能力。表达载体的实例包括(但不限于)(a)非病毒载体，例如包括线性寡核苷酸及环形质粒的核酸载体；人工染色体，例如人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)、酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)及细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome，BAC或PAC)；游离型载体；转座子(例如PiggyBac)；及(b)病毒载体，例如反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体及腺相关病毒载体。

表达载体可为线性寡核苷酸或环形质粒且可经由各种转染方法，包括物理及化学方法递送至细胞。物理方法一般指在促进基因物质的细胞内递送中采用物理力来抵消细胞膜障壁的递送方法。物理方法的实例包括使用针、弹道DNA、电穿孔、声致穿孔、光致穿孔、磁转染及水穿孔。化学方法一般指其中化学载剂将核酸分子递送至细胞的方法且可包括无机颗粒、基于脂质的载体、基于聚合物的载体及基于肽的载体。

在一些实施方案中，使用无机颗粒将向目标细胞投予表达载体。无机颗粒可指纳米颗粒，例如经工程化得到各种尺寸、形状及/或孔隙率以自网状内皮系统逸出或保护经包覆分子免于降解的纳米颗粒。无机纳米颗粒可由金属(例如铁、金及银)、无机盐或陶瓷(例如钙、镁或硅的磷酸盐或碳酸盐)来制备。这些纳米颗粒的表面可经涂布以促进DNA结合或靶向基因递送。也可使用磁性纳米颗粒(例如超磁性铁氧化物)、富勒烯(例如可溶性碳分子)、碳纳米管(例如圆柱形富勒烯)、量子点及超分子系统。

在一些实施方案中，使用阳离子脂质(例如阳离子脂质粒)向目标细胞投予表达载体。已研究各种类型的脂质的基因递送，例如(例如)脂质纳米乳液(例如其为通过乳化剂稳定化的一种不可混溶液体于另一种中的分散液)或固体脂质纳米颗粒。

在一些实施方案中，使用基于肽的递送媒剂向目标细胞投予本文所揭示的任何表达载体。基于肽的递送媒剂可具有保护待递送的基因物质、靶向特定细胞受体、破坏核内体膜及将基因物质递送至细胞核中的优点。在一些实施方案中，使用基于聚合物的递送媒剂向目标细胞投予表达载体。基于聚合物的递送媒剂可包含天然蛋白、肽及/或多糖或合成聚合物。在一个实施方案中，基于聚合物的递送媒剂包含聚乙烯亚胺(PEI)。PEI可将DNA缩合至带正电颗粒中，该带正电颗粒结合至阴离子细胞表面残基且经由内吞作用携带至细胞中。在其他实施方案中，基于聚合物的递送媒剂可包含聚-L-赖氨酸(PLL)、聚(DL-乳酸)(PLA)、聚(DL-丙交酯-共-糖苷)(PLGA)、聚鸟氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、树枝状聚合物、聚葡萄胺糖、聚葡萄糖的合成胺基衍生物及/或阳离子丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，基于聚合物的递送媒剂可包含聚合物的混合物，例如(例如)PEG及PLL。

本文提供包含本文所揭示的任何核酸构建体及/或多核苷酸序列的病毒载体。在特定实施方案中，病毒载体包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或前述任一者的生物活性变体及/或其片段。在特定实施方案中，病毒载体包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；及/或其片段。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白C或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列。

在某些实施方案中，表达载体可为适合于基因疗法的病毒载体。病毒基因疗法载体或基因递送载体的优选特征可包括可再现且稳定地传播且纯化至高效价；介导靶向递送(例如将转殖基因特异性递送至所关注的组织或器官而无他处的广泛载体传播)；及在不诱导有害副作用的情况下介导基因递送及转殖基因表达的能力。

若干类型的病毒，例如称为腺相关病毒的非致病性小病毒已出于基因疗法的目的通过利用病毒感染路径工程化，但避免可导致复制及毒性的病毒基因的后续表达。可如下获得此类病毒载体：通过自病毒基因组删除所有或一些编码区，但使例如将载体基因组封装至病毒壳体中或将载体核酸(例如DNA)整合至宿主染色体中的功能可能需要的那些那些序列(例如末端重复序列)保留完整。

在一些情况下，病毒载体包含可操作地连接至一或多个调节组件的转殖基因，其中转殖基因编码核纤层蛋白A、核纤层蛋白C、核纤层蛋白A及核纤层蛋白C或其密码子优化变体及/或片段。在某些实施方案中，转殖基因包含编码以下者的核苷酸序列；(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在某些实施方案中，转殖基因包含编码核纤层蛋白C或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，转殖基因包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含编码野生型LMNA基因的外显子1至12(例如SEQID NO:81至93)及野生型LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码野生型LMNA基因的外显子1至12(例如SEQ ID NO:81至93)及野生型LMNA基因的内含子9及10(例如SEQ ID NO:78及79)的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码野生型LMNA基因的外显子1至12(例如SEQ ID NO:81至93)及野生型LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)的核苷酸序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:1至10中的任一者或多者的核酸序列及与前述任一者至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列为SEQ ID NO:1至10中的任一者或多者的序列或其密码子优化变体及/或片段。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少60％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ IDNO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少65％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少70％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少75％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少82％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少85％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少87％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少91％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少92％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少93％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少94％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少96％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少97％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少98％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少99％一致的核苷酸序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:1至10中的任一者或其密码子优化变体及/或片段100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQID NO:12或21的多肽序列的SEQ ID NO:1至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:12或21的多肽序列的SEQ ID NO:6至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:13的多肽序列的SEQ ID NO:2至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:13的多肽序列的SEQ ID NO:7至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:3至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:4至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:5至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ IDNO:8至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:9至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒载体包含与编码SEQ ID NO:12、13或21中的任一者或多者的多肽序列的SEQ ID NO:10至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:3至5中的任一者的核酸序列及与前述任一者至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含为SEQ ID NO:3至5中的任一者的序列或其密码子优化变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少60％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少65％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少70％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少75％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少80％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少82％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少85％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少87％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少90％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少91％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少92％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少93％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少94％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少95％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少96％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少97％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少98％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段至少99％一致的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与SEQ ID NO:3至5中的任一者或其密码子优化变体及/或片段100％一致的核苷酸序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的多肽：SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或多者的氨基酸序列，及与前述任一者至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的多肽。在某些实施方案中，病毒载体包含编码SEQ ID NO:12至21及24中的任一者的多肽或其生物活性变体及/或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少60％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少65％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少70％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少75％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少80％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少82％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少85％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少87％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少90％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少91％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少92％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少93％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少94％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少95％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少96％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少97％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少98％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段至少99％一致的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码与SEQ ID NO:12至21及24中的任一者或其生物活性变体及/或片段100％一致的多肽的核苷酸序列。

在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:12或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ IDNO:21或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：与SEQ ID NO:13或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A且编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A具有与SEQ ID NO:12或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，该核纤层蛋白C具有与SEQ ID NO:13或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A且编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白A具有与SEQ ID NO:21或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，该核纤层蛋白C具有与SEQ ID NO:13或其生物活性片段至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A的核苷酸序列，该核纤层蛋白A包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ IDNO:21的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白C的核苷酸序列，该核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的核苷酸序列，核纤层蛋白A及核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:12及/或13的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的核苷酸序列，核纤层蛋白A及核纤层蛋白C包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:21及/或13的氨基酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的核纤层蛋白A且还编码具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的核纤层蛋白C的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的核纤层蛋白A且还编码具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的核纤层蛋白C的核苷酸序列。

在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的核苷酸序列，其中该核苷酸序列不包含一或多种、两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上、十种或十种以上或十一种或十一种以上来自野生型LMNA基因的内含子。在某些实施方案中，病毒载体不包含与野生型LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体不包含与野生型LMNA基因的内含子1至8及11(例如SEQID NO:70至77及80)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体不包含与野生型LMNA基因的内含子1至9及11(例如SEQ ID NO:70至78及80)对应的核苷酸序列。

一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含一或多种、两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上、十种或十种以上或十一种或十一种以上内含子(例如SEQ ID NO:70至80中的任一者或组合)。在某些实施方案中，一或多种内含子对应于来自野生型LMNA基因的内含子，例如野生型人类LMNA基因。在其他实施方案中，一或多种内含子为合成内含子。在特定实施方案中一或多种内含子位于病毒载体中的核苷酸序列中以使得其能够以剪接依赖性方式编码核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的成熟mRNA。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生比编码核纤层蛋白A的成熟mRNA更多的编码核纤层蛋白C的成熟mRNA。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生约相同水平的编码核纤层蛋白A的成熟mRNA及编码核纤层蛋白C的成熟mRNA。在特定实施方案中，一或多种内含子位于核酸构建体中以使得前mRNA进行替代性剪接而产生比编码核纤层蛋白C的成熟mRNA更多的编码核纤层蛋白A的成熟mRNA。在某些实施方案中，病毒载体包含与野生型LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与野生型LMNA基因的内含子9及10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含与野生型LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的核苷酸序列。

在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含野生型人类LMNA基因的至少一个(但非所有)内源性内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ IDNO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子8至11(例如SEQ ID NO:77至80)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子9至10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ IDNO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子9至10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子9至10(例如SEQ ID NO:78及79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至8及11(例如SEQ ID NO:70至77及80)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的内含子，且缺少至少一个与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至7(例如SEQ ID NO:70至76)对应的内含子。在一些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与野生型人类LMNA基因的内含子10(例如SEQ ID NO:79)对应的内含子，且缺少所有与野生型人类LMNA基因的内含子1至9及11(例如SEQ ID NO:70至78及80)对应的内含子。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子8对应的内含子包含与SEQ ID NO:77至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子9对应的内含子包含与SEQ IDNO:78至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子10对应的内含子包含与SEQ ID NO:79至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，与野生型人类LMNA基因的内含子11对应的内含子包含与SEQ ID NO:80至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核苷酸序列或其片段。

在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子8。在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子9。在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子10。在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子11。在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子9及10。在一些情况下，病毒载体包含编码核纤层蛋白A(或其生物活性片段或变体)及/或核纤层蛋白C(或其生物活性片段或变体)的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含野生型LMNA基因的内含子8、9、10及11。

在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者的核酸序列，及与前述中的任一者或多者至少60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的核酸序列。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列为SEQ ID NO:77至80中的任一者的序列或其生物活性变体及/或片段。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少60％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少65％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少70％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少75％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少80％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少82％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少85％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少87％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少90％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少91％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少92％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少93％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少94％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少95％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少96％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少97％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少98％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段至少99％一致。在某些实施方案中，病毒载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:77至80中的任一者或多者或其生物活性变体及/或片段100％一致。

在某些实施方案中，本文所述的病毒载体进一步包含多腺苷酸化(polyA)序列。适合polyA序列包括例如长度为约75bp的人工polyA(PA75)(参见例如WO 2018/126116)、牛生长激素polyA、SV40早期polyA信号、SV40晚期polyA信号、兔β血球蛋白polyA、HSV胸苷激酶polyA、鱼精蛋白基因polyA、腺病毒5EIb polyA、生长激素polyA或PBGD polyA。在某些实施方案中，polyA序列包含或由SEQ ID NO:11组成。在某些实施方案中，在本文所述的核酸构建体中polyA序列位于转殖基因的下游。

E.病毒载体

在各种实施方案中，适合病毒载体包括反转录病毒(例如A型、B型、C型及D型病毒)；腺病毒；小病毒(例如腺相关病毒或AAV)；冠状病毒；负股RNA病毒，例如正黏病毒(例如流感病毒)；棒状病毒(例如狂犬病及水泡性口炎病毒)；副黏病毒(例如麻疹及仙台病毒(Sendai))；正股RNA病毒，例如小RNA病毒及α病毒；及双股DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型及2型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex virus)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)、细胞巨大病毒)及痘病毒(例如牛痘、鸟痘及金丝雀痘)。反转录病毒的实例包括禽类白血病肉瘤病毒、1型人类T-淋巴病毒(human T-lymphotrophic virus type 1，HTLV-1)、牛白血病病毒(bovine leukemia virus，BLV)、慢病毒及泡沫病毒。其他病毒包括例如诺沃克病毒(Norwalk virus)、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒及肝炎病毒。病毒载体可根据其整合至宿主基因组中的能力分为两组-整合型及非整合型。致癌反转录病毒及慢病毒可整合至宿主细胞染色体中，而腺病毒、腺相关病毒及疱疹病毒主要以染色体外游离基因体形式保持于细胞核中。

在某些实施方案中，适合病毒载体为反转录病毒载体。反转录病毒指反转录病毒科的病毒。反转录病毒的实例包括致癌反转录病毒，例如鼠类白血病病毒(murineleukemia virus，MLV)；及慢病毒，例如人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiencyvirus 1，HIV-1)。反转录病毒基因组为单股(ss)RNA且包含可以顺式或反式提供的各种基因。举例而言，反转录病毒基因组可含有顺式作用序列，例如两个长末端重复序列(longterminal repeat，LTR)，具有用于基因表达、反转录及整合至宿主染色体中的组件。其他组分包括用于将特定RNA封装至新形成的病毒粒子中的封装信号(psi或ψ)，及作为反转录期间起始正股DNA合成位点的多嘌呤管道(polypurine tract，PPT)。另外，反转录病毒基因组可包含gag、pol及env基因。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码伴随ssRNA且进行将病毒RNA反转录为DNA的酶，且env基因编码病毒包膜。一般而言，gag、pol及env以反式提供用于病毒复制及封装。

在某些实施方案中，本文所提供的反转录病毒载体可为慢病毒载体。识别慢病毒的至少五个血清组或血清型。不同血清型的病毒可不同地感染某些细胞类型及/或宿主。举例而言，慢病毒包括灵长类反转录病毒及非灵长类反转录病毒。灵长类反转录病毒包括HIV及猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)。非灵长类反转录病毒包括猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，FIV)、牛免疫缺陷病毒(bovineimmunodeficiency virus，BIV)、山羊关节炎-脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV)、马感染性贫血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)及维思纳病毒(visnavirus)。慢病毒或慢病毒载体可能能够转导静止细胞。如同致癌反转录病毒载体，慢病毒载体的设计可基于顺式作用及反式作用序列的分离。

在某些实施方案中，本发明提供已经设计用于通过优化治疗性反转录病毒载体递送的表达载体。反转录病毒载体可为包含左侧(5')LTR的慢病毒；有助于病毒的封装及/或核导入的序列；可操作地连接至编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列的调节组件(例如(例如)细胞类型选择性(例如心肌细胞)启动子及/或增强子)；视情况选用的一或多种另外的调节组件(例如(例如)polyA序列)；视情况选用的慢病毒反向反应组件(reverseresponse element，RRE)；视情况选用的绝缘子；及右侧(3')反转录病毒LTR。

在例示性实施方案中，本文所提供的病毒载体为腺相关病毒(AAV)。AAV为感染人类及一些其他灵长类物种的小型、复制缺乏型、无包膜动物病毒。尚未知晓AAV引起人类疾病及诱导轻度免疫反应。AAV载体也可在不整合至宿主细胞基因组中的情况下感染分裂及静止细胞两者。

AAV基因组由长度为约4.7kb的直链单股DNA组成。基因组由通过长度为约145bp的反向末端重复(ITR)序列侧接的两个开放阅读框架(open reading frame，ORF)组成。ITR由5'端处的核苷酸序列(5'ITR)及含有回文序列的位于3'端处的核苷酸序列(3'ITR)组成。ITR通过在为了第二股合成的DNA复制的起始期间充当引物的互补碱基配对折叠形成T形发夹结构而以顺式起作用。两个开放阅读框架编码参与病毒粒子的复制及封装的rep及cap基因。在一例示性实施方案中，本文所提供的AAV载体不含rep或cap基因。此类基因可以反式提供用于产生病毒粒子，如下文进一步描述。

在某些实施方案中，AAV载体可包括填充核酸。在一些实施方案中，填充核酸可编码绿色荧光蛋白或抗生素抗性基因，例如卡那霉素(kanamycin)或氨苄青霉素(ampicillin)。在某些实施方案中，填充核酸可位于ITR序列外部(例如相比于核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C转殖基因序列及调节序列，其位于5'与3'ITR序列之间)。

存在各种血清型的AAV，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及AAV13。这些血清型不同之处在于其趋向性或其所感染的细胞的类型。AAV可包含来自多种血清型(例如假型)的基因组及壳体。举例而言，AAV可包含在来自血清型5或血清型9的壳体中封装的血清型2的基因组(例如ITR)。假型可提高转导效率以及改变趋向性。

在某些实施方案中，本文所述的病毒载体包含最小量的AAV反向末端重复序列(ITR)及转殖基因，该转殖基因编码(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在某些实施方案中，本文所述的病毒载体包含由最小量的AAV反向末端重复序列(ITR)及转殖基因组成的微小基因，该转殖基因编码(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；或其生物活性变体及/或片段。在一个特定实施方案中，使用AAV血清型6或AAV血清型9的ITR。然而，可选择来自其他适合血清型的ITR。将病毒载体封装至壳体蛋白中且递送至所选宿主细胞。本发明的AAV载体可由多种腺相关病毒产生。可通过将一种血清型的重组基因组封装至衍生自另一AAV血清型的壳体中来改变载体的趋向性。在一些实施方案中，rAAV病毒的ITR可基于AAV1-12中的任一者的ITR且可与选自以下者中的任一者的AAV壳体组合：AAV1-12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9或其他经修饰血清型。

在一些实施方案中，AAV载体或AAV病毒颗粒或病毒粒子可用以递送包含可操作地连接至编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列的构建体至细胞、细胞类型或组织中，且可活体内、离体或活体外进行。在例示性实施方案中，此类AAV载体为复制缺陷型。在一些实施方案中，AAV病毒经工程化或经基因修饰以使得其可仅在辅助因子存在下复制及产生病毒粒子。

在某些实施方案中，病毒载体可经选择以在无针对特定细胞类型的选择性的情况下产生具有高感染性的病毒粒子，同时尽管可用病毒感染其他肌肉细胞，心肌细胞选择性调节组件赋予转殖基因在心肌细胞中而不在其他肌肉细胞中的选择性表达。在某些实施方案中，病毒载体可经设计以产生病毒粒子，该病毒粒子感染许多不同细胞类型但在所关注的细胞类型(例如心肌细胞)中转殖基因的表达增强及/或优化且在其他非目标细胞类型(例如非心肌细胞)中转殖基因的表达减少及/或降至最低。转殖基因在不同细胞类型中的差异性表达可使用针对一或多种细胞类型为选择性的不同调节组件来控制、工程化或操控。在一些情况下，一或多种可操作地连接至转殖基因的调节组件增强转殖基因在目标细胞、细胞类型或组织中的选择性表达，同时一或多种调节组件遏制非目标细胞、细胞类型或组织中的转殖基因表达，或赋予在一或多种非目标细胞、细胞类型或组织中的显著降低、最小或统计学上降低的基因表达。对于基因疗法，可能需要转殖基因在目标细胞类型(例如心肌细胞)中的选择性表达及/或转殖基因在非目标细胞类型中的最小表达。转殖基因在非预期细胞类型(例如非目标细胞类型)中的表达可引起对受试者的不良影响。转殖基因在非预期细胞类型中的表达可抵消转殖基因在预期细胞类型中的疗效。

在例示性实施方案中，本发明提供已经设计以用于通过AAV递送的表达载体。AAV可为任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ，或嵌合、杂合或变体型AAV。AAV也可为自补AAV(scAAV)。在某些实施方案中，经设计用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR及3'ITR。在某些实施方案中，经设计用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、启动子、包含可操作地连接至编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的调节组件(例如(例如)细胞类型选择性(例如心肌细胞)启动子及/或增强子)的构建体及3'ITR。在某些实施方案中，经设计用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、增强子、启动子、包含可操作地连接至编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的调节组件(例如(例如)细胞类型选择性(例如心肌细胞)启动子及/或增强子)的构建体、polyA序列及3'ITR。在某些实施方案中，经设计用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、包含SEQ IDNO:30至69或100至102中的任一者或其变体或功能性片段的调节组件、编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列及3'ITR。在一个实施方案中，经设计以用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、包含SEQ ID NO:31、33、60或61中的任一者或多者或其变体或功能性片段的启动子、编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列及3'ITR。在另一实施方案中，经设计以用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、包含SEQ ID NO:31或其变体或功能性片段的调节组件、编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列及3'ITR。在另一实施方案中，经设计以用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、包含SEQ ID NO:33或其变体或功能性片段的调节组件、编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列及3'ITR。在另一实施方案中，经设计以用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、包含SEQ ID NO:60或其变体或功能性片段的调节组件、编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列及3'ITR。在另一实施方案中，经设计以用于通过AAV递送的表达载体包含5'ITR、包含SEQ ID NO:61或其变体或功能性片段的调节组件、编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列及3'ITR。例示性AAV表达载体说明于图1至5及11A至C中。

F.病毒颗粒

在某些实施方案中，本发明提供包含病毒载体的病毒颗粒，该病毒载体包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在某些实施方案中，本发明提供包含病毒载体的病毒颗粒，该病毒载体包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；或其生物活性变体及/或片段。术语「病毒颗粒(viralparticle)」及「病毒粒子(virion)」在本文可互换使用且是关于感染性且典型地复制缺陷性的病毒颗粒，其包含封装于壳体内的病毒基因组(例如病毒表达载体)，且视具体情况，例如对于反转录病毒，包含在壳体周围的脂质包膜。「壳体」指封装病毒基因组的结构。壳体由若干由蛋白制成的寡聚结构子单元组成。举例而言，AAV具有通过以下三种壳体蛋白的相互作用所形成的二十面体壳体：VP1、VP2及VP3。在一个实施方案中，本文所提供的病毒粒子为通过将包含调节组件(包括例如细胞类型(例如心肌细胞)选择性调节组件)的AAV载体封装于蛋白壳层中而获得的重组AAV病毒粒子或rAAV病毒粒子，该调节组件可操作地连接至编码如本文所述的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列。

在某些实施方案中，本文所提供的重组AAV病毒粒子可通过壳体化衍生自病毒粒子中的特定AAV血清型的AAV基因组制备，该特定AAV血清型由与相同特定血清型的AAV对应的天然Cap蛋白质形成。在其他实施方案中，本文所提供的AAV病毒颗粒包含病毒载体，该病毒载体包含封装至来自不同血清型的蛋白中的给定AAV血清型的ITR。参见例如Bunning H等JGene Med 2008；10:717-733。举例而言，具有来自给定AAV血清型的ITR的病毒载体可封装至以下各者中：a)由衍生自相同或不同AAV血清型的壳体蛋白(例如AAV2 ITR及AAV9壳体蛋白；AAV2 ITR及AAV8壳体蛋白；等)构成的病毒颗粒；b)由来自不同AAV血清型的壳体蛋白或突变体的混合物(例如AAV2 ITR与AAV1及AAV9壳体蛋白)构成的嵌合体病毒颗粒；c)由已通过不同AAV血清型或变体之间的域交换截短的壳体蛋白构成的嵌合病毒颗粒(例如具有含AAV9域的AAV8壳体蛋白的AAV2 ITR)；或d)靶向病毒颗粒，其经工程化以显示选择性结合域，使得能够与目标细胞特异性受体进行严格相互作用(例如具有通过插入肽配体而基因截短的AAV9壳体蛋白的AAV5 ITR；或通过将肽配体偶合至壳体表面而非基因修饰的AAV9壳体蛋白)。

本领域技术人员应了解，本文所提供的AAV病毒粒子可包含任何AAV血清型的壳体蛋白。在一个实施方案中，病毒颗粒包含来自选自由AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8及AAV9组成的组的AAV血清型的壳体蛋白，其更适合于递送至心肌(M.Hocquemiller等,Hum GeneTher 27(7):478-496(2016))。在一些实施方案中，病毒载体包含来自AAV6血清型的壳体蛋白。在一些实施方案中，病毒载体包含来自AAV9血清型的壳体蛋白。

本领域中已知多种用于产生rAAV病毒粒子的方法，包括转染、稳定细胞系产生及感染性杂合病毒产生系统，其包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体(Conway,J E等,(1997)J.Virology 71(11):8780-8789)及杆状病毒-AAV杂合体。用于制造rAAV病毒颗粒的rAAV产生培养物均需要：1)在杆状病毒生产系统情况下，适合宿主细胞，包括例如人类衍生的细胞系，例如HeLa、A549或293细胞，或昆虫衍生的细胞系，例如SF-9；2)通过野生型或突变体腺病毒(例如温度敏感腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒提供的适合辅助病毒功能，或提供辅助功能的质粒构建体；3)AAVrep及cap基因及基因产物；4)通过AAV ITR序列侧接的转殖基因(例如编码如本文所述的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)；及5)适合培养基及培养基组件以支持rAAV产生。

在各种实施方案中，本文所述的宿主细胞包含以下三种组件：(1)rep基因及cap基因，(2)提供辅助功能的基因，及(3)转殖基因(例如通过ITR侧接的编码本文所述的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)。AAV rep基因、AAV cap基因及提供辅助功能的基因可通过将该等基因并入至例如(例如)质粒的载体中，及将该载体引入宿主细胞中而引入细胞中。rep、cap及辅助功能基因可并入相同质粒或不同质粒中。在优选实施方案中，AAV rep及cap基因并入一种质粒中且提供辅助功能的基因并入另一质粒中。形成用于病毒粒子产生的宿主细胞的各种质粒(例如包含AAV rep及cap基因、辅助功能或转殖基因)可通过使用所属领域中熟知的任何适合方法引入细胞中。转染方法的实例包括(但不限于)与磷酸钙、DEAE-右旋糖苷、凝聚胺共沉淀；电穿孔；显微注射；脂质体介导融合；脂质体转染；反转录病毒感染；及基因枪转染。在某些实施方案中，可将提供rep及cap基因、辅助功能及转殖基因的质粒(例如通过ITR侧接的编码本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)同时引入细胞中。在另一实施方案中，提供rep及cap基因及辅助功能的质粒可在引入包含转殖基因的质粒之前或之后引入细胞中。在一例示性实施方案中用以下三种质粒同时转染细胞(例如三重转染方法)：(1)包含转殖基因的质粒(例如通过ITR侧接的编码本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)，(2)包含AAV rep及cap基因的质粒，及(3)包含提供辅助功能的基因的质粒。例示性宿主细胞可为293、A549或HeLa细胞。

在其他实施方案中，(1)AAV rep及cap基因、(2)提供辅助功能的基因及(3)转殖基因中的一或多者可通过封装细胞运载，为游离地及/或整合至包装细胞的基因组中。在一个实施方案中，宿主细胞可为封装细胞，其中AAV rep及cap基因及辅助功能稳定维持于宿主细胞中且宿主细胞经含有转殖基因的质粒(例如通过ITR侧接的编码本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)短暂转染。在另一实施方案中，宿主细胞为封装细胞，其中AAV rep及cap基因稳定维持于宿主细胞中且宿主细胞经含有转殖基因的质粒(例如通过ITR侧接的编码本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)及含有辅助功能的质粒短暂转染。在另一实施方案中，宿主细胞可为封装细胞，其中辅助功能稳定维持于宿主细胞中且宿主细胞经含有转殖基因的质粒(例如通过ITR侧接的编码本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)及含有rep及cap基因的质粒短暂转染。在另一实施方案中，宿主细胞可为经rep及cap基因、辅助功能及转殖基因序列(例如通过ITR侧接的编码本文所揭示的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)稳定转染的生产细胞系。例示性封装及生产细胞可衍生自293、A549或HeLa细胞。

在另一实施方案中，生产细胞系为经提供Rep及Cap蛋白的杆状病毒表达载体感染的昆虫细胞系(典型地为Sf9细胞)。此系统不需要腺病毒辅助基因(Ayuso E等,Curr.GeneTher.2010,10:423-436)。

如本文所用，术语「cap蛋白」指具有天然AAV Cap蛋白(例如VP1、VP2、VP3)的至少一种功能活性的多肽。cap蛋白的功能活性的实例包括诱导壳体形成、促进单股DNA积聚、促进AAV DNA封装至壳体中(即，壳体化)、结合至细胞受体及促进病毒粒子进入宿主细胞中的能力。原则上，任何Cap蛋白可用于本发明的情形中。

已报导Cap蛋白对宿主趋向性、细胞、组织或器官特异性、受体使用、感染效率及AAV病毒的免疫原性具有影响。因此，用于rAAV的AAV cap可考虑例如受试者的物种(例如人类或非人类)、受试者的免疫状态、受试者对于长期或短期治疗的适合性或特定治疗应用(例如特定疾病或病症的治疗或递送至特定细胞、组织或器官)来选择。在某些实施方案中，cap蛋白衍生自由AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8及AAV9血清型组成的组的AAV。在一些实施方案中，cap蛋白衍生自AAV6。在一些实施方案中，cap蛋白衍生自AAV9。

在一些实施方案中，用于本发明方法的AAV Cap可由前述AAV cap中的一者或其编码核酸的突变诱发(即通过插入、缺失或取代)产生。在一些实施方案中，AAV cap与前述AAVcap中的一或多者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更大相似性。

在一些实施方案中，AAV cap为嵌合的，包含来自两个、三个、四个或更多个前述AAV cap的域。在一些实施方案中，AAV cap为源自两种或三种不同AAV或重组AAV的VP1、VP2及VP3单体的嵌合体。在一些实施方案中，rAAV组合物包含前述cap中的多于一者。

在一些实施方案中，用于rAAV病毒粒子的AAV cap经工程化以含有异源序列或其他修饰。举例而言，赋予选择性靶向或免疫逃避的肽或蛋白序列可工程化为cap蛋白。可替代地或另外，cap可经化学修饰以使得rAAV的表面聚乙烯羟乙酸化(即聚乙二醇化)，其可促进免疫逃避。cap蛋白也可经突变诱发(例如以移除其天然受体结合，或掩蔽免疫性抗原决定基)。

如本文所用，术语「rep蛋白」指具有天然AAV rep蛋白(例如rep40、52、68、78)的至少一种功能活性的多肽。rep蛋白的功能活性的实例包括与蛋白的生理功能相关的任何活性，包括经由识别促进DNA复制、DNA复制的AAV来源的结合及切口以及DNA解螺旋酶活性。另外的功能包括调节自AAV(或其他异源)启动子的转录及将AAV DNA位点特异性整合至宿主染色体中。在一特定实施方案中，AAV rep基因可来自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAVrh10。在一些实施方案中，AAV rep基因来自AAV6。在一些实施方案中，AAV rep基因来自AAV9。

在一些实施方案中，用于本发明方法的AAV rep蛋白可由前述AAV rep中的一者或其编码核酸的突变诱发(即通过插入、缺失或取代)产生。在一些实施方案中，AAV rep与前述AAV rep中的一或多者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更大相似性。

如本文所用，表述「辅助功能」或「辅助基因」指AAV进行复制所依赖的病毒蛋白。辅助功能包括AAV复制所需的那些蛋白，包括(但不限于)参与AAV基因转录活化、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成及AAV壳体组装的那些蛋白。基于病毒的附件功能可衍生自任何已知辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒以外)及牛痘病毒。辅助功能包括(但不限于)腺病毒E1、E2a、VA及E4或疱疹病毒UL5、ULB、UL52及UL29，及疱疹病毒聚合酶。在一优选实施方案中，AAV进行复制所依赖的蛋白衍生自腺病毒。

在一些实施方案中，用于本发明方法的AAV进行复制所依赖的病毒蛋白可通过前述病毒蛋白中的一者或其编码核酸的突变诱发(即通过插入、缺失或取代)产生。在一些实施方案中，病毒蛋白与前述病毒蛋白中的一或多者具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更大相似性。

检定AAV进行复制所依赖的cap蛋白、rep蛋白及病毒蛋白的功能的方法为所属领域中众所熟知的。

G.宿主细胞

在另一方面中，本发明关于包含病毒载体或病毒颗粒的宿主细胞，该病毒载体或病毒颗粒包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在另一实施方案中，本发明关于包含病毒载体或病毒颗粒的宿主细胞，该病毒载体或病毒颗粒包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；或其生物活性变体及/或片段。宿主细胞可为细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一例示性实施方案中，宿主细胞指任何易受所关注的病毒感染，且能够在活体外培养的细胞系。

在某些实施方案中，本文所提供的宿主细胞可用于离体基因疗法目的。在此类实施方案中，细胞经包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列的核酸分子或表达载体转染且随后移植至患者或受试者中。移植细胞可具有自体、同种异体或异源来源。对于临床使用，细胞分离将一般在良好作业规范(Good Manufacturing Practices，GMP)条件下进行。在移植之前，典型地检查细胞质量及微生物或其他污染物的不存在且可进行预处理，例如通过放射及/或免疫抑制治疗。此外，宿主细胞可连同生长因子一起移植以刺激细胞增殖及/或分化。

在某些实施方案中，宿主细胞可用于离体基因疗法至心脏或所关注的其他组织中。优选地，该细胞为真核细胞，例如哺乳动物细胞，这些细胞包括(但不限于)人类、非人类灵长类动物，例如猿；黑猩猩；猴及红毛猩猩，家养动物，包括狗及猫，以及家畜，例如马、牛、猪、绵羊及山羊，或其他哺乳动物物种，包括(但不限于)小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、仓鼠及类似者。本领域技术人员将根据待移植的患者或受试者选择更适当细胞。

在某些实施方案中，本文所提供的宿主细胞可为具有自体更新及多能性特性的细胞，例如干细胞或经诱导的多能干细胞。干细胞优选为间质干细胞。间质干细胞(MSC)能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞中的至少一者，且可自任何类型的组织分离。一般而言，MSC将自骨髓、脂肪组织、脐带或外周血分离。获得其的方法已为本领域技术人员所熟知。经诱导的多能干细胞(也称为iPS细胞或iPSC)为可直接自成人细胞产生的一种类型的多能干细胞。Yamanaka等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc基因转移至小鼠及人类纤维母细胞中，且迫使细胞表达基因而诱导iPS细胞(WO 2007/069666)。Thomson等随后使用Nanog及Lin28替代Klf4及c-Myc来产生人类iPS细胞(WO 2008/118820)。

在一例示性实施方案中，本文所提供的宿主细胞为封装细胞。该细胞可为黏附或悬浮细胞。封装细胞及辅助载体或病毒或DNA构建体共同地以反式提供病毒载体的完全复制及封装所需的所有缺失功能。

优选地，该封装细胞为真核细胞，例如哺乳动物细胞，包括猿猴、人类、狗及啮齿动物细胞。人类细胞的实例为PER.C6细胞(WO01/38362)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCCCCL-75)、HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)、HeLa细胞(ATCC CCL2)及胚胎恒河猴肺细胞(ATCCCL-160)。非人类灵长类细胞的实例为Vero细胞(ATCC CCL81)、COS-1细胞(ATCC CRL-1650)或COS-7细胞(ATCC CRL-1651)。狗细胞的实例为MDCK细胞(ATCC CCL-34)。啮齿动物细胞的实例为仓鼠细胞，例如BHK21-F、HKCC细胞或CHO细胞。

作为哺乳动物来源的替代物，用于本发明的细胞系可衍生自禽类来源，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡。禽类细胞系的实例包括禽类胚胎干细胞(WO01/85938及WO03/076601)、永生化鸭视网膜细胞(WO2005/042728)，及禽类胚胎干细胞衍生的细胞，包括鸡细胞(WO2006/108846)或鸭细胞，例如EB66细胞系(WO2008/129058及WO2008/142124)。

在另一实施方案中，该宿主细胞为昆虫细胞，例如SF9细胞(ATCC CRL-1711)、Sf21细胞(IPLB-Sf21)、MG1细胞(BTI-TN-MG1)或High FiveTM细胞(BTI-TN-5B1-4)。

在某些实施方案中，本文所提供的宿主细胞包含病毒载体或病毒颗粒，该病毒载体或病毒颗粒包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段，可进一步包含一或多种另外的核酸构建体，例如(例如)(i)编码rep及cap基因但并不携带ITR序列的核酸构建体(例如AAV辅助质粒)；及/或(ii)提供AAV复制必需的腺病毒功能的核酸构建体(例如质粒)。在一例示性实施方案中，本文所提供的宿主细胞包含：i)本文所揭示的任何核酸构建体或病毒载体，例如本文所揭示的包含编码以下者的核苷酸序列的任何核酸构建体或载体：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段；ii)编码AAVrep及cap基因而不携带ITR序列的核酸构建体；及iii)包含腺病毒辅助基因的核酸构建体(如下文进一步描述)。

在某些实施方案中，rep、cap及腺病毒辅助基因可在单一质粒上组合(Blouin V等J Gene Med.2004；6(增刊):S223-S228；Grimm D.等Hum.Gene Ther.2003；7:839-850)。因此，在另一例示性实施方案中，本文所提供的宿主细胞包含：i)包含编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列(，即重组AAV基因组)的核酸分子或表达载体；及ii)编码AAV rep及cap基因而不携带ITR序列且进一步包含腺病毒辅助基因的质粒。

在另一实施方案中，本文所提供的宿主细胞包含：i)本文所揭示的任何核酸构建体或病毒载体，例如本文所揭示的包含编码以下者的核苷酸序列的任何核酸构建体或载体：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段；b)编码AAVrep及cap基因而不携带ITR序列的质粒；及c)包含腺病毒辅助基因E2a、E4及VA RNA的质粒；其中共-转染在组成性表达且反补腺病毒E1基因的细胞(优选为哺乳动物细胞)中执行，如HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)。

在某些实施方案中，适合于大规模产生AAV载体的宿主细胞为可经重组杆状病毒的组合感染的昆虫细胞(Urabe等Hum.Gene Ther.2002；13:1935-1943)。举例而言，SF9细胞可经分别表达待封装的AAV rep、AAV cap及AAV载体的三种杆状病毒载体共感染。重组杆状病毒载体将提供病毒复制及/或封装所需的病毒辅助基因功能。

构建及产生用于根据本发明的基因疗法的病毒粒子的进一步指导可见于：ViralVectors for Gene Therapy,Methods and Protocols.Series:Methods in MolecularBiology,第737卷.Merten及Al-Rubeai(编)；2011Humana Press(Springer)；GeneTherapy.M.Giacca.2010Springer-Verlag；Heilbronn R.及Weger S.Viral Vectors forGene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics.In:Drug Delivery,Handbookof Experimental Pharmacology 197；M.Schafer-Korting(编).2010Springer-Verlag；第143-170页；Adeno-Associated Virus:Methods and Protocols.R.O.Snyder及P.Moulllier(编).2011Humana Press(Springer)；Bunning H.等Recent developments inadeno-associated virus technology.J.Gene Med.2008；10:717-733；及Adenovirus:Methods and Protocols.M.Chillon及A.Bosch(编)；第三版.2014Humana Press(Springer)中。

用于表达所关注的转殖基因(例如编码核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C的序列)的宿主细胞可在适于AAV病毒粒子的组装的条件下生长。在某些实施方案中，宿主细胞生长适合的时段以促进AAV病毒粒子的组装及病毒粒子释放至培养基中。一般而言，细胞可生长约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或至多约10天。在约10天(或更早，取决于培养条件及所使用的特定宿主细胞)之后，产生水平一般显著降低。一般而言，培养时间自病毒产生的时间点开始测量。举例而言，在AAV的情况下，病毒产生一般在如本文所述的适当宿主细胞中提供辅助病毒功能后开始。一般而言，在辅助病毒感染之后(或在病毒产生开始之后)约48至约100、优选约48至约96、优选约72至约96、优选约68至约72小时收集细胞。

rAAV产生培养物可在适合于所用特定宿主细胞的多种条件(在宽温度范围内、持续不同时间长度及类似者)下生长。rAAV产生培养物包括连接依赖性培养物，其可在适合的连接依赖性容器，例如(例如)滚瓶、中空纤维过滤器、微载体及填充床或流体化床生物反应器中培养。rAAV载体产生培养物也可包括悬浮适应宿主细胞，例如HeLa、293及SF-9细胞，其可以多种方法培养，包括例如旋转烧瓶、搅拌槽生物反应器及抛弃式系统，例如Wave袋系统。

本领域中已知的适合培养基可用于产生rAAV病毒粒子。这些培养基包括(但不限于)由Hyclone Laboratories及JRH生产的培养基，包括改良伊格尔培养基(ModifiedEagle Medium，MEM)、杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium，DMEM)，其各自以全文引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，rAAV产生培养基可补充有0.5％至20％(v/v或w/v)的含量的血清或血清衍生的重组蛋白。或者，rAAV载体可产生于无血清条件下，其也可称为无动物衍生的产物的培养基。

在培养宿主细胞以允许AAV病毒粒子产生之后，随后可采集及纯化所得病毒粒子。在某些实施方案中，AAV病毒粒子可(1)通过裂解宿主细胞获自生产培养物的宿主细胞，及/或(2)在转染后一段时间，优选72小时之后获自该细胞的培养基。rAAV病毒粒子可自来自生产培养物的消耗培养基收集，其限制条件为细胞在引起rAAV病毒粒子自完整细胞释放至培养基中的条件下培养(参见例如美国专利第6,566,118号)。裂解细胞的适合方法也为本领域中已知且包括例如多个冷冻/解冻循环、音波处理、微流体化及用化学物质，例如洗涤剂及/或蛋白酶处理。

在收集之后，rAAV病毒粒子可经纯化。如本文所用，术语「纯化」包括制备不含也可存在于rAAV病毒粒子天然存在或最初制备处的至少一些其他组分的rAAV病毒粒子。因此，举例而言，纯化rAAV病毒粒子可使用分离技术将其自源混合物，例如培养裂解物或生产培养物上清液富集来制备。富集可以多种方法测量，例如(例如)通过存在于溶液中的抗DNA酶粒子(DNase-resistant particle，DRP)或基因组复本(genome copy，gc)的比例，或通过感染力，或其可相对于存在于源混合物(例如污染物，包括生产培养物污染物或过程内污染物，包括辅助病毒、培养基组分及类似者)中的第二潜在干扰物质来测量。

在某些实施方案中，rAAV生产培养物收集物可经澄清以移除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，生产培养物收集物可使用多种标准技术澄清，例如离心或经由0.2μm或更大孔径的过滤器(例如乙酸纤维素过滤器或一系列深度过滤器)过滤。

在某些实施方案中，rAAV生产培养物收集物进一步用Benzonase

在某些实施方案中，rAAV病毒粒子可使用以下纯化步骤中的一或多者来分离或纯化：平衡离心；流通式阴离子交换过滤；用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(tangential flowfiltration，TFF)；通过磷灰石层析的rAAV捕获；辅助病毒的热不活化；通过疏水相互作用层析的rAAV捕获；通过尺寸排阻层析法(size exclusion chromatography，SEC)的缓冲剂交换；纳米过滤；及通过阴离子交换层析、阳离子交换层析或亲和性层析的rAAV捕获。这些步骤可单独、以各种组合或以不同次序使用。纯化rAAV颗粒的方法见于例如Xiao等,(1998)Journal of Virology 72:2224-2232；美国专利第6,989,264号及第8,137,948号；及WO2010/148143中。

在某些实施方案中，经纯化AAV病毒粒子可相对于PBS渗析、过滤且储存于-80℃下。病毒基因组的效价可通过使用线性化质粒DNA作为标准曲线的定量PCR测定(参见例如Lock M等,Hum.Gene Ther.2010；21:1273-1285)。

H.医药组合物

在某些实施方案中，本发明提供包含本文所揭示的任何核酸构建体、表达载体、病毒载体、病毒颗粒或宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含病毒载体或病毒颗粒及医药学上可接受的载剂的组合物，该病毒载体或病毒颗粒包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在一些实施方案中，本发明提供包含病毒载体或病毒颗粒及医药学上可接受的载剂的组合物，该病毒载体或病毒颗粒包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽的生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；(c)核纤层蛋白A的生物活性片段及核纤层蛋白C多肽的生物活性片段；或其生物活性变体及/或片段。在其他实施方案中，本发明提供包含病毒载体或病毒颗粒及医药学上可接受的载剂的宿主细胞，该病毒载体或病毒颗粒包含编码以下者的核苷酸序列：(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在特定实施方案中，此类组合物适合于基因疗法应用。医药组合物优选在制造及储存条件下为无菌且稳定的。无菌溶液可例如通过经由无菌过滤膜过滤来实现。

医药组合物中的可接受载剂及赋形剂优选在所用剂量及浓度下对接受者无毒。可接受载剂及赋形剂可包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES及TAE；抗氧化剂，例如抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂，例如氯化六羟季铵、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、间苯二酚及苯扎氯铵；蛋白，例如人血清白蛋白、明胶、聚葡萄糖及免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸及赖氨酸；及碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖及山梨醇。本发明的医药组合物可以可注射调配物形式非经肠投予。注射用医药组合物可使用无菌溶液或任何医药学上可接受的液体作为媒剂来调配。医药学上可接受的媒剂包括(但不限于)无菌水及生理盐水。

本发明的医药组合物可在微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中制备。本发明的医药组合物也可在其他药物递送系统，例如脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊中制备。用于基因疗法的医药组合物可在可接受的稀释剂中，或可包含缓慢释放基质，其中嵌入有基因递送媒剂。

本文所提供的医药组合物可经调配用于非经肠投予、皮下投予、静脉内投予、全身性投予、肌肉内投予、动脉内投予、器官实质内投予、鞘内投予、小脑延髓池内投予、脑室内投予或腹膜内投予。在一个实施方案中，医药组合物经调配以用于静脉内投予。在一个实施方案中，医药组合物经调配以用于全身性投予。医药组合物也可经调配用于，或经由经鼻、喷雾、经口、气溶胶、经直肠或经阴道投予来投予。在一个实施方案中，将本文所提供的医药组合物向肌肉投予，即通过肌肉内注射投予。组织目标可为特异性的，例如心脏，或其可为若干组织，例如心脏及肝脏组织的组合。例示性组织或其他目标可包括肝脏、骨胳肌、心肌、脂肪沉积物、肾、肺、血管内皮、上皮、造血细胞、CNS及/或CSF。在一特定实施方案中，将本文所提供的医药组合物向心脏投予，即通过心内注射、静脉内注射或全身性投予。这些方法中的一或多者可用于投予本发明的医药组合物。

在某些实施方案中，本文所提供的医药组合物包含「有效量」或「治疗有效量」。如本文所用，这些量指在达成所需治疗性结果(例如增加LMNA表达水平及/或增加心室输出)所必需的剂量及时间段下的有效量。

本发明的医药组合物的剂量取决于包括投予途径、待治疗的疾病及受试者的身体特征(例如年龄、体重、一般健康)的因素。可调节剂量以提供最佳治疗反应。通常，剂量可为在不诱导显著毒性的情况下有效治疗疾病的量。在一个实施方案中，可以在5×10

本发明的医药组合物可例如每天、每周、每月、每半年、每年或按医学需要向有需要的受试者投予一或多次(例如1至10次或更多次)。在一例示性实施方案中，单次投予为足够的。在一个实施方案中，医药组合物适合于用于人类受试者且通过肌肉内注射投予。在一个实施方案中，医药组合物适合于用于人类受试者且通过心内注射、静脉内注射或全身性投予来投予。在一个实施方案中，医药组合物是通过快速注射经由外周静脉递送。在其他实施方案中，医药组合物是通过经约10分钟(±5分钟)、经约20分钟(±5分钟)、经约30分钟(±5分钟)、经约60分钟(±5分钟)或经约90分钟(±10分钟)的输注而经由外周静脉递送。

在另一方面中，本发明进一步提供包含在一或多种容器中的如本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物。试剂盒可包括描述如何向患者投予试剂盒内所含的核酸分子、载体、宿主细胞或病毒粒子的说明书或封装材料。试剂盒的容器可为任何适合的材料，例如玻璃、塑料、金属等，且具有任何适合的尺寸、形状或组态。在某些实施方案中，试剂盒可包括一或多种含有呈适合液体或溶液形式的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物的安瓿或注射器。

I.治疗方法

位于内核膜下层的核纤层为主要由A及B型核纤层蛋白构成的V型中间体长丝蛋白的网状结构。哺乳动物体细胞表达四种主要及三种次要类型的核纤层蛋白。LMNA基因编码A型核纤层蛋白，包括两种主要同种型A及C及两种次要同种型AΔ10及C2。B型核纤层蛋白主要同种型B1及B2分别由LMNB1及LMNB2编码。LMNB2进一步编码次要同种型B3。除提供机械强度至核以外，核-纤层相关人类疾病中的最新发现已确定核纤层蛋白有助于至少三个路径：(a)通过促进基因的亚核定位及表观遗传调节的基因表达及分化；(b)DNA损伤修复及基因组稳定性；及(c)控制各种分化路径的转录因子及信号传导组件的调节。

一些15种不同疾病/异常(称作核纤层蛋白病或核包膜病)与核纤层蛋白及核纤层蛋白-结合蛋白内的突变有关。已报告LMNA内的多于500种突变，其引起核纤层蛋白多肽的异常折叠、不稳定性及错误组装，或其可影响蛋白域表面的生物化学特性，产生受干扰的核纤层蛋白A/C相互作用。这些突变引起以下四个主要疾病类型中的多种疾病表型：条纹肌肉疾病、脂质营养不良症候群、周边神经病变及加快老化病症。这些疾病表型在心脏及骨胳肌病、脂质营养不良、外周神经病变至过早老化与早期死亡范围内。

扩张型心肌症为一种类型的条纹肌肉疾病，其特征在于左心室或两个心室的扩张及减弱的收缩以及减弱的收缩性功能。扩张型心肌症的发生率在1:2500名个体至1:250名个体范围内。尽管为罕见疾病，扩张型心肌症表现出严重健康负荷，通常在疾病的任何阶段引起心律不齐(即缓慢性心律失常及快速心律失常)、房室阻断、血栓栓塞及猝死。截至2014年，已在LMNA基因中识别出165种扩张型心肌症相关突变(Tesson F.Cardiol J.2014；21(4):331-42)。这些突变包括错义/无意义突变、剪接突变、少量缺失、少量插入、少量插入缺失、总体缺失或总体插入。大部分引起扩张型心肌症的LMNA突变为存在于整个基因中的产生突变核纤层蛋白A/C蛋白的常染色体显性错义突变。

在某些实施方案中，本发明提供治疗核纤层蛋白病的方法。适合于治疗的核纤层蛋白病包括(但不限于)恰克-马里-杜斯氏病、埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎缩症(EDMD)、家族性部分脂质营养不良、哈钦森-吉尔福德氏早年衰老症候群(HGPS)、肢带型肌肉萎缩症、LMNA相关先天性肌肉萎缩症、下颌末端发育不良、致心律失常型右心室心肌病、家族性心房微颤、左心室致密化不全、扩张型心肌症、非典型沃纳氏症候群(Atypical Wernersyndrome)、巴拉克-西蒙斯氏症候群(Barraquer-Simons syndrome)、布施克-伦多夫氏症候群(Buschke-Ollendorff syndrome)、邓尼根型家族性部分脂质营养不良(Familialpartial lipodystrophy of the Dunnigan type，FPLD)、格林伯格发育不良、脑白质营养不良、1B型肢带型肌肉萎缩症、伴以糖尿病的脂萎缩、肝脂肪变性、肥厚性心肌症及白色真皮层丘疹(leukomelanodermic papules，LDHCP)、下颌末端发育不良伴以A型脂质营养不良(Mandibuloacral dysplasia with type A lipodystrophy，MADA)、下颌末端发育不良伴以B型脂质营养不良(Mandibuloacral dysplasia with type B lipodystrophy，MADB)、佩尔-格氏畸形(Pelger-Huet anomaly，PHA)、佩利措伊斯-梅茨巴赫氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)及紧张型皮肤挛缩症候群。

在一些实施方案中，核纤层蛋白病可为核纤层脂质营养不良症、全身性核纤层蛋白病、核纤层神经病症或肌肉核纤层蛋白病。通过「核纤层」脂质营养不良病症及「核纤层」神经病症意谓由异常核包膜形态引起或与异常核包膜形态相关的脂质营养不良及神经病症。脂质营养不良病症特征在于脂肪组织的异常分散，视情况与例如糖尿病及高三酸甘油酯血症的代谢病症相关。脂质营养不良患者通常遭受身体的某些区域中的脂肪组织的选择性缺失及/或过度积聚(例如肢体中的缺失伴随着上背中的过度沉积)。核纤层脂质营养不良病症的实例包括例如家族性部分脂质营养不良(邓尼根型)、后天性部分脂质营养不良、A型胰岛素抗性症候群、全身性脂萎缩症候群及家族性部分脂质营养不良(科博林(Kobberling))。

全身性核纤层蛋白病影响多种组织类型且包括例如非典型沃纳氏症候群、早老症(例如哈钦森-吉尔福德氏早年衰老症候群)、限定性皮肤病及下颌末端发育不良。与全身性核纤层蛋白病相关的症状多种多样。非典型沃纳氏症候群患者过早地展现通常与衰老相关的特征，例如身材矮小、骨质疏松、毛发稀疏、动脉粥样硬化症及白内障。另一方面，限定性皮肤病通常与皮肤及关节挛缩、异常颅骨矿化及肺部缺损相关。核纤层神经病症或涉及外周神经的核纤层蛋白病也适合于通过本发明方法治疗。神经核纤层蛋白病包括例如2B1型恰克-马里-杜斯氏病\常染色体显性脑白质营养不良及常染色体显性脊肌肉萎缩症。

大部分由核纤层蛋白A/C突变所引起的核纤层蛋白病涉及条纹肌肉。埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎缩症(EDMD)、1B型肢带型肌肉萎缩症、先天性肌肉萎缩症、多系统营养不良症候群、扩张型心肌症1A、家族性扩张型心肌症及扩张型心肌症伴以传导系统缺陷诊断为肌肉核纤层蛋白病。患有肌肉核纤层蛋白病的患者展现出例如肌无力或消瘦、选定肌肉肥大(例如小牛)、肌肉或肌腱挛缩、心肌病、心脏传导减弱及智力迟钝。

在某些实施方案中，本发明提供用于治疗受试者中的核纤层蛋白病的方法，该方法包含投予治疗有效量的本文所揭示的任何核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞及/或医药组合物。在某些实施方案中，本发明提供用于在受试者中表达以下者的方法：(a)核纤层蛋白A多肽或其生物活性片段；(b)核纤层蛋白C多肽或其生物活性片段；(c)核纤层蛋白A多肽或其生物活性片段及核纤层蛋白C多肽或其生物活性片段；或其生物活性变体及/或片段，该方法包含向该受试者投予本文所揭示的病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物。在某些实施方案中，本发明提供用于增加以下各者在受试者中的表达的方法：(a)功能性核纤层蛋白A多肽；(b)功能性核纤层蛋白C多肽；(c)功能性核纤层蛋白A多肽及功能性核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段，该方法包含投予本文所揭示的病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物。在一些实施方案中，此类受试者已诊断患有核纤层蛋白病或处于核纤层蛋白病的风险下，其中核纤层蛋白病为以下者中的任一者或多者：恰克-马里-杜斯氏病、埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎缩症、家族性部分脂质营养不良、哈钦森-吉尔福德氏早年衰老症候群、肢带型肌肉萎缩症、LMNA相关先天性肌肉萎缩症、下颌末端发育不良、致心律不整型右心室心肌病、家族性心房微颤、左心室致密化不全及扩张型心肌症。在一些情况下，使用病毒或病毒载体，例如AAV6或AAV9递送编码多肽的核苷酸序列，该核苷酸编码(a)核纤层蛋白A多肽；(b)核纤层蛋白C多肽；(c)核纤层蛋白A多肽及核纤层蛋白C多肽；或其生物活性变体及/或片段。在一些情况下，需要其的受试者在LMNA、LMNB1及LMNB2中的任一者或多者中具有不足基因表达或突变。

在一些情况下，使用本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物的治疗产生经改良的心脏功能、经改良的心脏肌肉收缩、增加的核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C表达或产生减小的mTOR活性。在某些实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有扩张型心肌症或处于罹患扩张型心肌症的风险下的受试者的方法。与扩张型心肌症相关的症状包括呼吸短促、腿部肿胀、疲乏、体重增加、昏厥、心悸、眩晕、血凝块、胸部疼痛及/或猝死。此外，由LMNA突变引起的扩张型心肌症在心脏中产生超活化mTOR信号传导。用本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物治疗可引起一种或多种症状的改良，例如mTOR信号传导的减少。向处于罹患扩张型心肌症的风险下的受试者投予如本文所述的疗法可预防一种或多种症状的出现或减缓其进展。

在某些实施方案中，用本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物治疗使mTOR信号传导与未经治疗对照相比或与治疗前水平相比减小至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在某些实施方案中，用本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物治疗使核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C表达与未经治疗对照相比或与治疗前水平相比增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在某些实施方案中，用本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物治疗与选自由以下组成的组的一或多种另外的疗法组合：β阻断剂、血管收缩素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制剂、血管收缩素受体阻断剂(angiotensin receptor blocker，ARB)、尼普立辛(niprilysin)抑制剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、异山梨醇二硝酸酯、肼酞嗪、地高辛(digoxin)、伊伐布雷定(ivabradine)、心脏再同步疗法(cardiac resynchronization therapy，CRT)、植入型心脏复律除颤器(implantable cardioverter defibrillator，ICD)、手术、心脏移植及/或其组合。

在某些实施方案中，本发明的方法及组合物可用于治疗已诊断患有疾病(例如核纤层蛋白病)的受试者。在各种实施方案中，核纤层蛋白病可由已知基因事件(例如所属领域中已知的任何LMNA突变)引起或可具有未知原因。受试者可为患有肌肉核纤层蛋白病的患者。在一些情况下，受试者为患有扩张型心肌症的患者。

在某些实施方案中，本发明的方法及组合物可用于治疗处于罹患疾病的风险下的受试者。可已知受试者易患疾病，例如核纤层蛋白病(即扩张型心肌症)。受试者可由于基因事件，或由于已知风险因素而易患疾病。举例而言，受试者可携带与扩张型心肌症相关的LMNA中的突变。

在某些实施方案中，本文所提供的治疗可引起症状的减少或停止，例如本文所揭示的任何核纤层蛋白病症状。举例而言，治疗可引起经改良的心脏功能、经改良的ECG读取、ERK1/2下调、减少的mTOR信号传导及增加的存活时间。心脏功能的测量、ECG读取、ERK1/2下调、mTOR信号传导、增加的存活时间及其他恰当的参数可在核纤层蛋白病的特定疾病模型中执行。举例而言，已发现核纤层蛋白病(例如肌肉萎缩症或扩张型心肌症)的若干小鼠模型。特定言的，H222P LMNA小鼠模型含有导致肌肉萎缩症及扩张型心肌症伴传导系统疾病的点突变(H222P)。尽管杂合型小鼠(LMNA

在某些实施方案中，将本文所述的核酸构建体、病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞或医药组合物经静脉内或全身性投予至受试者。可适用于本文所描述的方法的其他投予形式包括(但不限于)直接递送至所需器官(例如心脏)、经口、静脉内、肌内、鞘内、皮下、舌下、经鼻、吸入、雾化、经皮肤、局部、全身性、心肌内、经皮及其他胃肠外投予途径。若需要，可组合投予途径。

J.实施例

现已大体描述本发明，参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例仅为说明本发明的某些实施方案及具体实例而包括，且不意欲限制本发明。

实施例1：核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的LMNA微小基因构建体1产生

将HEK293T细胞(Fujifilm)以900,000个细胞/孔的密度接种于6孔盘中且在37摄氏度下培育整夜。第二天，在鸡β肌动蛋白(CB)启动子(微小基因1)或GFP对照控制下将细胞经3微克编码LMNA的质粒DNA短暂转染。CB调节组件并入鸡β肌动蛋白启动子且对应于SEQID NO:102。根据标准方法使用Fugene转染剂(Promega)转染细胞。在转染之后两天，将细胞用胰蛋白酶处理、离心且处理以用于蛋白分析。通过将细胞裂解于具有β-巯基乙醇的Laemli 4x缓冲液(Biorad)中且在95摄氏度下沸腾5分钟来制备用于西方墨点分析的样品。随后通过TGX凝胶分离蛋白裂解物且将其转移至硝化纤维素膜。将膜使用标准西方墨点方案阻断且洗涤，且在4摄氏度下用初级抗体印记过夜。将小鼠抗核纤层蛋白A/C(CST#4777，1:1000)及小鼠抗GAPDH(GeneTex#GT239，1:2000)用作初级抗体。将抗小鼠IgG HRP(Invitrogen A16078，1:5000)用作化学发光检测的二级抗体。分别在65kDa及72kDa下检测核纤层蛋白C及核纤层蛋白A，而在37kDa下检测GAPDH。

如所预期，经编码仅核纤层蛋白A或核纤层蛋白C的构建体转染的HEK293T细胞展示每个蛋白的产生。经LMNA微小基因构建体1转染的HEK293T细胞展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者的产生，这指示单一构建体能够产生两种同种型(图6)。在测试条件下微小基因2及3不产生两种核纤层蛋白同种型。

实施例2：核纤层蛋白A及核纤层蛋白C mRNA表达

HEK293T细胞如上文所述生长且短暂转染。iPS心肌细胞(Fujifilm)也经短暂转染。将心肌细胞以500,000个细胞/孔接种于6孔盘中且在37摄氏度下培育两天。转染后两天，将细胞以胰蛋白酶处理、离心且处理用于基于RNA的分析。使用RNAeasy小型试剂盒(Qiagen)遵循制造商的说明书自细胞小球提取RNA，且将其用于用Superscript IV反转录酶(Invitrogen)合成cDNA。使用核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白A或核纤层蛋白C特异性引物子集(表5)执行定量PCR以评估各个基因的表达水平。

如所预期，经编码单独核纤层蛋白A或核纤层蛋白C的构建体转染的细胞展示每个个别基因的mRNA转录。然而，经微小基因构建体1转染的HEK293T细胞展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C mRNA两者的转录，指示单一构建体能够转录两种同种型(图7)。

表5：用于定量PCR实验的引物

实施例3：心脏及肝脏组织中核纤层蛋白A及核纤层蛋白C的微小基因构建体1产生

活体外测量HEK293T细胞中的核纤层蛋白A及核纤层蛋白C产生。如上文所述生长、短暂转染及处理用于西方墨点分析的细胞。也在12周龄野生型(图8，顶部)小鼠及LMNA基因的24周龄小鼠杂合型(LMNA

如所预期，经编码仅核纤层蛋白A或核纤层蛋白C的构建体转染的HEK293T细胞展示每个个别蛋白的蛋白(图8，顶部)。经微小基因构建体1转染的HEK293T细胞展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C两者的产生，指示单一构建体能够产生两种同种型(图8顶部)。当给予携带微小基因构建体1的AAV9病毒时在野生型及杂合型LMNA

实施例4：LMNA

通过使LMNA

用PBS对照处理的LMNA

实施例5：核纤层蛋白A及核纤层蛋白C同种型在小鼠中的活体内表达

经由大致200微升的尾部静脉对12周龄C57BL/6野生型、雄性小鼠全身性投予携带微小基因构建体1的AAV9或PBS。AAV9制品包括携带微小基因构建体1的AAV9(使用普遍存在的启动子)、在心脏特异性启动子(cTNT)控制下的携带LMNA构建体的AAV9或在普遍存在的启动子控制下的携带GFP的AAV9。使用4E11 vg/小鼠的低剂量或E12 vg/小鼠的高剂量。所有动物经处理且在注射之后六周取得样品。采集心脏及肝脏组织且使用标准方法储存以用于稍后实验。

在提取之后将组织保持于RNAlater中且储存于-80摄氏度下直至需要。随后使用珠粒均质器将其解冻且在RLT缓冲液中均质化。使用RNAeasy小型试剂盒(Qiagen)遵循制造商的说明书提取RNA。使用TRUseq cDNA文库制备试剂盒(Illumina)自RNA提取物产生cDNA文库，且在Nextseq500平台上对其进行NGS测序并分析。

给予携带微小基因构建体1的AAV9(普遍存在的启动子)的小鼠展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C在心脏及肝脏两者中的表达(图10A)。如所预期，给予在心脏特异性启动子(cTNT)控制下的LMNA的小鼠展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C在心脏而非肝脏中的表达(图10B)。高剂量的在普遍存在的启动子控制下的LMNA在小鼠中展示一些肝脏毒性，且分别通过血清生物标志物(AST、交替、ALP、胆红素、肌酸等)的测量确认。低剂量动物为健康的。

实施例6：核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C在具有CMV启动子的HEK293T细胞中的表达

在37摄氏度下培育HEK293T细胞过夜。在第二天，将细胞经编码在CMV启动子或GFP对照控制下的LMNA的DNA短暂转染。根据标准方法转染细胞。培养细胞且稍后将其胰蛋白酶化、离心且经处理用于蛋白分析。

通过裂解细胞且在95摄氏度下沸腾制备用于西方墨点分析的样品。随后通过凝胶分离蛋白裂解物且将其转移至硝化纤维素膜。将膜使用标准西方墨点方案阻断并洗涤，且在4摄氏度下用初级抗体印记过夜。将小鼠抗核纤层蛋白A/C及小鼠抗GAPDH用作初级抗体。将抗小鼠IgG HRP用作化学发光检测的二级抗体。分别在65kDa及72kDa下检测核纤层蛋白C及A，而在37kDa下检测GAPDH。

经编码仅核纤层蛋白A或仅核纤层蛋白C的构建体转染的HEK293T细胞展示每个单独蛋白的蛋白(图12)。经具有核纤层蛋白A/C序列的LMNA微小基因构建体(参见微小基因构建体1的核纤层蛋白A/C序列)转染的HEK293T细胞，指示单一构建体能够生成两种同种型(图12)。

实施例7：核纤层蛋白A及核纤层蛋白C mRNA表达

如实施例6中所描述生长并短暂转染的HEK293T细胞。在转染之后两天，将细胞用胰蛋白酶处理、离心且处理以用于基于RNA的分析。使用标准提取自细胞小球提取RNA，且将其用于用反转录酶合成cDNA。使用核纤层蛋白A/C、核纤层蛋白A特异性引物集执行定量PCR以评估个别基因的表达水平。

经编码单独核纤层蛋白A或单独核纤层蛋白C的构建体转染的细胞展示每个单独基因的mRNA转录。然而，经具有核纤层蛋白A/C序列的LMNA微小基因构建体(参见微小基因构建体1的核纤层蛋白A/C序列)转染的HEK293T细胞展示核纤层蛋白A及核纤层蛋白C mRNA两者的转录，指示单一构建体能够转录两种同种型。

K.序列

表1：例示性核纤层蛋白A及/或核纤层蛋白C核酸序列的列表。

表2：本文所揭示的某些氨基酸序列的清单。

表3：例示性调节组件核酸序列的清单

表4：本申请公开的其它核苷酸序列

以引用的方式并入

本说明书中所提及的所有公开案、专利及专利申请案均以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同各单独的公开案、专利或专利申请案经特定及单独地表明以引用的方式并入一般。