一组区分特发性炎性肌病的诊断标记物

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一组区分特发性炎性肌病的诊断标记物。

背景技术

特发性炎性肌病(Idiopathic inflammatory myopathies，IIMs)是一组异质性的自身免疫病，患者特征性表现为血清肌酶异常、肌无力，肌肉炎症等[1]。IIMs肌细胞死亡的分子机制仍有待阐明。有研究报道细胞凋亡在IIMs患者肌肉组织中并无异常，且可能与抗凋亡蛋白的表达增加有关。后续研究中，有学者报道内质网应激、自噬的过度活化是IIMs肌肉损伤的重要非免疫学机制[2,3]。此外，瑞典学者证实CD28(null)T细胞能够在体外对自体肌细胞产生细胞毒作用，并且是通过分泌穿孔素来实现的[4].最近，法国学者通过细胞实验和动物模型研究，证实抗SRP抗体和抗HMGCR抗体对IIMs肌细胞具有直接的病理作用[5,6].这些研究提示IIMs肌肉损伤可能涉及多种因素共同参与，包括免疫学机制和非免疫学机制。进一步明确IIMs的肌细胞死亡机制，对于发现新的治疗靶点具有重要意义。

肌肉病理分析发现，肌细胞坏死是IIMs患者肌肉组织中最常见的病理学改变。早期时候，细胞坏死被认为是一种被动的细胞死亡方式，并且不可被调控。随着程序性坏死(necroptosis)的发现，细胞坏死不再被认为是偶然的细胞死亡方式，而是可以被调控的[7].参与程序性坏死的分子主要包括受体相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein 1，RIP1)、受体相互作用蛋白3(RIP3)、混交激酶域蛋白(mixed lineage kinasedomain-like，MLKL),这些蛋白共同作用形成程序性坏死小体[7]。作为程序性坏死的晚期事件，RIP3和MLKL蛋白被磷酸并且转运至细胞膜，导致细胞膜的通透性增加、膜结构破坏进而诱导细胞坏死。伴随细胞程序性坏死，损伤相关的分子模式(damage-associatedmolecular pattern，DAMP)包括HMGB1、IL33等被释放至细胞外，进一步介导组织的炎性损伤[7,8]。肌肉活检分析证实IIMs患者肌肉组织中可常见肌细胞坏死和炎性浸润，但其分子机制仍有待阐明。

本研究拟通过研究IIMs患者肌肉组织中RIP3、MLKL蛋白的表达水平、分析其与疾病严重程度的关联性，以及细胞实验，研究程序性坏死是否参与IIMs发病机制。。

[参考文献]

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发明内容

本发明首先涉及一组分子标记物的检测试剂在制备用于鉴定特发性炎性肌病的诊断试剂或试剂盒中的应用，

所述的一组分子标记物为：受体相互作用蛋白3(RIP3)、混交激酶域蛋白(mixedlineage kinase domain-like，MLKL)；

优选的，所述的检测试剂为：单克隆或多克隆抗体。

本发明还涉及一种用于鉴定特发性炎性肌病的诊断试剂盒，

所述的试剂盒包括：

检测如下蛋白的检测试剂：受体相互作用蛋白3(RIP3)、混交激酶域蛋白(mixedlineage kinase domain-like，MLKL)。

优选的，所述的检测试剂为：单克隆或多克隆抗体。

优选的，所述的检测试剂盒为：ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、流式细胞仪试剂盒。

本发明还涉及一组分子标记物的检测试剂在制备用于区分特发性炎性肌病亚型的诊断试剂或试剂盒中的应用，

所述的一组分子标记物为：受体相互作用蛋白3(RIP3)、混交激酶域蛋白(mixedlineage kinase domain-like，MLKL)；

所述的区分特发性炎性肌病亚型为：将特发性炎性肌病区分为：

亚型(1)：皮肌炎(dermatomyositis，DM)和/或免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)；

亚型(2)：(amyopathic DM，ADM)；

所述的区分亚型指：

所述的一组分子标记物高表达时，将特发性炎性肌病区分为亚型(1)；所述的一组分子标记物低表达时，将特发性炎性肌病区分为亚型(2)。

优选的，所述的检测试剂为：单克隆或多克隆抗体。

本发明还涉及一种用于区分特发性炎性肌病亚型的诊断试剂盒，

所述的区分特发性炎性肌病亚型为：将特发性炎性肌病区分为：

亚型(1)：皮肌炎(dermatomyositis，DM)和/或免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)；

亚型(2)：(amyopathic DM，ADM)；

所述的区分亚型指：

所述的一组分子标记物高表达时，将特发性炎性肌病区分为亚型(1)；所述的一组分子标记物低表达时，将特发性炎性肌病区分为亚型(2)；

所述的试剂盒包括：

检测如下蛋白的检测试剂：受体相互作用蛋白3(RIP3)、混交激酶域蛋白(mixedlineage kinase domain-like，MLKL)。

优选的，所述的检测试剂为：单克隆或多克隆抗体。

优选的，所述的检测试剂盒为：ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、流式细胞仪试剂盒。

附图说明

图1、IIMs患者肌肉组织RIP3和MLKL蛋白表达检测：

1A：蛋白印迹检测IIMs肌肉组织RIP3和MLKL蛋白表达；

1B：蛋白印迹检测IIMs肌肉组织磷酸化RIP3和MLKL蛋白表达；

1C：免疫组化分析RIP3和MLKL蛋白及其磷酸化蛋白的表达；

1D：连续切片进行RIP3、MLKL蛋白的免疫组化分析；

1E：蛋白印迹结果定量分析。

图2、RIP3、MLKL蛋白表达水平与患者肌肉病变程度相关：

2A、2B、2C：典型的坏死评分分别为0，1，2的肌肉组织HE染色；

2D：RIP3、MLKL蛋白表达水平在坏死评分为2分组显著高于评分为0和1分患者组；

2E：IIMs患者RIP3、MLKL蛋白表达水平与血清CK、LDH显著正相关；与患者肌力评分MMT8呈显著负相关(r＝-0.43,P<0.05；r＝-0.63,P<0.01)；

2F：肌肉组织中RIP3、MLKL蛋白在治疗前后的表达变化。

图3、IIM肌肉组织中HMGB1和IL33的表达检测：

3A：免疫组织化学检测IIM患者和健康对照肌肉组织中HMGB1和IL33的表达；

3B：连续切片进行HMGB1、MLKL蛋白的免疫组化分析；

3C：肌肉组织中HMGB1蛋白在治疗前后的表达变化。

图4、体外实验研究TNFα诱导成肌细胞C2C12程序性坏死过度活化：

4A：刺激24小时后，形态学观察各组细胞数量及状态；

4B：细胞活性测定实验结果显示TNFα+z-VAD组活细胞百分比显著降低，而TNFα组、TNFα+z-VAD+Nec-1s组与对照组无差异；

4C：流式细胞分析证实TNFα+z-VAD协同刺激后，PI阳性染色的C2C12比例显著增加，而TNFα组、TNFα+z-VAD+Nec-1s组与对照组无差异；

4D和4E：蛋白印迹结果显示TNFα+z-VAD协同刺激组C2C12细胞MLKL和磷酸化的MLKL蛋白显著上调，而TNFα组、TNFα+z-VAD+Nec-1s组与对照组无差异。

图5、MLKL基因敲降的C2C12细胞抵抗TNFα诱导的程序性坏死：

5A：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲降C2C12细胞MLKL基因，蛋白印迹分析证实该多克隆细胞MLKL蛋白表达显著下降；

5B：对MLKL敲降的C2C12细胞、对照C2C12细胞进行TNFα诱导程序性坏死实验，结果显示经TNFα+z-VAD协同刺激后，MLKL敲降的C2C12细胞活细胞百分比显著高于对照C2C12细胞。

具体实施方式

材料及方法

入组患者信息

本研究通过中日友好医院伦理委员会审查(伦理批准号2019-25-K19).所有患者的临床数据均为匿名使用，所有患者均签署知情同意。本研究共纳入2017-2019年在中日友好医院风湿免疫科住院治疗的26例确诊的IIM患者，患者诊断标准采用2017年EULAR/ACR标准[9]。根据该分类标准，5名患者诊断为皮肌炎(dermatomyositis，DM),4名患者诊断为无肌病性皮肌炎(amyopathic DM，ADM)。此外，17名患者诊断为免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)[10]。所有患者均进行了肌肉活检检查并且病理学明确诊断。本研究中收集了4例无肌肉疾病的创伤患者肌肉组织，作为健康对照。

肌肉组织病理学评分

患者肌肉活检组织的病理学评分依据已发表的儿童皮肌炎肌肉活检评分工具进行[11,12]，肌肉坏死评分定义为三个等级，分别为0分(活检组织中无坏死肌细胞)，1分(坏死肌细胞比例为1％-5％)，2分(坏死肌细胞比例≥5％).。

蛋白印迹分析

从患者肌肉组织或体外培养细胞中抽提的总蛋白进行12％或15％的SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜后，5％脱脂奶粉封闭2小时，然后用抗RIP3(ProSci，Poway,CA,USA)、抗MLKL(Abcam,Cambridge,UK)和抗GAPDH(Abcam,Cambridge,UK)的抗体孵育PVDF膜，4℃过夜。

次日用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠(Abcam,Cambridge,UK)和羊抗兔(Abcam,Cambridge,UK)二抗室温孵育1h后成像。应用ImageJ(National Institute of Health,USA)分析免疫印迹条带强度。

免疫组织化学分析

制备IIM及HCs骨骼肌冰冻切片，用一抗4℃孵育过夜；次日PBS-T洗膜3次后，用羊抗鼠/兔二抗室温孵育1h；PBS-T洗膜3次后，3,3'-二氨基联苯胺显色，显微镜阅片。

本研究中使用到的一抗包括：

抗RIP3多克隆抗体(ProSci，Poway,CA,USA)，

抗MLKL单克隆抗体(Abcam)，

抗RIP3(phospho S227)单克隆抗体(Abcam)，

抗MLKL(phospho S358)单克隆抗体(Abcam)，

抗HMGB1多克隆抗体(Proteintech)，

抗IL33单克隆抗体(Abcam)。

细胞培养和刺激

采用100mm的培养皿(Corning,New York,USA)培养C2C12细胞。C2C12培养基为DMEM(Gibco,Grand Island,USA)，15％胎牛血清(FBS；Gibco,Grand Island,USA)和1％青霉素-链霉素(Gibco,Grand Island,USA)。

本研究中使用的细胞刺激剂包括：

重组TNFα蛋白(Biolegend,San Diego,CA,USA)，使用浓度为100ng/ml；

z-VAD-FMK(Promega,Madison,WI,USA)，使用浓度为40μM；

Nec-1s(Biovision,San Francisco,CA,USA)，使用浓度为50μM.。

细胞死亡检测

采用

流式细胞分析

体外培养的C2C12细胞经刺激剂处理后，收集细胞，PBS清洗，PI染液(BDPharmingen,San Diego,California,USA)染色20分钟，离心，PBS洗涤，重悬于500μL PBS溶液中，进行流式细胞分析(FACS JAZZ，BD,San Diego,California,USA)。数据通过FASC软件进行分析。

C2C12细胞MLKL基因敲除

采用CRISPR/Cas9基因编辑系统对C2C12细胞进行MLKL基因敲降，具体方法见本课题组前期发表文章[13]；最终采用的sgRNA序列为5’-GTCTCTGGAGAGGCTGTAGC-3’；退火的sgRNA克隆入PX458质粒，重组质粒采用Lipofectamine LTX(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)转染入C2C12细胞。荧光阳性细胞通过流式细胞进行分选(BD Aria III FACSsystem)。分选得到的多克隆细胞进行蛋白印迹分析检测MLKL蛋白的表达，并作为MLKL敲降细胞用于后续研究。

统计学分析

连续变量符合正态分布者用均数±标准差描述，非正态分布者用中位数和四分位间距(IQR)描述。分类变量以百分比和绝对频数表示。计量资料组间比较应用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。Spearman相关分析统计数据间相关性。应用SPSS 23.0(SPSSinstitute,USA)和GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,USA)进行数据管理和统计分析。

实施例1、IIM患者肌肉组织中，程序性坏死因子过度活化

RIP3和MLKL是参与程序性坏死的关键分子。为了研究IIM患者肌肉组织中程序性坏死的活化程度，我们检测了24例IIM患者的RIP3和MLKL蛋白在IIM肌肉组织中表达水平。这24例患者的临床和实验室检查数据见表1。

蛋白印迹分析结果显示皮肌炎(DM)和免疫介导的坏死性肌病(IMNM)患者组肌肉组织中RIP3和MLKL蛋白表达水平显著高于无肌病皮肌炎(ADM)患者组和健康对照组(图1A)。磷酸化的RIP3和MLKL蛋白在DM和IMNM组的表达水平同样高于ADM组和健康对照组(图1B)。结果显示，

健康对照、无肌病皮肌炎(ADM)、皮肌炎(DM)、免疫介导的坏死性肌病(INMN)组中，

RIP3蛋白相对表达量分别为0.143±0.165,0.053±0.05,0.268±0.184,0.214±0.178；

MLKL蛋白相对表达量分别为0.179±0.156,0.145±0.034,0.949±0.105,0.57±0.389。

可见皮肌炎(DM)、免疫介导的坏死性肌病(INMN)患者肌肉组织RIP3和MLKL蛋白表达水平显著高于无肌病皮肌炎(ADM)患者和健康对照(*P<0.05)。

免疫组化结果显示RIP3、MLKL蛋白以及磷酸化的RIP3、MLKL蛋白在DM和IMNM患者肌肉组织中显著表达上调，而ADM患者和健康对照肌肉组织中未见阳性染色(图1C)。

我们进一步利用连续切片进行RIP3、MLKL蛋白的免疫组化分析，结果显示RIP3、MLKL蛋白共表达于坏死的肌细胞(图1D)。

对蛋白印迹结果定量分析，我们发现IIMs患者肌肉组织中RIP3、MLKL蛋白相对表达水平显著正相关(r＝0.75,P<0.001)(图1E)。这些结果证实RIP3、MLKL蛋白在伴有肌细胞坏死的IIMs患者肌肉组织中显著高表达，提示程序性坏死的过度活化。

表1、IIM患者和健康对照临床和实验室检查数据

ADM:无肌病性皮肌炎；CK:肌酸激酶；DM:皮肌炎；IMNM:免疫介导的坏死性肌病，MMT8：肌力检查评分

实施例2、RIP3、MLKL蛋白表达水平与患者肌肉病变程度相关

通过对IIMs患者肌肉组织病理改变进行评分，我们将IIMs患者分为三组：坏死评分0分组，1分组，2分组。图2A,B,C展示的是典型的坏死评分分别为0，1，2的肌肉组织HE染色。

通过比较三组患者RIP3、MLKL蛋白的表达水平，我们发现坏死评分越高的组，其RIP3、MLKL蛋白水平也越高(图2D)。此外，IIMs患者RIP3、MLKL蛋白表达水平与血清CK、LDH显著正相关(图2E)；与患者肌力评分MMT8呈显著负相关(r＝-0.43,P<0.05；r＝-0.63,P<0.01)(图2E)。

我们对2例治疗反应良好的IMNM患者(临床和实验室检查数据见表2)分析其肌肉组织中RIP3、MLKL蛋白在治疗前后的表达变化，发现在治疗6个月并且疾病缓解后，肌肉组织中RIP3、MLKL蛋白表达显著下降(图2F)。

作为对照组，我们采用蛋白印迹方法，同样检测了2例ADM患者和6例IMNM患者肌肉组织中RIP1蛋白的表达水平，结果显示两组患者RIP1的相对表达水平分别为0.069±0.01，0.138±0.08；提示IMNM患者RIP1表达水平稍高于ADM患者，但无统计学显著性。提示在患者中，RIP3、MLKL蛋白的表达量的变化，是有一定特异性的。

表2、2例IMNM患者治疗前后的临床和实验室数据

IMNM:免疫介导的坏死性肌病

实施例3、程序性坏死过度活化的IIMs患者肌肉组织中损伤相关分子模式表达增加

程序性坏死活化导致的坏死细胞会释放多种损伤相关分子标记，包括HMGB1、IL33等[8]。

我们通过免疫组化分析发现IMNM和DM患者肌肉组织中HMGB1和IL33蛋白表达显著增加，而ADM和健康对照肌肉组织中未见阳性表达(图3A)。利用连续切片进行HMGB1、MLKL蛋白的免疫组化分析，结果显示HMGB1、MLKL蛋白共表达于坏死的肌细胞(图3B)，这提示程序性坏死过度活化的肌细胞HMGB1表达水平显著上调。此外，我们同样发现治疗后的IMNM患者，肌肉组织HMGB1较治疗前显著下降(图3C)。

实施例4、TNFα诱导成肌细胞C2C12程序性坏死过度活化

文献报道TNFα能够在体外诱导多种细胞程序性坏死过度活化，因此我们利用TNFα蛋白刺激体外培养的成肌细胞C2C12，研究其程序性坏死的活化及细胞死亡水平。

结果显示，在TNFα刺激的同时，加入泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂z-VAD，能够显著观察到C2C12细胞数量减少(图4A)；细胞活性测定结果显示TNFα+z-VAD协同刺激组活细胞百分比显著下降，而单独的TNFα刺激组活细胞百分比与对照组并无差异(图4B)。

我们进一步利用程序性坏死抑制剂necrostatin-1s(Nec-1s)对细胞进行处理，发现TNFα+z-VAD协同刺激C2C12的同时，加入Nec-1s，活细胞百分比显著增加(图4A、4B)。

流式细胞分析同样证实TNFα+z-VAD协同刺激后，PI阳性染色的C2C12比例显著增加，加入Nec-1s能够显著降低TNFα+z-VAD刺激诱导的PI阳性染色C2C12比例(图4C)。

我们对各刺激组C2C12细胞裂解液进行蛋白印迹分析，结果显示TNFα+z-VAD协同刺激组C2C12细胞MLKL和磷酸化的MLKL蛋白显著上调，而经Nec-1s处理后，两者表达水平与对照组无差异(图4D、4E)。这些结果证实TNFα在体外能够诱导成肌细胞C2C12程序性坏死过度活化，进而诱导成肌细胞坏死增加。

实施例5、MLKL基因敲降的C2C12细胞能够抵抗TNFα诱导的程序性坏死

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，我们得到了MLKL基因敲降的C2C12多克隆细胞，蛋白印迹分析证实该多克隆细胞MLKL蛋白表达显著下降(图5A)。我们对MLKL敲降的C2C12细胞、对照C2C12细胞进行TNFα诱导程序性坏死实验，结果显示经TNFα+z-VAD协同刺激后，MLKL敲降的C2C12细胞活细胞百分比显著高于对照C2C12细胞(图5B)。这提示MLKL敲降后，C2C12能够抵抗TNFα诱导的程序性坏死。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。