一种无鳞淡水鱼皮制备的生物组织工程再生支架技术和应用方式

技术领域

本发明涉及医疗辅助器械、医用生物材料、生物组织工程和再生医学研究领域，具体为一种无鳞淡水鱼皮制备的生物组织工程再生支架技术和应用方式。

背景技术

10%-20%的全层皮肤缺损可定义为超大创伤或严重创伤，会造成体液迅速流失和严重感染，危及患者生命。在自体皮肤资源有限的情况下，治疗超大伤口的主要挑战是一次性完成创面覆盖和构建具有毛囊、汗腺等功能的皮肤。目前临床上，取自自体供区中厚皮肤（表皮+部分真皮），经手工或机械压碎后制备成微粒皮，通过扩增可覆盖微粒皮自身表面积10倍以上的伤口，但没有毛囊和汗腺等皮肤附属物，愈合后瘢痕严重外观不良，创面区无法排汗、瘢痕时常破溃和疼痛瘙痒，给患者带来巨大痛苦。

也有研究人员曾尝试用含有毛囊的全层微粒皮肤或柱状皮肤治疗大面积皮肤缺损，但没有组织工程支架支撑，全层微粒皮无法立体生长，修复效果不理想。我们发现，皮肤以结构单元的形式排列而成，这些结构单元以相等距离的、交错的等腰三角形排列，这种天然排列方式能够为皮肤提供最佳韧性和延展性。

因此，我们提出了最小功能单元（MFUS）的概念：通过采集微型全层柱状自体皮肤组织，其最小直径内包含毛囊、汗腺和其他皮肤附件，可用于构建具有完整皮肤功能的新皮肤，新皮肤外观良好，具有排汗等皮肤功能。同时我们发现，此方法可应用于脂肪、肝脏和骨骼等具有类似结构单元特征的器官。MFUS可以作为“微组织种子”种植在组织工程支架中，修复组织缺损，进行器官再造。

已经有研究证实，鱼皮可以用于皮肤伤口修复，显示出良好的组织相容性和促进创面愈合效果，但它们通常被用作伤口敷料和止血材料，伤口以瘢痕形式愈合。目前的相关专利，鱼皮多用来提取自胶原和制备化学交联的胶原支架材料，也有应用鱼皮脱细胞真皮基质材料作为创面敷料，但这些设计在抗菌性、支撑强度、孔隙率和胶原活性方面无法满足目前组织器官再生的支架要求。

本发明主要利用鱼皮中的天然胶原成份制备辅助MFUS进行器官再生的组织工程支架。我们开发适配于微组织再生的鱼皮处理技术，适合大面积全层皮肤缺损完整功能性修复，也可以为其他组织器官再生提供一种胶原结构完整，孔隙率和支撑强度可控的支架材料。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种无鳞淡水鱼皮制备的生物组织工程再生支架技术和应用方式，解决了目前大面积皮肤缺损治疗后，瘢痕严重，没有毛囊和汗腺等皮肤附属物，无法排汗、创面瘢痕时常破溃、疼痛瘙痒和外观不良的问题。也可以为其他组织器官再生提供一种胶原结构完整，孔隙率和支撑强度可控的支架材料。

一种无鳞淡水鱼皮制备的生物组织工程再生支架技术和应用方式，包括无鳞淡水鱼特殊饲养筛选，鱼皮的获取和制备过程，生物组织工程再生领域的应用和辅助组织器官再生的应用方式。

优选的，所述无鳞淡水鱼筛选包含镜鲤（学名：Cyprinus carpio var.specularis），是欧洲鲤鱼的变种，表皮有光泽，好像镜面一样光滑且光泽明显，故称呼为镜鲤。体形较粗壮，侧扁，头后背部隆起，头较小，眼较大，体表鳞片较大，沿边缘排列，背鳍前端至头部有1行完整的鳞片，背鳍两侧各有1行相对称的连续完整鳞片，各鳍基部均有鳞，个别的个体在侧线上见有少数鳞片。侧线大多较平直、不分枝，个别个体的侧线末端有较短的分枝。体色随栖息环境不同而有所变异，通常背部棕褐色，体侧和腹部浅黄色。多栖息於水域中下层，而以富营养水域底泥砂质静水域为主，有集体群游习性。为杂食性鱼类，以小型无脊椎动物与底栖动物为主。为适合在中国推广的水产优良养殖品种。在合理的放养密度和较优的饲养条件下，镜鲤生长速度非常快。镜鲤鱼皮的真皮层含有和人体组织相似的I型胶原成份，表皮层鳞片退化变异，进化为富含油脂的较厚的无鳞真皮层，适合应用于人体皮肤创面覆盖。

优选的，镜鲤性成熟年龄雌鱼3-4龄，雄鱼2-3龄。通常繁殖水温17℃-25℃，最适水温19℃-22℃。在筛选步骤中，以洁净室内养殖，在饲养过程中，逐渐提高饲养水温，提高其真皮层胶原热稳定温度。

优选的，鱼类Ⅰ型胶原一个最显著的的特点是热稳定性比猪、牛等陆生动物低，并呈现有鱼种的特异性。热稳定性低意味着在人体体温条件下胶原即可发生变性，丧失部分生物活性，不利于创面修复。我们发现，镜鲤胶原的热变性温度高于其它鱼品种，可达到32-38℃左右，进一步通过高温培养，提高其热变性温度，为应用于人体创面治疗提供保障。

优选的，镜鲤鱼皮肤结构中，真皮层适合制备医疗用生物组织工程支架，表皮层发挥保湿、保护创面作用，利于伤口愈合。镜鲤鱼皮肤脂肪含量约22%（普通鱼类2%-10%），脂肪成份含有不饱和脂肪酸，特别是ω-3不饱和脂肪酸，有天然抑菌作用，可以保护创面。镜鲤鱼皮代谢率低，易于重金属沉积，特殊饲养模式后期，在饲料中加入离子银成份（目前高级创面敷料多以银离子为抗菌主要成份），其沉积的银离子成份可以进一步发挥天然抗菌作用，保护皮肤伤口。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，应用无菌化车间获取完整鱼皮组织，应用物理方法去除鱼肉等其它杂物，全程在4℃环境操作，保护I型胶原天然结构。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，应用高浓度NaCl：8%-26.5%（饱和浓度26.5%），进一步溶解粘液、色素、杂质蛋白等无效成份。（鱼皮胶原不溶解于NaCl）。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，应用低浓度乙酸（0.01%-0.1%），使鱼皮真皮层进一步溶胀松解，增加鱼皮厚度，提高孔隙率，易于创面透气及毛细血管生长，促进创面愈合。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，进一步应用胃蛋白酶0.1-1.0 w/v，溶解溶胀松解后暴露的胶原端侧氨基酸抗原（引起人体免疫反应主要抗原），对完整胶原无损坏。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，进一步应用高浓度NaCl：8-26.5%，溶解残余的小清蛋白等杂质蛋白，高渗条件也具有天然杀菌作用，细菌会变性死亡。鱼皮材料获取制备过程中，浸泡入无菌雪碧碳酸糖成份溶液中，碳酸可中和上述步骤残留乙酸，糖类在后期利于创面生长。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，应用0.8%生理盐水浸泡1小时（体积比1：100），然后转移到10×10×2cm无菌树脂器皿盘中，-20℃制备成冰冻组织工程支架，应用时待冰块溶解后，直接用于创面治疗，利于运输和保存。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，进一步将上述冰冻鱼皮置入低温负压冻干机，制备成冻干材料。应用时，以0.8%生理盐水浸泡5分钟，恢复弹性和水分后，用于创面治疗。冻干后进一步提高保存时间。

优选的，鱼皮材料获取制备过程中，以紫外线对鱼皮组织工程材料进行消毒处理；应用III型安尔碘溶液、洗必泰（氯己定）等对鱼皮组织工程材料进行消毒处理；应用美宝烫伤膏、甲硝唑凝胶等对鱼皮组织工程材料进行消毒和保湿处理；应用甘油成份产品对对鱼皮组织工程材料进行消毒和保湿处理。

优选的，所述生物组织工程再生领域的应用，鱼皮材料可以应用于烧伤、外伤、糖尿病等慢性疾病形成的创面，利于天然胶原的组织修复性，是天然的创面生物敷料。

优选的，所述生物组织工程再生领域的应用，在支架上点阵打孔，等腰三角形排列点阵打孔，在孔内植入柱状皮肤微组织（皮肤再生最小功能单元，MFUS），MFUS在支架辅助下立体生长，创面愈合后，构建具有功能性的皮肤。

优选的，所述辅助组织器官再生的应用方式，支架负载肝脏微组织结构单元，骨微组织结构单元，脂肪微组织结构单元，均为类似的结构单元形式，采用多层叠加、微球共混等方式，辅助组织器官再生。

附图说明

图1为本发明镜鲤鱼皮组织工程支架负载大鼠皮肤最小功能单元治疗大面积皮肤缺损创面；1 大鼠背部23%全层皮肤缺损创面、2 大鼠正常皮肤（伤口边缘）、3 镜鲤鱼皮组织工程支架、4 大鼠皮肤最小功能单元MFUS。

图2 为本发明镜鲤鱼皮支架溶胀步骤后厚度变化电镜示意图；5乙酸10%浓度溶解六小时后；6 乙酸3%浓度溶解六小时后；7 乙酸1%浓度溶解六小时后、8乙酸0.1%浓度溶解六小时后、9乙酸0.01%浓度溶解六小时后、10蒸馏水溶解六小时后。

图3 为本发明材料特性检测；11 溶胀后不同实验组孔隙率统计；12 溶胀后不同实验组傅立叶红外光谱分析分之间结合键。

图4为本发明材料蛋白质电泳图片；13 蛋白质电泳分子量标记条带；14 新鲜镜鲤鱼皮蛋白质成份；15 支架材料样本-1蛋白质成份；16支架材料样-2蛋白质成份。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种无鳞淡水鱼皮制备的生物组织工程再生支架技术和应用方式，包括无鳞淡水鱼特殊饲养筛选，鱼皮的获取和制备过程，生物组织工程再生领域的应用和辅助组织器官再生的应用方式。本发明应用无鳞淡水鱼（镜鲤等）优异的组织相容性，经过筛选养殖等安全处理技术，制备成可以广泛应用于组织再生领域的生物支架材料，处理后的鱼皮材料不仅保留鱼皮胶原的完整结构和活性，而且保留鱼皮不饱和脂肪酸等促进愈合和再生成份，特别是其特殊设计的厚度和孔隙率，用于负载微组织再生结构单元，未来应用于皮肤再生、肝脏再生、骨骼再生和脂肪组织等再生领域，具有非常重要的临床应用价值。

实施例1。

在本实施例中：1大鼠背部23%全层皮肤缺损创面、2 大鼠皮肤（伤口边缘）、3 镜鲤鱼皮组织工程支架、4 大鼠皮肤最小功能单元MFUS 。经过特殊饲养筛选之后的镜鲤鱼皮，冻干后的组织工程支架、镜鲤鱼皮支架生理盐水浸泡后，2mm孔用以负载皮肤组织再生最小功能单元。5乙酸10%浓度溶解六小时后；6 乙酸3%浓度溶解六小时后；7 乙酸1%浓度溶解六小时后、8乙酸0.1%浓度溶解六小时后、9乙酸0.01%浓度溶解六小时后、10蒸馏水溶解六小时后。11 镜鲤鱼皮溶胀后不同实验组孔隙率统计、12 镜鲤鱼皮溶胀后不同实验组傅立叶红外光谱分析分之间结合键。13-16 镜鲤鱼皮和支架蛋白质电泳结果。

在本实施例中，镜鲤鱼苗在20℃水温中饲养，3年内，逐渐提高水温至25℃。饲养第三年开始在饲料中和养殖水域中加入离子银成份，根据WHO最新发布的《世界卫生组织饮用水质量指导标准》第四版，银离子浓度低于0.1ppm的饮水不会对生物体造成不良影响（ppm是溶液溶质质量分数的一种表示方法，1升水溶液中有1毫克的溶质，g/m3或mg/L）。鱼皮制备过程中，应用无菌化车间获取完整鱼皮组织，应用物理方法去除鱼肉等其它杂物，全程在4℃环境操作，保护I型胶原天然结构。

在本实施例中，进一步应用高浓度NaCl：8%，进一步溶解粘液、色素、杂质蛋白等无效成份。应用低浓度乙酸（0.3-0.01%），使鱼皮真皮层进一步溶胀松解，进一步应用胃蛋白酶0.1-1 w/v，溶解溶胀松解后暴露的胶原端侧氨基酸抗原（引起人体免疫反应主要抗原），对完整胶原无损坏。鱼皮材料获取制备过程中，进一步应用高浓度NaCl：6-10%，溶解残余的小清蛋白等杂质蛋白，浸泡入雪碧碳酸糖成份溶液中，应用0.9%生理盐水浸泡1小时（体积比1：100），然后转移到10×10×2cm无菌树脂器皿盘中，-20℃制备成冰冻组织工程支架，应用时待冰块溶解后，直接用于创面治疗，利于运输和保存。或将上述冰冻鱼皮置入低温负压冻干机，制备成冻干材料。应用时，以0.9%生理盐水浸泡5-30分钟，恢复弹性和水分后进一步应用。

在本实施例中，进一步通过扫描电镜发现，镜鲤鱼皮支架材料能够形成需要的空隙率，确定最佳溶胀乙酸溶液浓度为0.1%，六小时。应用傅立叶红外光谱检测发现，0.1%溶胀后的胶原结构保持完整，而高于此浓度的乙酸浓度会对胶原成份有破坏作用。进一步的，应用蛋白质电泳明确，经上述处理过程获得的组织工程支架，能够保存完整的胶原肽链结构。

本实施例中，镜鲤鱼皮组织工程支架负载大鼠皮肤最小功能单元治疗大面积皮肤缺损创面；SD大鼠背部构建23%全层皮肤缺损创面1；大鼠皮肤（伤口边缘）2；镜鲤鱼皮组织工程支架径点阵孔径设计3；负载大鼠皮肤最小功能单元MFUS 4；构建新型组织工程皮肤，用于皮肤组织再生。

实施例2。

经过特殊饲养筛选之后的罗非鱼皮冻干后的组织工程支架经过以下步骤：罗非鱼皮支架生理盐水浸泡；罗非鱼皮支架折叠韧性测试；罗非鱼皮支架拉伸韧性测试；罗非鱼皮支架扭曲韧性测试。

在本实施例中，罗非鱼皮去鳞后，应用上述相似步骤获得冻干支架；以0.9%生理盐水浸泡5分钟，恢复弹性和水分后进一步应用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

一种无鳞淡水鱼皮制备的生物组织工程再生支架技术和应用方式与其它相类似专利区别如下：