一种苹果组培初代材料的培养方法

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，具体涉及一种苹果组培初代材料的培养方法。

背景技术

随着科学技术发展，植物组培脱毒快繁，在人工控制条件下一年四季均可生产，并可在短时间内可获得大量组培脱毒苗木。但利用组织培养对植物进行扩繁时，初代培养常因培养材料褐变、污染，无法达到初代材料快速建立的目的。组培初代材料的建立，通常采集春季旺盛生长的幼嫩茎尖、茎段、叶、根等组织，在不同初代培养基、适宜的灭菌方法下进行，利用以上成龄树体的成熟器官做外植体，在初代材后建立成活后，还需经过3-5代童化期的转接培养，才能使成龄器官达到适宜试管瓶内生长的微型植株。选取的茎尖等幼嫩组织，如果灭菌时间长，组织受损，初代培养成活率差；如果处理时间短，组织灭菌不干净，初代培养失败。不同树种、品种，选择不同启动培养基，费时费工。春季采集旺盛生长组织，材料建立受季节限制。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对现有技术存在的缺点而提供一种苹果组培初代材料的培养方法，本发明采用成熟饱满的苹果砧木种子，利用冰箱对种子进行低温沙藏处理，在无菌条件下催芽，剪取获得幼芽直接在扩繁培养基中扩繁，达到快速建立苹果组培初代材料的培养目的。

为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：

一种苹果组培初代材料的培养方法，包括砧木种子的低温沙藏处理、种子的灭菌、种子无菌催芽、小苗扩繁培养工艺，具体步骤如下：

a、砧木种子低温沙藏处理：将成熟饱满的种子浸泡后用湿河沙拌匀，装在带有透气孔的组培瓶内，放在2-4℃低温中沙藏处理，沙藏期间需翻动检查，防止湿度过大或过小，观察到种子露白后从低温中取出灭菌；

b、露白种子的灭菌：将低温处理后露白的种子从沙子中清洗出来，先使用流水冲洗，再使用浓度为75%的酒精和浓度为0.1%的升汞浸泡，最后使用无菌水冲洗；

c、灭菌后种子的催芽：将灭菌后的种子放置在铺有滤纸且经高压灭过菌的培养瓶内，将培养瓶置于20-24℃的培养室催芽；

e、芽苗的转接：当种子萌芽长到1.5-2.5cm且具有3-4片真叶时，在超净工作台上，剪取根茎上部小苗接入扩繁培养基中，连续重复转接2-3次培养，在小苗扩繁到一定数量之后，再进行热处理结合茎尖培养脱毒，筛选适宜培养基进行工厂化生产。

所述步骤a中将成熟饱满的种子用常温水浸泡20-24h后用5-10倍于种子的湿河沙拌匀。

所述步骤a中低温冷藏处理时百粒重0.5-2.0g的种子处理35-40d、百粒重2.0g-3.5g的种子处理55-60d。

所述步骤a河沙湿度手握成团，一触即散为宜。

所述步骤b中先将低温处理后露白的种子在室温下放置20-24h后，从沙子中清洗出种子，先用流水冲洗20 -30min然后将种子再分别使用浓度为75%的酒精浸泡10-15s和浓度为0.1%的升汞浸泡15-20min，最后用无菌水冲洗3-5次，浸泡时进行摇动，使种子和灭菌剂紧密接触。

所述步骤c中在将灭菌后的种子放置在铺有滤纸且经高压灭过菌的培养瓶内时，在滤纸上滴入无菌水使其湿润。

所述步骤e中培养基为：MS+6-BA0.6～0.8 mg/l+IBA0.1～0.2 mg/l,白砂糖8-10g、琼脂粉5-7g。

所述步骤e中培养时先暗培养3-5d,再光照培养。

本发明采用苹果砧木种子作为材料，通过冰箱等低温处理，当种子满足低温需求萌芽时，对种子进行灭菌，在无菌条件下催芽。本发明因种子在冰箱等中低温处理，周年可按需要随时进行，不受季节的限制；种子种皮抗性强，可加大灭菌剂浓度和延长灭菌时间，达到彻底灭菌目的；催芽小苗为幼龄材料，可不经童化期培养，剪取后可直接进入扩繁培养，达到快速建立苹果组培初代材料的培养目的。该方法获得的小苗，较大田树体采集组织木质化程度高、形态微型幼小，可极大提高培养成活率。同时简化了生产环节，降低了生产成本，加快了组培苗的生产进度，且该技术方法简单，易于操作，在组培苗初代材料的建立上具有较好的实用意义。

具体实施方式

实施例1

一种苹果组培初代材料的培养方法，包括砧木种子的冰箱低温沙藏处理、种子的灭菌、无菌催芽、小苗扩繁培养等环节，具体步骤如下：

a、砧木种子低温沙藏处理：将成熟饱满的、百粒重2.0g-3.5g的种子用常温水浸泡24h后用5倍于种子的湿河沙拌匀，河沙湿度以手握成团，一触即散为宜。然后装在带有透气孔的组培瓶内放在3℃的冰箱中冷藏处理 60d，沙藏期间需翻动2次检查，防止湿度过大或过小，观察到种子露白后从冰箱取出灭菌。

b、露白种子的灭菌：将低温处理后露白的种子在室温下放置24h，从沙子中清洗出种子，先将种子用流水冲洗25 min，用75%的酒精浸泡15s，再用0.1%的升汞浸泡15min，最后用无菌水冲洗4次，浸泡时进行摇动，使种子和灭菌剂紧密接触。

c、灭菌后种子的催芽：将灭菌后的种子，放置在铺有滤纸且经高压灭过菌的培养瓶内，在滤纸上滴入无菌水使其湿润，将培养瓶置于20℃的培养室催芽。

e、芽苗的转接：当种子萌芽，长到1.5-2.5cm，且具有3-4片真叶时，在超净工作台上，剪取根茎上部小苗，接入提前做好扩繁培养基中。其中该培养基为：MS+6-BA0.6～0.8mg/l+IBA0.1～0.2 mg/l,白砂糖10g、 琼脂粉5g。培养条件为：温度20℃，先暗培养5d,再光照培养；在此培养基中连续重复转接3次，在组培小苗扩繁到一定数量之后，进行热处理结合茎尖脱毒培养，筛选适宜培养基进行工厂化生产。

实施例2

一种苹果组培初代材料的培养方法，包括砧木种子的冰箱低温沙藏处理、种子的灭菌、无菌催芽、小苗扩繁培养等环节，具体步骤如下：

a、砧木种子低温沙藏处理：将成熟饱满的、百粒重0.5-2.0g的种子用常温水浸泡20h后用8倍于种子的湿河沙拌匀，河沙湿度以手握成团，一触即散为宜。然后装在带有透气孔的组培瓶内放在4℃冰箱中冷藏处理处理40d，沙藏期间需翻动5次检查，防止湿度过大或过小，观察到种子露白后从冰箱取出灭菌。

b、露白种子的灭菌：将低温处理后露白的种子在室温下放置24h，从沙子中清洗出种子，后用流水冲洗30 min，再用75%的酒精浸泡10s，用0.1%的升汞浸泡20min，最后用无菌水冲洗3次，浸泡时进行摇动，使种子和灭菌剂紧密接触。

c、灭菌后种子的催芽：将灭菌后的种子，放置在铺有滤纸且经高压灭过菌的培养瓶内，在滤纸上滴入无菌水使其湿润，将培养瓶置于22℃的培养室催芽。

e、芽苗的转接：当种子萌芽，长到1.5-2.5cm，且具有3-4片真叶时，在超净工作台上，剪取根茎上部小苗，接入提前做好扩繁培养基中。其中该培养基为：MS+6-BA0.6～0.8mg/l+IBA0.1～0.2 mg/l,白砂糖10g、 琼脂粉5g。培养条件为：温度22℃，先暗培养3d,再光照培养；在此培养基中连续重复转接2次，在组培小苗扩繁到一定数量之后，进行热处理结合茎尖脱毒培养，筛选适宜培养基进行工厂化生产。

实施例3

一种苹果组培初代材料的培养方法，包括砧木种子的冰箱低温沙藏处理、种子的灭菌、无菌催芽、小苗扩繁培养等环节，具体步骤如下：

a、砧木种子低温沙藏处理：将成熟饱满的、百粒重2.0g-3.5g的种子用常温水浸泡22h后用10倍于种子的湿河沙拌匀，河沙湿度以手握成团，一触即散为宜。然后装在带有透气孔的组培瓶内放在2℃冰箱中冷藏处理55d，沙藏期间需翻动3次检查，防止湿度过大或过小，观察到种子露白后从冰箱取出灭菌。

b、露白种子的灭菌：将低温处理后露白的种子，在室温下放置20h，从沙子中清洗出种子，后用流水冲洗20 min再用75%的酒精浸泡10s，用0.1%的升汞浸泡15min，最后用无菌水冲洗5次，浸泡时进行摇动，使种子和灭菌剂紧密接触。

c、灭菌后种子的催芽：将灭菌后的种子，放置在铺有滤纸且经高压灭过菌的培养瓶内，在滤纸上滴入无菌水使其湿润，将培养瓶置于24℃的培养室催芽。

e、芽苗的转接：当种子萌芽，长到1.5-2.5cm，且具有3-4片真叶时，在超净工作台上，剪取根茎上部小苗，接入提前做好扩繁培养基中。其中该培养基为：MS+6-BA0.6～0.8mg/l+IBA0.1～0.2 mg/l,白砂糖8g、 琼脂粉7g。培养条件为：温度24℃，先暗培养5d,再光照培养；在此培养基中连续重复转接3次，在组培小苗扩繁到一定数量之后，进行热处理结合茎尖脱毒培养，筛选适宜培养基进行工厂化生产。