鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途

技术领域

本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途。

背景技术

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是指外周血中仅具单个核的细胞，包含淋巴细胞和单核细胞两大类。条纹斑竹鲨是一种广泛分布于中国东南部海域的小型底栖鲨鱼，因其性情温顺，便于饲养，是近年来单域抗体(Single domainantibody)研究领域的重要实验动物。条纹斑竹鲨来源的单个核细胞是研究鲨鱼免疫响应过程及鲨源单域抗体的必要原材料。

在现有的技术体系中，使用以ficoll为主要分离液成分的密度梯度离心法是分离单个核细胞的重要手段，因其操作简单，商业化试剂成熟而被广泛应用于各种动物的研究当中。条纹斑竹鲨属于海洋软骨鱼类，与哺乳动物及常见硬骨鱼的单个核细胞密度都不同，使用常规市售的海水鱼外周血淋巴细胞分离液及人源外周血单个核细胞分离液(密度：1.077g/ml)并不能将条纹斑竹鲨的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开，可能原因是这些试剂盒中的分离液密度、缓冲体系与条纹斑竹鲨这一物种并不适配，并且市面上尚无专门针对条纹斑竹鲨的单个核细胞分离的试剂盒。目前，在分离出高纯度的条纹斑竹鲨单个核细胞的过程上面临着巨大的技术障碍。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有外周血单个核细胞分离技术无法实现条纹斑竹鲨的单个核细胞分离问题，提供一种适用于条纹斑竹鲨的单个核细胞分离的稀释液及方法，能够将条纹斑竹鲨的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开，并且分离得到的单个核细胞中活细胞比例较高。

本发明解决其技术问题采用的其中一种技术方案是：一种鲨鱼稀释液，该鲨鱼稀释液包括PBS缓冲液及尿素，其密度为1.0028g/mL-1.0235g/mL。

进一步优选地，所述鲨鱼稀释液通过以下方法制备：

取100mL 10×PBS缓冲液、尿素、NaCl，加入超纯水定容至1L，使尿素终浓度为100mM-300mM，NaCl终浓度为50mM。

本发明进一步提供一种鲨鱼稀释液的用途，该鲨鱼稀释液用于分离鲨鱼的单个核细胞，或者用于制备鲨鱼单个核细胞分离液或试剂盒。

本发明进一步提供一种鲨鱼单个核细胞分离液，该分离液是采用所述的鲨鱼稀释液稀释人源外周血单个核细胞分离液试剂而得到；人源外周血单个核细胞分离液试剂与鲨鱼稀释液体积比在58∶42-70∶30之间。

本发明进一步提供一种鲨鱼单个核细胞分离试剂盒，该试剂盒包括所述的鲨鱼稀释液；或者所述的鲨鱼单个核细胞分离液。

本发明进一步提供一种条纹斑竹鲨单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)获取新鲜的、抗凝处理的条纹斑竹鲨外周血或经预处理的新鲜组织，低温离心后，取血细胞或组织细胞使用所述的鲨鱼稀释液进行充分稀释，制备细胞悬液，并恢复至室温；

(2)使用所述的鲨鱼稀释液稀释常规市售的人源外周血单个核细胞分离液试剂，获得条纹斑竹鲨单个核细胞分离液；

(3)在离心管中添加不少于3mL步骤(2)得到的条纹斑竹鲨单个核细胞分离液，并在上方缓慢添加步骤(1)获得的细胞悬液；

(4)室温，1000×g下离心30min；弃去上层稀释液层，收取中间的白膜层至另一离心管中；白膜层即为分离出的单个核细胞；

(5)使用所述的鲨鱼稀释液对分离出来的单个核细胞进行清洗，于300×g，离心10min收集细胞沉淀；

(6)重复上述的清洗步骤；

(7)重悬沉淀细胞即获得分离后的鲨鱼单个核细胞悬液。

进一步优选地，所述步骤(1)中的细胞悬液稀释倍数在2-3倍。

进一步优选地，所述步骤(2)中，人源外周血单个核细胞分离液试剂与鲨鱼稀释液的体积比在58∶42-70∶30之间。

进一步优选地，所述步骤(2)中得到的鲨鱼单个核细胞分离液的密度为1.049g/mL-1.058g/mL。

现有技术相比，本发明具有的有益效果是：本发明基于现有的密度梯度离心技术，提供一种适用于鲨鱼单个核细胞分离的鲨鱼稀释液，并且调整了鲨鱼稀释液中尿素浓度，无需完全模仿鲨鱼血液缓冲组分，即可克服分离该物种单个核细胞过程中，由于细胞密度、渗透压变化、缓冲条件不适等导致的细胞死亡或分离效果不佳的问题。本发明建立了一种从鲨鱼外周血或组织中分离单个核细胞的方法，不仅能够有效地降低红细胞或粒细胞的污染，使获得的单个核细胞具有较高的活性和纯度。同时本发明提供的鲨鱼稀释液及试剂盒填补了市面上相关产品的空白。

附图说明

图1为使用海水鱼外周血单个核细胞分离液对条纹斑竹鲨外周血处理后的单个核细胞分离效果示意图；(A)为操作步骤及每一层成分示意图；(B)为实际分离效果示意图；

图2为通过调整海水鱼外周血单个核细胞分离试剂盒提到的可调离心参数后的分离情况；(A)调整离心力；(B)调整离心时间；

图3为使用本发明的方法对条纹斑竹鲨外周血处理后的单个核细胞分离效果示意图；

图4为使用本发明的方法对条纹斑竹鲨外周血(A)及脾脏组织(B)处理后的单个核细胞分离效果实际情况；

图5为使用显微镜观察本发明鲨鱼稀释液中做不同尿素浓度调整时经台盼蓝染色后的血细胞情况；(A)尿素终浓度0Mm；(B)尿素终浓度200mM；(C)：尿素终浓度1M。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

条纹斑竹鲨属于海洋软骨鱼类，是近年来单域抗体研究领域的重要实验动物。条纹斑竹鲨来源的单个核细胞是研究鲨鱼免疫响应过程及鲨源单域抗体方面不可缺少的原材料。

由于市面上尚无专门针对条纹斑竹鲨的单个核细胞分离的试剂盒，所以本发明的发明人首先尝试使用了市售的海水鱼外周血单个核细胞分离液，按照说明书中的操作步骤如图1中(A)所示，却发现该分离液并不能将条纹斑竹鲨的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开，如图1中(B)所示。在按照商品说明书进行处理鲨鱼的外周血后，所有的血细胞都处于分离液的上层，红细胞和粒细胞层紧贴着单个核细胞层，此时的分离液完全没起到分离出单个核细胞的作用。

此后，根据上述商品说明书中的说明“离心力和离心时间需要根据分离体积自行摸索”，本发明的发明人又尝试通过调整试剂盒说明书中涉及到的所有参数，如离心转速、离心时间、离心温度、血液稀释倍数、pH值、液体体积比例，但仍然难以分离出单个核细胞层。具体实验结果参见图2中(A)和(B)：离心转速使用1800×g离心，已超过说明书所限制的1200×g；离心时间使用超过说明书建议的时间，但是在相应的位置并不能得到可见的、完整的单个核细胞层。因此，发明人推断，可能是由于物种之间的差异，该市售的海水鱼外周血单个核细胞分离液不适用于条纹斑竹鲨外周血单个核细胞分离。

由于针对海水鱼的单个核细胞分离液配方尚属商业机密，故无法直接从试剂厂商处直接获得有利于鲨鱼单个核细胞分离的信息。另外，本发明人还尝试过使用人源外周血单个核细胞分离液试剂(1.077g/ml)，分离效果也不尽人意。

由于人源单个核细胞分离液在使用上更为经济，且明确知道密度参数。故以下实施例将基于密度为1.077g/mL的人源单个核细胞分离液，针对条纹斑竹鲨这一特定的物种进行改进与优化。

除非特别说明，本发明实施例中涉及的试剂均为市售的常规试剂。

实施例1条纹斑竹鲨外周血细胞分离前的稀释与处理

为获得良好的分离效果，血液在采集后需要按照下列步骤进行适当的抗凝和稀释处理，以保证血细胞均处于单一的分散状态。

(1)配制10×PBS溶液(1L)：80g NaCl，2g KCl，14.4g Na

(2)配制鲨鱼稀释液(1L)：100mL 10×PBS(PH 7.4)，100mL 2M尿素，50mL 1MNaCl，加入超纯水定容至1L。测量该稀释液的密度，应在1.0200g/ml。

(3)获取新鲜的条纹斑竹鲨血液，加入抗凝剂枸橼酸钠溶液(4％)防止血液凝固，抗凝剂与血液的体积比在1∶9-2∶8之间。(由于血液凝固的速度受到环境温度的影响，温度较高的时候应在合理范围内使用更高比例的抗凝剂。)

(4)若需用血浆进行其他的生物化学分析及检测，则将新鲜的血液置于4℃，300×g离心10min后，血浆和血细胞形成明显分层，吸取血浆层作他用。往剩余的血细胞中加入其2倍体积的鲨鱼稀释液，充分重悬血细胞，使之不再粘稠。

(5)静置稀释后的血细胞悬液至恢复室温。

实施例2条纹斑竹鲨单个核细胞分离液最佳密度的探索

为确定适用于条纹斑竹鲨的单个核细胞分离液最佳密度，首先使用鲨鱼稀释液对人类外周血单个核细胞分离液进行跨度较大的梯度稀释，制备条纹斑竹鲨单个核细胞分离液，在找到合适的范围区间之后再重新进行跨度较小梯度稀释，观察在哪个稀释比例范围内的条纹斑竹鲨单个核细胞分离液的分离效果最好。

(1)取市售的人源外周血单个核细胞分离液试剂(1.077g/mL)使用鲨鱼稀释液进行较大跨度的梯度稀释，制备成不同稀释比例的条纹斑竹鲨单个核细胞分离液，共设置8组，每组后的标注为每一组中人类外周血单个核细胞分离液与鲨鱼稀释液的体积比：A1(90∶10)、A2(80∶20)、A3(70∶30)、A4(60∶40)、A5(50∶50)、A6(40∶60)、A7(30∶70)、A8(20∶80)。

(2)取3mL上述步骤得到的各组条纹斑竹鲨单个核细胞分离液于15mL离心管，在上方用巴氏吸管缓慢铺上1mL稀释后的血细胞悬液，于24℃、1000×g离心30min。

(3)取出离心管观察每组的血细胞分离效果，其中A2组的白膜层中红细胞污染严重，表明A2组中的分离液密度可能偏大；而A5组中的红细胞污染很少，但白膜层不明显，表明A5组中的分离液密度可能偏小，在离心的过程当中可能损失很多目标细胞。故选择A2-A5组之间的稀释比例进行以下步骤。

(4)取市售的人源外周血单个核细胞分离液试剂(1.077g/mL)使用鲨鱼稀释液进行较小跨度的梯度稀释，制备条纹斑竹鲨单个核细胞分离液。一共设置6组，每组后的标注为每组中人类外周血单个核细胞分离液与鲨鱼稀释液的体积比：B1(54∶46)、B2(58∶42)、B3(62∶38)、B4(66∶34)、B5(70∶30)、B6(74∶26)。

(5)取3mL的上述制备的各组条纹斑竹鲨单个核细胞分离液于15mL离心管，在上方用巴氏吸管小心铺上1mL稀释后的血细胞悬液，于24℃、1000×g离心30min。

(6)取出离心管观察每组的血细胞分离效果，其中B2-B5组的白膜层分离效果较佳，B2组的白膜层有所损失，但是红细胞的污染最少，在需要极高的单个核细胞纯度的时候可以选择此组的稀释比例；B5组分离效果较好，虽有少许红细胞污染，但是能最大程度保留单个核细胞的数量，可以根据实验目的的需要选择最合适的在需要最大单个核细胞量的时候可以选择此组的稀释比例。B3、B4组的分离效果则介于这两组之间，其血细胞的分层情况如图3、图4中(A)所示。可以根据不同的实验目的选择上述不同的稀释比例。

(7)经测量，B2-B5组的密度为1.049g/mL-1.058g/mL。故认为，较佳的人类外周血单个核细胞分离液试剂和鲨鱼液稀释的体积比在58∶42-70∶30之间，对应的，较佳的稀释后的分离液密度为1.049g/mI-1.058g/mL。

实施例3分离后单个核细胞层中细胞活性及纯度的检测

为确定实施例2中步骤6分离出的白膜层中单个核细胞的纯度和活细胞比例，使用光学显微镜及血球计数板进行观察与统计，其中活细胞数目使用台盼蓝拒染法进行确定。

(1)吸取实施例2中步骤6B3组的白膜层，稀释20倍之后，往其中加入0.4％台盼蓝染液，使台盼蓝终浓度为0.04％，进行染色3min。

(2)吸取染色后的细胞于血球计数板上，置于光学显微镜下观察，统计每个计数池中的单个核细胞数、总活细胞数及总细胞数，并计算平均值。统计数据如表1所示。

(3)按公式：

(4)经计算，单个核细胞数目约占总细胞数目的97％。活细胞数约占总细胞数目的92.5％。综上认为，本发明的方法可以分离出高活力、高纯度的条纹斑竹鲨单个核细胞层。

表1采用本发明方法分离出的白膜层中单个核细胞的纯度和及活力

实施例4验证本发明提供的鲨鱼稀释液中尿素含量的合理范围及对细胞活性的影响

尿素作为一种生化研究中常见的蛋白变性剂，一般不会加入到细胞分离体系当中，因其分子量小可以通过自由扩散透过细胞膜进入细胞，干扰细胞的生理活动，可能会造成细胞的代谢紊乱和死亡。在多数动物体内，尿素也常作为蛋白质类物质的代谢废物随尿液排出体外。

为探究鲨鱼稀释液中尿素的合理含量及对此分离体系的影响，使用不同的尿素浓度梯度配置鲨鱼稀释液并进行分离，并使用台盼蓝拒染法判断分离后血细胞的成活率。

(1)配置不同尿素浓度的鲨鱼稀释液，使其终浓度分别为：0mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、1M。并分别用这些稀释液配置相应的条纹斑竹鲨单个核细胞分离液。将分离出的白膜层按照实施例3的操作，在显微镜下观察每一组的细胞状态，并计算每一组的活细胞数及总细胞的平均值。

(2)不同尿素终浓度下的总细胞数、活细胞数及活细胞比例如表2所示。

表2鲨鱼稀释液中不同尿素终浓度下的总细胞数、活细胞数及活细胞比例

由表2可知，在尿素浓度为0mM实验组当中，活细胞比例有一定程度的下降，且在显微镜下观察，部分细胞出现吸水涨破的情况，如图5中(A)，箭头所示细胞出现的吸水破裂现象。尿素终浓度在100mM-200mM范围内，活细胞比例维持在较高的水平，基本在93％以上，在显微镜下观察细胞呈现较为完整的状态，如图5中(B)，细胞较为完整且未被台盼蓝染上蓝色。细胞活性在300mM尿素浓度附近时尚可，活细胞比例仍然保持在90％以上。大于300mM尿素浓度时，细胞活性及活细胞比例出现下降的趋势。尿素终浓度在400mM、500mM、1M的实验组中，活细胞比例急剧下降，且在显微镜下观察细胞呈现皱缩甚至出现破碎现象，如图5中(C)，箭头所示细胞出现皱缩甚至破碎的现象。因为400mM、500mM及1M的尿素实验组中的渗透压超过了细胞所能承受的正常水平，导致活细胞比例降低。

据文献报道(Anderson WG，Taylor JR，Good JP，Hazon N，Grosell M.Body fluidvolume regulation in elasmobranch fish.Comp Biochem Physiol A Mol IntegrPhysiol.2007Sep；148(1)：3-13.doi：10.1016/j.cbpa.2006.07.018.Epub 2006Aug4.PMID：17020815.)，条纹斑竹鲨血浆中的尿素浓度约在330mM，但在实际实验中却发现尿素浓度在300mM附近时不如更低浓度下的单个核细胞成活率高。

发明人猜测一种可能原因是，鲨鱼体内除了存在尿素，还存在另一重要的物质，即氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide，TMAO)。TMAO在软骨鱼体内具有独特的生理功能。有研究表明，与常见的甜菜碱、甘氨酸这类蛋白质结构稳定剂不同，TMAO可以降低水-空气界面的表面张力，帮助肽链的折叠，稳定其正确的构象以正常发挥生理功能(Liao YT，MansonAC，DeLyser MR，Noid WG，Cremer PS.Trimethylamine N-oxide stabilizes proteinsvia a distinct mechanism compared with betaine and glycine.Proc Natl Acad SciU S A.2017Mar7：114(10)：2479-2484.doi：10.1073/pnas.1614609114.Epub 2017Feb22.PMID：28228526；PMCID：PMC5347566.)，鲨鱼体内存在的TMAO几乎可以完全抵消尿素对蛋白质结构的不利影响(Gluick TC，Yadav S.Trimethylamine N-oxide stabilizes RNAtertiary structure and attenuates the denaturating effects of urea.J Am ChemSoc.2003Apr 16；125(15)：4418-9.doi：10.1021/ja0292997.PMID：12683801.)。鲨鱼血浆是一个成分复杂的体系，在体外配置的溶液很难完全模拟体内的血浆环境，在没有TMAO的情况下，与血浆同浓度的尿素体系完全可能对细胞产生不利的影响，造成细胞的活性下降。

但发明人认为可以不必引入氧化三甲胺到该分离体系当中，因为增加该成分，一方面增大了该体系的复杂程度，并增加了一定的成本；另一方面，目前尚未见到文献报道条纹斑竹鲨体内氧化三甲胺及尿素的比例范围。另外，根据研究的目的，如果分离出单个核细胞只是为了提取RNA，那么上述的分离体系完全可以满足实验需求，保持短期内的细胞活性；如果分离出单个核细胞是为了培养较长时间以便进行其他的细胞实验，那么完全可以在上述体系中分离出来后再放入鲨鱼的血清当中培养，以便保持长时间的活性。

故本发明不完全模仿配制鲨鱼血液缓冲组分，而将鲨鱼稀释液中的尿素浓度范围确定在100mM-300mM。较低的尿素浓度不仅可以模拟鲨鱼体内的环境提供缓冲能力，还可以减轻对细胞的毒害作用，更加简化了分离体系、降低分离的成本。

需要说明的是，本发明的方法也同样适用于条纹斑竹鲨组织中单个核细胞的分离，脾脏等免疫组织当中的单个核细胞分离过程中，需将脾脏或其他免疫器官摘取出来，经过预处理后，采用本发明提供的鲨鱼稀释液制备成单细胞悬液，之后的分离步骤与血细胞分离过程是一样的。

综上所述，本发明提供的鲨鱼稀释液、及条纹斑竹鲨单个核细胞分离方法，无论在分离效果还是活细胞比例方面，相对于现有的分离液及方法均有极其显著的提高；同时几乎不增加额外的成本，这使得本发明的技术更利于市场推广。