一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，尤其涉及一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用。

背景技术

我国是世界第一苹果生产国，苹果产业是推进乡村振兴的重要支柱产业。然而，由真菌苹果黑腐皮壳(Valsa mali)引起的苹果树腐烂病却一直威胁着该产业的健康发展。腐烂病是苹果最具毁灭性的枝干病害，常造成枝枯树死，严重时甚至毁园，带来巨大的经济损失。目前，对于苹果树腐烂病的防治主要还依赖化学药剂，由于化学杀菌剂特别是内吸性杀菌剂长期而广泛的使用，导致病原菌抗药性问题日益突出。亟需通过综合防治尤其是与生物防治相结合，来克服其抗药性的问题，从而对苹果树腐烂病进行有效控制。但是，目前生物防治真菌资源多数尚处于研究与开发的初始阶段，远远满足不了生产上的实际要求。加之果品农药残留、生态环境污染等问题，不利于绿色食品的健康发展。因此大力开发生防微生物资源产品已势在必行。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)由于化学杀菌剂特别是内吸性杀菌剂长期而广泛的使用，导致苹果树腐烂病菌抗药性增强、生态环境污染和农药残留等问题严重制约着绿色食品的健康发展。

(2)目前生物防治真菌资源多数尚处于研究与开发的初始阶段，尤其缺乏特异性强、防治效果好的生防产品，远远满足不了生产上苹果树腐烂病防治的实际要求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用。

本发明是这样实现的，一株内生球毛壳菌MG2，所述内生球毛壳菌MG2已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.40070。

进一步，所述内生球毛壳菌MG2是从健康木瓜海棠(Chaenomeles cathayensisSchneid) 树皮中分离得到，经过鉴定确定为球毛壳菌，置于4℃小斜面保存。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的内生球毛壳菌MG2的内生球毛壳菌MG2的鉴定方法，所述内生球毛壳菌MG2的鉴定方法包括以下步骤：

步骤一，形态学观察：进行重新活化培养后的拮抗菌株MG2特征的观察；

步骤二，分子生物学鉴定：PCR扩增后构建多基因系统发育进化树。

进一步，所述步骤一中的形态学观察包括：

将平板对峙筛选得到的拮抗菌株MG2重新活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养7d，观察生长速度、菌落颜色、形状以及闭囊壳形态特征。

其中，所述PDA培养基的制备方法为：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖和15g琼脂搅拌均匀后双蒸水定容至1L，封口121℃高压灭菌20min待用。

进一步，所述步骤二中的分子生物学鉴定包括：

将拮抗菌株MG2活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养4d后转接到铺有玻璃纸的PDA培养基中，待菌落近似长满皿后，刮取菌丝提取菌株DNA，扩增ITS、LSU和 EF-1α片段，将剩余PCR扩增产物进行测序；将测序结果序列与NCBI数据库中相关菌株进行BLAST比对分析，分别获得与拮抗菌株序列同源性高的相关菌株的ITS、LSU和EF-1α序列；依次载入PhyloSuite软件中串联，在MEGA软件中基于邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建多基因系统发育进化树。

进一步，所述菌株活化及平板对峙试验包括：

菌株活化：在超净工作台中于4℃小斜面试管中挑少量菌丝，接种于PDA培养基上，25℃培养2～3d，完成活化。

平板对峙：采用两点对峙法明确球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的拮抗作用。在PDA平板中央放置直径为5mm已活化的腐烂病菌菌饼，在距离病原菌菌饼左右各2.5cm处放置内生球毛壳菌菌饼，以单独放置病原菌菌饼的处理为对照。由于球毛壳菌生长速度比腐烂病菌慢，设置处理为优先接种球毛壳菌2d，1d，0d，分别标记为处理A、B、C，每个处理3个重复； 25℃黑暗培养，待对照近乎长满皿后，测量对照组菌落直径和处理组病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径，按如下公式计算抑菌率：

抑菌率＝[(对照菌落直径-病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径)/对照菌落直径]× 100％。

本发明的另一目的在于提供一种所述的内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定所述内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法，所述鉴定内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法包括：

(1)鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；

(2)球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测；

(3)确定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用；

(4)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；

(5)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响。

进一步，所述步骤(1)中的鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响包括：

扫描电镜样品的制备：进行平板对峙培养2～3天后，用解剖刀切取正常生长的V.mali菌丝边缘为处理A，切取球毛壳菌拮抗后的V.mali菌丝边缘为处理B，放在4％(v/v)戊二醛磷酸缓冲液4℃下固定20h；用pH 6.8的PBS的缓冲液冲洗4次，每次间隔20min；样品经系列乙醇脱水、乙酸异戊酯置换、CO

所述步骤(2)中的球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测包括：

枝条处理：采集1～2年生富士苹果枝条，剪成10cm长短，挑选粗细长势一致的枝条，经清水冲洗干净，0.6％次氯酸钠溶液消毒15～20min后，无菌水再清洗3～4次直至无异味，晾干，用融化的石蜡封住枝条两端，静置晾干。

离体枝条试验：将处理好的枝条打孔，孔径5mm，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C，保鲜膜上喷水后密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果树腐烂病的发生情况，每个处理9根枝条，每个枝条一个接种点，试验重复3次。

叶片处理：采集健康富士苹果叶片，挑选大小近似一致的叶片，具体清洗步骤同上述枝条处理方法一致；室温自然摆放叶片，用灭菌后的棉花蘸取少量灭菌水将叶柄包裹保湿，静置备用。

离体叶片试验：将处理好的叶片以中间主叶脉为界限，用1mL注射器针头在叶片左右两侧中心位置各扎四个孔，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C；保鲜膜上喷水密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果叶片发病情况，每次9片叶片，试验重复3次。

进一步，所述步骤(3)中的鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用包括：

内生球毛壳菌发酵液制备：无菌条件下用打孔器打取已培养5d的直径5mm的内生球毛壳菌菌饼，放入分装成400mLPDB培养液的1L三角瓶中，每瓶放10个菌饼，25℃、120r·min

发酵液对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用：将收集的球毛壳菌发酵液和融化的PDA分别混合，配成发酵液含量分别为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的培养基平板，凝固后在平板中央接种一个培养2～3d的直径5mm的苹果树腐烂病菌菌饼，以不含内生球毛壳菌发酵液的处理为对照，每处理6次重复，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量，计算菌丝抑制率。

所述步骤(4)中的鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响包括：

扫描电镜样品的制备：配置发酵液含量为1.0％的培养基平板，接种苹果树腐烂病菌菌饼，以不含内生球毛壳菌发酵液的处理为对照，培养3天后，用解剖刀切取正常生长的腐烂病菌菌丝边缘、含发酵液1.0％的培养基平板上的腐烂病菌菌丝边缘，进行样品制备、观察、拍照。

所述步骤(5)中的鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响包括：

病原菌分生孢子悬浮液制备：将生长3d的苹果树腐烂病菌打取直径为5mm的菌饼倒置接种于空白PDA培养基上，置于25℃黑暗培养至长满整个培养皿后，将培养皿摊开于常温放置培养；当培养皿内长出黄色的分生孢子角时，在无菌操作台内，用酒精灯烧过的接种针挑取皿内的分生孢子角悬浮于20mL灭菌水中，充分混匀后，用显微镜观察孢子浓度，配制成1×10

分别配置发酵液含量为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的培养基平板，滴入20μL配制好的V.mali分生孢子悬浮液，用灭菌涂布器轻轻涂抹均匀，以不含内生球毛壳菌发酵液的培养基处理为对照，每个处理3次重复，试验重复3次；于25℃黑暗培养24h后，在普通光学显微镜下统计分生孢子的萌发情况，萌发标准为芽管的长度超过分生孢子直径的1/2，每个玻片观察10个视野，计算出分生孢子萌发率和萌发抑制率。

分生孢子萌发率＝已萌发的孢子数/孢子总数×100％；

分生孢子萌发抑制率＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100％。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

由实验结果可知，本发明的球毛壳菌对苹果树腐烂病菌有显著的拮抗抑制作用，优先接种球毛壳菌2天，其对苹果树腐烂病菌生长的抑制率高达98.65％；优先接种球毛壳菌1天，抑制率为98.65％；同时接种，抑制率为82.21％。

内生球毛壳菌对小麦赤霉病病原菌(F.graminearum)、辣椒疫病病原菌(P.capsici)、苹果轮纹病病原菌(B.dothidea)、苹果炭疽病病原菌(C.gloeosporioides)和苹果炭疽叶枯病病原菌(C.fructicola)无明显拮抗抑制作用；但该球毛壳菌对Valsa属植物病原真菌V.pyri、 V.malicola、V.salicina、V.leucostoma有专一性的抑制作用，抑制率分别为80.22％、76.57％、 76.91％、79.97％。

经PDA培养基正常培养的苹果树腐烂病菌菌丝呈细长状态，粗细较均匀，菌丝表面光滑，菌丝顶端较尖细。内生球毛壳菌拮抗之后，苹果树腐烂病菌菌丝生长杂乱不规则，菌丝明显增粗，分支变多且菌丝顶端变钝圆。球毛壳菌拮抗后的苹果树腐烂病菌菌丝明显增粗，说明腐烂病菌菌丝的生长受到严重抑制。将球毛壳菌MG2分别接种在健康的苹果叶片和枝条上，培养5d后，苹果树叶片和枝条均不发病，说明其对苹果不具有致病作用，为其后期应用到田间生产中奠定基础。

球毛壳菌MG2发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显抑制作用，并且随着滤液含量的增多，抑制效果越强。在试验设置的5个发酵液含量梯度中，培养基中内生球毛壳菌发酵液含量为10.0％时，对苹果树腐烂病菌菌丝生长抑制效果最好，抑制率达到99.68％；含量为 5.0％时，对苹果树腐烂病菌菌丝生长抑制效果次之，抑制率达到96.53％；含量为2.0％、1.0％、 0.5％时也有较好的抑制效果，抑制率分别为91.76％、84.83％、78.91％。

经PDA培养基正常培养的苹果树腐烂病菌菌丝呈细长状态，粗细较均匀，菌丝表面光滑，菌丝顶端较尖细。在球毛壳菌发酵液含量为1.0％的培养基培养3天后，苹果树腐烂病菌菌丝生长杂乱不规则，菌丝明显增粗，分支变多且菌丝顶端膨大钝圆，说明发酵液对腐烂病菌菌丝的生长有明显的抑制作用。

在空白PDA培养基上，苹果树腐烂病菌的分生孢子可以正常吸涨、萌发并伸出细长芽管；在试验中，当培养基中发酵液含量为5％和10.0％时，对分生孢子萌发的抑制率达到95.00％以上；含量为2.0％、1.0％、0.5％时，抑制率分别为77.21％、55.44％、39.37％。同时观察到，在球毛壳菌发酵液含量为5.0％、10.0％的培养基上，大量的分生孢子不能正常萌发，出现畸形、不规则膨大、原生质外渗等现象，说明球毛壳菌发酵液可以抑制腐烂病菌的孢子萌发。

内生球毛壳菌发酵液经37℃、55℃、80℃、100℃处理30min后抑菌活性不受影响，对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率均在89.00％以上；但是121℃处理30min后，抑菌活性明显下降，抑制率为49.23％；这表明在日常温度条件下，发酵液具有良好的热稳定性。

内生球毛壳菌发酵液经30min、60min、90min、120min及180min紫外辐射后抑菌活性不受明显影响，对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率均在86.00％以上，说明其在接收了紫外照射3h后仍能保持良好的抑菌活性。球毛壳菌发酵液具有良好的热稳定性和紫外线稳定性，为之后在日常田间的稳定应用奠定基础。

球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条均有一定的保护和治疗效果，但其保护作用优于治疗作用，为后期生产球毛壳菌预防保护制剂奠定基础。球毛壳菌发酵液对烟草具有明显的促生作用，浇灌内生球毛壳菌发酵液后，烟草的地上部分生长旺盛，植株鲜重比对照组提高了 40.54％。表明内生球毛壳菌发酵液具有一定的促生作用，能够促进植物生长。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

实验结果表明，本发明提供的内生球毛壳菌MG2对苹果树腐烂病菌具有抑制作用、对苹果树腐烂病菌菌丝形态存在影响，球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌具有抑制作用、对苹果树腐烂病菌菌丝形态存在影响，球毛壳菌发酵液能够影响苹果树腐烂病菌孢子萌发，球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条具有防效作用，球毛壳菌发酵液对烟草具有促生作用。

第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

本发明的生防真菌属于植物内生真菌，对人畜无毒害作用，无污染、无公害、无残留，无论是对苹果树还是对人体、生态环境都相对安全。而且对苹果树腐烂病菌特异性强，可运用于苹果树腐烂病的精准高效防控，有助于降低病原菌抗药性风险，减少化学农药使用量，保障苹果产业绿色健康可持续发展。

(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：

本发明解决了苹果树腐烂病的精准高效生物防治难题，本发明的球毛壳菌MG2能够特异性抑制苹果树腐烂病菌的生长，抑菌效果能达到80％以上。并且，该菌对于黑腐皮壳属(Valsa) 病原菌具有专一性抑制作用，对于由黑腐皮壳属(Valsa)病原菌梨树腐烂病菌，柳树腐烂病菌，核桃树腐烂病菌的室内抑制效果在70％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的球毛壳菌系统发育分析与菌落、闭囊壳形态观察结果示意图；

图2是本发明实施例提供的球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的抑制效果示意图；

图3是本发明实施例提供的球毛壳菌对其他五株病原菌无抑制效果示意图；

图4是本发明实施例提供的球毛壳菌对Valsa属病原菌的抑制效果示意图；

图5是本发明实施例提供的球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响示意图；

图6是本发明实施例提供的球毛壳菌对苹果离体叶片枝条的致病性示意图；

图7是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用示意图；

图8是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态影响示意图；

图9是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液对孢子萌发的抑制率示意图；

图10是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液对孢子萌发的影响示意图；

图11是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液热稳定性示意图；

图12是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液紫外线稳定性示意图；

图13是本发明实施例提供的球毛壳菌及其发酵液对苹果树腐烂病的保护效果示意图；

图14是本发明实施例提供的球毛壳菌及其发酵液对苹果树腐烂病治疗效果示意图；

图15是本发明实施例提供的球毛壳菌发酵液对烟草的促生效果示意图；

图16是本发明实施例提供的内生球毛壳菌MG2的鉴定方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株内生球毛壳菌MG2及其在防治苹果树腐烂病的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

本发明实施例提供的内生球毛壳菌MG2已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.40070。

本发明实施例提供的内生球毛壳菌MG2是从健康木瓜海棠树皮中分离得到，经过鉴定确定为球毛壳菌，置于4℃小斜面保存。

如图16所示，本发明实施例提供的内生球毛壳菌MG2的鉴定方法包括：

S101，形态学观察：进行重新活化培养后的拮抗菌株MG2特征的观察；

S102，分子生物学鉴定：PCR扩增后构建多基因系统发育进化树。

本发明实施例提供的步骤S101中的形态学观察包括：

将平板对峙筛选得到的拮抗菌株MG2重新活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养7d，观察生长速度、菌落颜色、形状以及闭囊壳形态特征。

其中，所述PDA培养基的制备方法为：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖和15g琼脂搅拌均匀后双蒸水定容至1L，封口121℃高压灭菌20min待用。

本发明实施例提供的步骤S102中的分子生物学鉴定包括：

将拮抗菌株MG2活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养4d后转接到铺有玻璃纸的PDA培养基中，待菌落近似长满皿后，刮取菌丝提取菌株DNA，扩增ITS、LSU和 EF-1α片段，将剩余PCR扩增产物进行测序；将测序结果序列与NCBI数据库中相关菌株进行BLAST比对分析，分别获得与拮抗菌株序列同源性高的相关菌株的ITS、LSU和EF-1α序列；依次载入PhyloSuite软件中串联，在MEGA软件中基于邻接法构建多基因系统发育进化树。

本发明实施例提供的菌株活化及平板对峙试验包括：

菌株活化：在超净工作台中于4℃小斜面试管中挑少量菌丝，接种于PDA培养基上，25℃培养2～3d，完成活化。

平板对峙：采用两点对峙法明确球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的拮抗作用。在PDA平板中央放置直径为5mm已活化的腐烂病菌菌饼，在距离病原菌菌饼左右各2.5cm处放置内生球毛壳菌菌饼，以单独放置病原菌菌饼的处理为对照。由于球毛壳菌生长速度比腐烂病菌慢，设置处理为优先接种球毛壳菌2d，1d，0d，分别标记为处理A、B、C，每个处理3个重复； 25℃黑暗培养，待对照近乎长满皿后，测量对照组菌落直径和处理组病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径，按如下公式计算抑菌率：

抑菌率＝[(对照菌落直径-病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径)/对照菌落直径]×100％。

本发明实施例提供的鉴定内生球毛壳菌MG2在制备苹果树腐烂病防治用药物中应用的方法包括：

(1)鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；

(2)球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测；

(3)确定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用；

(4)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响；

(5)鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响。

本发明实施例提供的步骤(1)中的鉴定球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响包括：

扫描电镜样品的制备：进行平板对峙培养2～3天后，用解剖刀切取正常生长的V.mali菌丝边缘为处理A，切取球毛壳菌拮抗后的V.mali菌丝边缘为处理B，放在4％(v/v)戊二醛磷酸缓冲液4℃下固定20h；用pH 6.8的PBS的缓冲液冲洗4次，每次间隔20min；样品经系列乙醇脱水、乙酸异戊酯置换、CO

本发明实施例提供的步骤(2)中的球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测包括：

枝条处理：采集1～2年生富士苹果枝条，剪成10cm长短，挑选粗细长势一致的枝条，经清水冲洗干净，0.6％次氯酸钠溶液消毒15～20min后，无菌水再清洗3～4次直至无异味，晾干，用融化的石蜡封住枝条两端，静置晾干。

离体枝条试验：将处理好的枝条打孔，孔径5mm，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C，保鲜膜上喷水后密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果树腐烂病的发生情况，每个处理9根枝条，每个枝条一个接种点，试验重复3次。

叶片处理：采集健康富士苹果叶片，挑选大小近似一致的叶片，具体清洗步骤同上述枝条处理方法一致；室温自然摆放叶片，用灭菌后的棉花蘸取少量灭菌水将叶柄包裹保湿，静置备用。

离体叶片试验：将处理好的叶片以中间主叶脉为界限，用1mL注射器针头在叶片左右两侧中心位置各扎四个孔，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C；保鲜膜上喷水密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果叶片发病情况，每次9片叶片，试验重复3次。

本发明实施例提供的步骤(3)中的鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用包括：

内生球毛壳菌发酵液制备：无菌条件下用打孔器打取已培养5d的直径5mm的内生球毛壳菌菌饼，放入分装成400mLPDB培养液的1L三角瓶中，每瓶放10个菌饼，25℃、120r·min

发酵液对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用：将收集的球毛壳菌发酵液和融化的PDA分别混合，配成发酵液含量分别为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的培养基平板，凝固后在平板中央接种一个培养2～3d的直径5mm的苹果树腐烂病菌菌饼，以不含内生球毛壳菌发酵液的处理为对照，每处理6次重复，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量，计算菌丝抑制率。

本发明实施例提供的步骤(4)中的鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响包括：

扫描电镜样品的制备：配置发酵液含量为1.0％的培养基平板，接种苹果树腐烂病菌菌饼，以不含内生球毛壳菌发酵液的处理为对照，培养3天后，用解剖刀切取正常生长的腐烂病菌菌丝边缘、含发酵液1.0％的培养基平板上的腐烂病菌菌丝边缘，进行样品制备、观察、拍照。

本发明实施例提供的步骤(5)中的鉴定球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响包括：

病原菌分生孢子悬浮液制备：将生长3d的苹果树腐烂病菌打取直径为5mm的菌饼倒置接种于空白PDA培养基上，置于25℃黑暗培养至长满整个培养皿后，将培养皿摊开于常温放置培养；当培养皿内长出黄色的分生孢子角时，在无菌操作台内，用酒精灯烧过的接种针挑取皿内的分生孢子角悬浮于20mL灭菌水中，充分混匀后，用显微镜观察孢子浓度，配制成1×10

分别配置发酵液含量为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的培养基平板，滴入20μL配制好的V.mali分生孢子悬浮液，用灭菌涂布器轻轻涂抹均匀，以不含内生球毛壳菌发酵液的培养基处理为对照，每个处理3次重复，试验重复3次；于25℃黑暗培养24h后，在普通光学显微镜下统计分生孢子的萌发情况，萌发标准为芽管的长度超过分生孢子直径的1/2，每个玻片观察10个视野，计算出分生孢子萌发率和萌发抑制率。

分生孢子萌发率＝已萌发的孢子数/孢子总数×100％；

分生孢子萌发抑制率＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100％。

二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

室内研究表明，内生球毛壳菌MG2对苹果树腐烂病具有良好的防控效果，为了探究其大田实际应用效果，我们在陕西省宝鸡市扶风县开展了相关实验。在获取球毛壳菌MG2的发酵液后，将发酵液与硅藻土、柠檬酸钠、抗坏血酸、糊精按照一定的比例混合，制成糊剂。在夏季腐烂病孢子传播高峰期，使用糊剂对苹果树主干大枝进行夏季涂干处理，淋刷2次，每次间隔10-15天。试验结果显示，与没有进行夏季涂干的对照组相比腐烂病发病降低了14.67 个百分点，相对防效为52.39％。

三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

一、试验材料

(1)供试培养基

PDA培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖和15g琼脂搅拌均匀后双蒸水定容至1L，封口121℃高压灭菌20min待用。

PDB培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块双蒸水煮沸至可戳散，四层纱布过滤煮沸液至1L的量杯，加入20g葡萄糖搅拌均匀后双蒸水定容至1L，封口121℃高压灭菌20min待用。

(2)供试菌株

供试内生球毛壳菌菌株MG2：由本实验室从健康木瓜海棠树皮中分离得到，经过鉴定确定其为球毛壳菌(Chaetomium globosum)，置于4℃小斜面保存。

本发明实施例提供的球毛壳菌菌株MG2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101，保藏日期2022年2月14日,保藏号为：CGMCC No.40070。

供试病原菌：苹果树腐烂病病原菌(苹果黑腐皮壳菌Valsa mali；苹果生黑腐皮壳菌Valsa malicola)、梨树腐烂病病原菌(Valsapyri)、苹果轮纹病病原菌(Botrosphaeriadothidea)、苹果炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、苹果炭疽叶枯病病原菌(Colletotrichum fructicola)、小麦赤霉病病原菌(Fusarium graminearum)、辣椒疫病病原菌(Phytophthora capsici)、柳树腐烂病病原菌(Valsa salicina)、樱桃树腐烂病病原菌(Valsa leucostoma)。

二、试验方法

(1)菌株鉴定

形态学观察：将之前平板对峙筛选出来的拮抗菌株MG2重新活化接于PDA培养基上， 25℃培养箱中黑暗培养7d。观察其生长速度，菌落颜色，形状，闭囊壳形态等特征。

分子生物学鉴定：将拮抗菌株MG2活化接于PDA培养基上，25℃培养箱中黑暗培养4d 后转接到铺有玻璃纸的PDA培养基中，待菌落近似长满皿后，刮取菌丝提取菌株DNA，扩增ITS、LSU和EF-1α片段，将剩余PCR扩增产物送到上海生工生物有限公司测序。测序结果序列与NCBI数据库中相关菌株进行BLAST比对分析，分别获得与拮抗菌株序列同源性高的相关菌株的ITS、LSU和EF-1α序列。依次载入PhyloSuite软件中串联，在MEGA软件中基于邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建多基因系统发育进化树。

(2)菌株活化及平板对峙试验

菌株活化：在超净工作台中于4℃小斜面试管中挑少量菌丝，接种于PDA培养基上，25℃培养2～3d，完成活化，供试验使用(注：试验中所用的菌丝都是菌落最外围的生长顶端部分)。

平板对峙：采用两点对峙法明确球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的拮抗作用。在PDA平板中央放置直径为5mm已活化的腐烂病菌菌饼，在距离病原菌菌饼左右各2.5cm处放置内生球毛壳菌菌饼，以单独放置病原菌菌饼的处理为对照。由于球毛壳菌生长速度比腐烂病菌慢，设置处理为优先接种球毛壳菌2d，1d，0d，分别标记为处理A、B、C，每个处理3个重复。 25℃黑暗培养，待对照近乎长满皿后，测量对照组菌落直径和处理组病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径，按如下公式计算抑菌率：

抑菌率＝[(对照菌落直径-病原菌菌落朝球毛壳菌方向扩展的直径)/对照菌落直径]×100％

(2)球毛壳菌的抑菌谱测定

进一步利用平板对峙试验确定球毛壳菌MG2对多种病原菌是否具有广谱抑菌效果。选用的病原菌有苹果树腐烂病病原菌(苹果黑腐皮壳菌V.mali；苹果生黑腐皮壳菌V.malicola)、梨树腐烂病病原菌(V.pyri)、苹果轮纹病病原菌(B.dothidea)、苹果炭疽病病原菌(C. gloeosporioides)、苹果炭疽叶枯病病原菌(C.fructicola)、小麦赤霉病病原菌(F.graminearum)、辣椒疫病病原菌(P.capsici)、柳树腐烂病病原菌(V.salicina)、樱桃树腐烂病病原菌(V. leucostoma)，参考(1)的试验步骤进行。

(3)球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响

扫描电镜样品的制备：参考(1)进行平板对峙培养2～3天后，用解剖刀切取正常生长的 V.mali菌丝边缘为处理A，切取球毛壳菌拮抗后的V.mali菌丝边缘为处理B，放在4％(v/v) 戊二醛磷酸缓冲液(100mM，pH＝6.8)4℃下固定20h，然后用PBS(pH＝6.8)的缓冲液冲洗 4次，每次间隔20min。样品经系列乙醇脱水、乙酸异戊酯置换、CO

(4)球毛壳菌对苹果离体枝条和叶片的致病性检测

枝条处理：采集富士苹果枝条(1～2年生)，剪成10cm长短，挑选粗细长势一致的枝条，经清水冲洗干净，0.6％次氯酸钠溶液消毒15～20min后，无菌水再清洗3～4次直至无异味，晾干，用融化的石蜡封住枝条两端，静置晾干。

离体枝条试验：将处理好的枝条打孔(孔径5mm)，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C，保鲜膜上喷水后密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果树腐烂病的发生情况，每个处理9根枝条，每个枝条一个接种点，试验重复3次。

叶片处理：采集健康富士苹果叶片，挑选大小近似一致的叶片，具体清洗步骤同上述枝条处理方法一致。室温自然摆放叶片，用灭菌后的棉花蘸取少量灭菌水将叶柄包裹保湿，静置备用。

离体叶片试验：将处理好的叶片以中间主叶脉为界限，用1mL注射器针头在叶片左右两侧中心位置各扎四个孔，接种V.mali菌饼作为处理组A，接种内生球毛壳菌MG2菌饼作为处理组B，接种空白PDA培养基菌饼作为对照组C，之后保鲜膜上喷水密封保湿，25℃条件下培养5d，观察苹果叶片发病情况，每次9片叶片，试验重复3次。

(5)球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用

内生球毛壳菌发酵液制备：无菌条件下用打孔器打取已培养5d的内生球毛壳菌菌饼(直径5mm)，放入分装成400mLPDB培养液的1L三角瓶中，每瓶放10个菌饼，25℃、120 r·min

发酵液对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用：将收集的球毛壳菌发酵液和融化的PDA分别混合，配成发酵液含量分别为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的培养基平板，凝固后在平板中央接种一个培养2～3d的苹果树腐烂病菌菌饼(直径5mm)，以不含内生球毛壳菌发酵液的处理为对照，每处理6次重复，25℃黑暗培养至对照长满皿后进行菌落直径测量，计算菌丝抑制率，抑制率计算公式参考(1)。

(6)球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响

扫描电镜样品的制备：参考(5)配成发酵液含量为1.0％的培养基平板，接种苹果树腐烂病菌菌饼，以不含内生球毛壳菌发酵液的处理为对照，培养3天后，用解剖刀切取正常生长的腐烂病菌菌丝边缘、含发酵液1.0％的培养基平板上的腐烂病菌菌丝边缘，参考(4)进行样品制备、观察、拍照。

(7)球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响

病原菌分生孢子悬浮液制备：将生长3d的苹果树腐烂病菌打取直径为5mm的菌饼倒置接种于空白PDA培养基上，置于25℃黑暗培养至长满整个培养皿后，将培养皿摊开于常温放置培养。当培养皿内长出黄色的分生孢子角时，在无菌操作台内，用酒精灯烧过的接种针挑取皿内的分生孢子角悬浮于20mL灭菌水中，充分混匀后，用显微镜观察孢子浓度，配制成1×10

参考(5)配成发酵液含量为0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的培养基平板，滴入20μL 配制好的V.mali分生孢子悬浮液，用灭菌涂布器轻轻涂抹均匀，以不含内生球毛壳菌发酵液的培养基处理为对照，每个处理3次重复，试验重复3次。于25℃黑暗培养24h后，在普通光学显微镜下统计分生孢子的萌发情况(萌发标准为芽管的长度超过分生孢子直径的1/2)，每个玻片观察10个视野，计算出分生孢子萌发率和萌发抑制率。

分生孢子萌发率＝已萌发的孢子数/孢子总数×100％

分生孢子萌发抑制率＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100％

(8)球毛壳菌发酵液的稳定性测定

热稳定性：将装于离心管的10mL内生球毛壳菌发酵液分别置于37℃、55℃、80℃、100℃及121℃温度条件下30min，待发酵液自然冷却，采用菌丝生长速率法进行生物测定，将融化的PDA培养基与发酵液混合，配成滤液含量为10.0％的平板，待凝固在平板中央放置一个培养2～3d的苹果树腐烂病菌菌饼(直径5mm)，每个处理6次重复，以没有进行温度处理的发酵液和空白培养基为对照，25℃黑暗培养至对照近似长满皿后测量菌落直径并计算菌丝生长的抑制率。

紫外线稳定性：将装于小三角瓶中的10mL内生球毛壳菌发酵液置于紫外灯光(波长254 nm)下，分别放置30min、60min、90min、120min及180min后，采用菌丝生长速率法进行生物测定，将融化的PDA培养基与发酵液混合，配成滤液含量为10.0％的平板，待凝固在平板中央放置一个培养2～3d的苹果树腐烂病菌菌饼(直径5mm)，每处理6次重复，以没有进行紫外线处理的发酵液和空白培养基为对照，25℃黑暗培养至对照近似长满皿后测量菌落直径并计算菌丝生长的抑制率。

(9)球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条的防效测定

保护作用：枝条处理同(4)中的方法，用直径为5mm的打孔器对枝条进行打孔，处理组A先接种球毛壳菌菌饼，3d后将球毛壳菌菌饼刮除，并在原位置接种苹果树腐烂病菌菌饼；处理组B用灭过菌的毛笔蘸取适量内生球毛壳菌发酵液刷枝条3次，晾干后接着接种苹果树腐烂病菌菌饼；以无菌水代替球毛壳菌发酵液为对照组CK，每处理设置6个重复，每个枝条 1个接种点，喷水后用保鲜膜保湿，在25℃恒温培养箱中培养5d后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑长度和防治效果，试验重复3次。

治疗作用：枝条处理同(4)，用直径为5mm的打孔器对枝条进行打孔，处理组A先接种苹果树腐烂病菌菌饼，2d后将苹果树腐烂病菌菌饼刮除，处理组在原位置接种内生球毛壳菌菌饼；处理组B先接种生长旺盛的苹果树腐烂病菌菌饼，喷水保鲜膜保湿25℃恒温培养箱中培养2d后，去除苹果树腐烂病菌菌饼，接着用灭过菌的毛笔蘸取适量内生球毛壳菌发酵液刷枝条3次，晾干，以无菌水代替内生球毛壳菌发酵液为对照组CK，每个枝条1个接种点，每处理设置6个重复，喷水后用保鲜膜保湿，继续在25℃恒温培养箱中培养5d后，观察苹果树腐烂病的发生情况，测量病斑长度和防治效果，试验重复3次。

(10)球毛壳菌发酵液对烟草的促生作用

基质和土1：1湿润混合后播撒烟草种子，7天待烟草苗长出后移栽成单盆单苗，待烟草生长15天后即可使用。以浇灌内生球毛壳菌发酵液为处理组MG2，浇灌4次，每次间隔7天，每处理设置6个重复；以浇灌空白PDB培养液为对照组CK。30天后，统计烟草鲜重和促生效果，试验重复3次。

三、实验结果

(1)菌株鉴定

如图1中的(a)～(c)所示，通过菌株分离以及多次纯化得到一株海棠树皮内生真菌，经PDA培养基培养发现，内生菌株是一种丝状真菌，真菌表面呈絮绒状，初期菌落菌落初为淡黄色，气生菌丝淡黄色；后期菌落颜加深，闭囊壳表生，球形、卵形或椭圆形，7d开始产生，成熟后，反射光下橄榄绿色或灰褐色；顶生附属丝茂密，不分枝，直或弯曲。适宜的培养温度范围为22～28℃。

将菌株MG2测序得到的ITS、LSU和EF-1α序列与基因库已报道序列构建系统发育进化树(见图2～图5)显示：试验所分离得到的海棠树皮内生拮抗菌株与编号为CBS164.62的菌株归属于一类，亲缘关系最近，此菌株为毛壳属球毛壳菌(Chaetomium globosum)。结合之前菌丝及闭囊壳形态学特征观察，最终确定本试验分离得到的拮抗菌株为毛壳属球毛壳菌 (C.globosum)。

(1)球毛壳菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用

由图2中的(a)～(c)可知，球毛壳菌对苹果树腐烂病菌有十分明显的拮抗抑制作用，优先接种球毛壳菌2天，其对苹果树腐烂病菌生长的抑制率高达98.65％；优先接种球毛壳菌 1天，抑制率为98.65％；同时接种，抑制率为82.21％。

(2)球毛壳菌的抑菌谱

由图3中的(a)～(c)和图4可知，内生球毛壳菌对小麦赤霉病病原菌(F.graminearum)、辣椒疫病病原菌(P.capsici)、苹果轮纹病病原菌(B.dothidea)、苹果炭疽病病原菌(C. gloeosporioides)和苹果炭疽叶枯病病原菌(C.fructicola)无明显拮抗抑制作用；但该球毛壳菌对Valsa属的病原真菌V.pyri、V.malicola、V.salicina、V.leucostoma有专一性的抑制作用，抑制率分别为80.22％、76.57％、76.91％、79.97％。

(3)球毛壳菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响

由图5中的A和B可知，对峙培养3天后，扫描电镜观察发现，经PDA培养基正常培养的苹果树腐烂病菌菌丝呈细长状态，粗细较均匀，菌丝表面光滑，菌丝顶端较尖细。内生球毛壳菌拮抗之后，苹果树腐烂病菌菌丝生长杂乱不规则，菌丝明显增粗，分支变多且菌丝顶端变钝圆。球毛壳菌拮抗后的苹果树腐烂病菌菌丝明显增粗，说明腐烂病菌菌丝的生长受到严重抑制。

(4)球毛壳菌对苹果离体叶片和枝条的致病性检测

由图6中的A～C可知，将球毛壳菌MG2分别接种在健康的苹果叶片和枝条上，培养5d 后，苹果树叶片和枝条均不发病，说明其对苹果不具有致病作用，为其后期应用到田间生产中奠定基础。

(5)球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑制作用

由图7中的(a)～(c)可知，球毛壳菌MG2发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显抑制作用，并且随着培养基中滤液含量的增多，抑制效果越强。在试验设置的5个发酵液含量梯度中，培养基中内生球毛壳菌发酵液含量为10.0％时，对苹果树腐烂病菌菌丝生长抑制效果最好，抑制率达到99.68％；含量为5.0％时，对苹果树腐烂病菌菌丝生长抑制效果次之，抑制率达到96.53％；含量为2.0％、1.0％、0.5％时也有较好的抑制效果，抑制率分别为 91.76％、84.83％、78.91％。

(6)球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌菌丝形态的影响

由图8中的A和B可知，经PDA培养基正常培养的苹果树腐烂病菌菌丝呈细长状态，粗细较均匀，菌丝表面光滑，菌丝最顶端较尖细。在球毛壳菌发酵液含量为1.0％的培养基培养3天后，苹果树腐烂病菌菌丝生长杂乱不规则，菌丝明显增粗，分支变多且菌丝顶端膨大钝圆，说明发酵液对腐烂病菌菌丝的生长有明显的抑制作用。

(7)球毛壳菌发酵液对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响

由图9中的(a)和(b)、图10中的(a)～(c)可知，在空白PDA培养基上，苹果树腐烂病菌的分生孢子可以正常吸涨、萌发并伸出细长芽管；在试验中，当培养基中发酵液含量为5％和10.0％时，对分生孢子萌发的抑制率达到95.00％以上；含量为2.0％、1.0％、0.5％时，抑制率分别为77.21％、55.44％、39.37％。同时观察到，在球毛壳菌发酵液含量为5.0％、 10.0％的培养基上，大量的分生孢子不能正常萌发，出现畸形、不规则膨大、原生质外渗等现象，说明球毛壳菌发酵液抑制了腐烂病菌的孢子萌发。

(8)球毛壳菌发酵液的稳定性测定

从图11中的(a)～(c)可以看出，内生球毛壳菌发酵液经37℃、55℃、80℃、100℃处理30min后抑菌活性不受影响，对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率均在89.00％以上；但是121℃处理30min后，抑菌活性明显下降，抑制率为49.23％；这表明在日常温度条件下，发酵液具有良好的热稳定性。

从图12中的(a)～(c)可以看出，内生球毛壳菌发酵液经30min、60min、90min、120min及180min紫外辐射后抑菌活性不受明显影响，对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率均在 86.00％以上，说明其在接收了紫外照射3h后仍能保持良好的抑菌活性。

综上，球毛壳菌发酵液具有良好的热稳定性和紫外线稳定性，可以进一步应用于田间。

(9)球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条的防效

从图13中的(a)～(c)可知，球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条有良好的保护效果，直接接种球毛壳菌的保护效果为72.46％，发酵液的保护效果为65.07％。

从图14中的(a)～(c)可知，球毛壳菌及其发酵液发酵液对苹果离体枝条有一定的的治疗效果，直接接种球毛壳菌的治疗效果为21.33％，发酵液治疗效果为32.70％。

由此可知，球毛壳菌及其发酵液对苹果离体枝条均有一定的保护和治疗效果，但其保护作用优于治疗作用，为后期生产球毛壳菌预防保护制剂奠定基础。

(10)球毛壳菌发酵液对烟草的促生作用

由图15中的(a)～(c)可知，球毛壳菌发酵液对烟草具有明显的促生作用，浇灌内生球毛壳菌发酵液后，烟草的地上部分生长旺盛，植株鲜重比对照组提了40.54％。表明内生球毛壳菌发酵液具有一定的促生作用，能够促进植物生长。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。