一种与细毛羊净毛率相关的SNP位点组合及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与细毛羊净毛率相关的SNP位点组合及应用。

背景技术

绵羊(Ovis aries)作为有史以来最早被驯化的动物之一，在人类社会中发挥了重要作用，并且通过人类迁徙几乎在全球范围内繁衍。人类对羊进行驯化用于饲养，主要是为了满足人类社会的生存需要，尤其是对于生活在偏远和游牧地区的人民。随着人们生活水平的提高和物质需求的不断丰富，细毛羊因生产羊毛等次要产品成为了绵羊经济生产性能分类之一，其培育的专业化出现了。

细毛羊以其生产优质羊毛而闻名，羊毛作为一种天然纤维，是用于服装和纺织品的重要农产品。其中，羊毛质量由纤维直径、纤维长度、净毛率、卷曲、颜色和髓质百分比决定。细毛羊的羊毛性状一直是人工选育的重点。在众多羊毛性状中，净毛率在羊毛流通领域中是羊毛交易计算重量与价格的重要依据，且在养羊业生产上测定和统计羊群与个体的产毛量时，都以净毛量为基础。但由于细毛羊的被毛是完全由无髓细毛组成的同质细毛，细度在60支以细，即羊毛纤维直径在25微米以下，因此细毛羊的净毛率是普遍偏低，严重影响羊毛经济价值。但目前对于细毛羊净毛率的研究较少，因此本发明旨在利用已被广泛应用的分子遗传标记方法，对细毛羊净毛率相关的遗传性状进行探究。

分子标记是以直接检测DNA核苷酸序列的差异为基础的遗传标记。目前DNA分子标记已被广泛应用，主要可以分为三大类：第一类是以分子杂交为核心的第一代分子标记，包括了限制片段多态性RELP，DNA指纹技术等；第二类是以PCR为核心的第二代分子标记，包括随机扩增多态性RAPD，简单序列重复SSR，扩增片段长度多态性AFLP，序列标签位点STS等；第三类则是新型的分子标记，同样以PCR技术为基础，包括了单核苷酸多态性SNP标记，表达序列标签EST等。其中，由于从SNP多态性数据中可以通过计算获得准确的育种值，因此本申请选择采用应用SNP位点组合的检测来加速对细毛羊净毛率性状的改进。

本发明首先提供了与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合，所述SNP位点基于绵羊v4.0基因组序列比对确定；分别为：位于chr 1第46959081位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 1第49921099位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第45125479位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 7第48114170位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 11第25845229位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 17第17696652位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 17第56249564位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 19第837291位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 21第39667311位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 21第39691339位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 23第34296893位，其脱氧核苷酸为C或A。其次，本发明通过GenoPlexs(基于多重PCR的靶向基因捕获技术方案)和GenoBaits(基于液相探针杂交的靶向基因捕获技术方案)技术，获得目标SNP的基因型，实现了细毛羊净毛率性状的快速有效检测，对绵羊的分子育种以及种质资源的保护与改造均有着重要的意义。

发明内容

为满足我国当前育种生产上对净毛率性状方向的芯片位点功能检测。功能研究方面的需求，本发明提供了一种中国四个代表性细毛羊(中国美利奴羊、高山美利奴羊、敖汉细毛羊和青海细毛羊)的高深度全基因组重测序数据，获得了一种检测准确，使用方便，市场前景广阔的一种细毛羊羊毛净毛率性状的SNP位点组合，所述位点能够用于绵羊品种的选育、保护及改良。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合，所述11个SNP位点组合基于绵羊v4.0基因组序列比对确定；分别为：位于chr 1第46959081位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 1第49921099位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第45125479位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 7第48114170位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 11第25845229位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 17第17696652位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 17第56249564位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 19第837291位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr21第39667311位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 21第39691339位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 23第34296893位，其脱氧核苷酸为C或A。

第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合的试剂在检测细毛羊净毛率性状或在细毛羊分子标记辅助育种中的应用。

优选地，所述试剂包括用于检测所述SNP位点组合的引物，本领域技术人员根据本发明提供的细毛羊净毛率相关的SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，可以在同一反应条件下实现检测目的的引物。其中，引物的设计为常规方法，根据本申请提供的细毛羊净毛率相关的SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本申请提供的细毛羊净毛率相关生物SNP位点组合获得引物也属于本发明的保护范围。

优选地，所述试剂包括用于检测所述SNP位点组合的分子探针组合。分子探针的设计为常规方法，根据本申请提供的细毛羊净毛率相关的SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本申请提供的细毛羊净毛率相关生物SNP位点组合获得分子探针也属于本发明的保护范围。

优选地，所述分子探针组合如表1所示。

表1与细毛羊净毛率相关的SNP位点组合的分子探针组合

优选地，所述试剂包括基因芯片，所述基因芯片采用常规方法将获得的引物或探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成获得的引物或探针，本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。

第三方面，本发明提供了一种分析细毛羊净毛率性状的分子探针组合，所述分子探针组合检测上述第一方面中所述的与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合。

优选地，所述分子探针组合如上表1所示。

第四方面，本发明提供了一种分析细毛羊净毛率性状的基因芯片，所述基因芯片负载有上述第三方面所述的分析细毛羊净毛率性状的分子探针组合。

第五方面，本发明提供了一种分析细毛羊净毛率性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述第三方面所述的分析细毛羊净毛率性状的分子探针组合或第四方面所述的分析细毛羊净毛率性状的基因芯片。

第六方面，本发明提供了上述第三方面所述的分子探针组合，或上述第四方面所述的基因芯片，或上述第五方面所述的试剂盒在细毛羊净毛率性状评价，或在细毛羊品种筛选，或在细毛羊品种鉴定，或在细毛羊分子标记辅助育种中的应用。

第七方面，本发明提供了一种分析细毛羊净毛率性状的方法，所述方法为：检测待测细毛羊的基因组DNA中如上述第一方面所述的与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点基因型；对照细毛羊基因组DNA的所述11个SNP位点基因型进行比较，根据基因型检测结果判断细毛羊的净毛率性状。

本发明的有益效果是：本发明首先提供了与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合，所述SNP位点基于绵羊v4.0基因组序列比对确定；其次，本发明发现通过分子探针或基因芯片等方式待测细毛羊基因组DNA中的与细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合的基因型，能够用于细毛羊净毛率性状分析，用于细毛羊早期育种选择，实现对早期难以度量的净毛率性状进行个体选择，缩短世代间隔，加速育种进程，节约大量的育种成本，为今后细毛羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供支撑；而且基于本发明提供的细毛羊净毛率相关的11个SNP位点组合形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒与现有的高密度芯片相比，通量小、成本低，分析更容易，普适性广，市场前景广阔。

附图说明

图1对与细毛羊净毛率性状相关的SNP数据进行GWAS中GLM模型下实施例1中计算获得的p值取-log10以后绘制的曼哈顿图；

图2对与细毛羊净毛率性状相关的SNP数据进行GWAS中GLM模型下实施例1中计算获得的p值取-log10以后绘制的Q-Q图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所有试验的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有试验的实验条件如无特殊说明，均为常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明所述的SNP是单核苷酸多态性的简称，指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

实施例1细毛羊净毛率相关的SNP位点

1、总SNP集合的获取

对我国具有代表性的四个细毛羊品种中的460个细毛羊个体进行了全基因组重测序，平均深度为5X，应用重测序分析流程，与2015年发布的绵羊v4.0参考基因组(从NCBI中获取)进行比对，两种方式比对获得的共同结果形成一个SNP集合。

具体而言，对多个细毛羊个体进行高深度重测序是由生物测序公司完成，生物测序公司完成的测序结果均能够实现本发明的技术目的，本发明不做限制。本申请将测序公司返回的Fastq文件通过BAM文件比对到参考基因组绵羊v4.0后得到BAM文件，利用SAMtools和GATK软件对样本BAM文件分析得到的包含群体SNP分型信息的VCF文件，将两种方式获得的VCF文件结果合并，经过质量筛选后获得了包含11个SNP位点的SNP集合。

具体的，本发明所使用的细毛羊品种为中国四个代表性细毛羊品种，分别是中国美利奴羊、高山美利奴羊、敖汉细毛羊和青海细毛羊。

2、候选基因与所在功能区域的筛选

根据中国四个代表性品种细毛羊(中国美利奴羊、高山美利奴羊、敖汉细毛羊和青海细毛羊)在羊毛净毛率性状上表现出来的显著性差异，首先利用自写的perl脚本对其进行标记质控，去除此等位基因频率小于0.05，缺失率大于20％，杂合比例大于80％以及非二等位的位点。其次借助五部分的群体分析，其中包括由MEGA-X软件完成的系统发育树的构建、由Admixture软件(v1.3)软件完成的群体结构分析、由gcta(v1.92.2)软件完成的PCA分析和亲缘关系分析以及由软件HaploviewLD完成的衰减分析，可以综合评判材料的遗传多样性以及遗传背景是否存在较大的差异，揭示非家系群体或系谱不明确的群体材料的遗传相似度以及各个亚群和整体材料的受选择程度，由此确定调整GWAS(全基因组关联分析)所采用的模型。最终通过GLM(简单线性模型)，以曼哈顿图与QQ图展示定位到了与细毛羊毛净毛率相关的SNP位点以及候选基因，以阈值为0.01筛选出了其显著结果，确定了14个与细毛羊净毛率相关的，功能确定的候选基因或标记NEGR1、LOC101120030、LOC101120470、LZTS1、MYO1E、RABEP1、SCIMP、MGST2、RRM4、SUDS3、EGFR、FADS2、RBBP8、TRNAR-UCU-11。

3、功能基因位点对应SNP位点的提取

利用GWAS模型的统一表达式：y＝Xα+Qβ+Kμ+e，其中，y为表型向量，X为基因型矩阵，α为基因型效应向量，Q为固定效应矩阵(可以为群体结构/性别/地点/场次等信息)，β为固定效应向量，K为随机效应矩阵，主要指亲缘关系矩阵，μ为随机效应向量，e为残差向量。针对每个SNP位点，都检验α是否为0，α为0的概率值p用于衡量标记基因型与表型的关联程度，p值越小，α为0的概率越小，该标记越可能与性状关联。从而有步骤2确定的候选基因所在的功能区域对应的SNP位点，得到NEGR1、LOC101120030、LOC101120470、LZTS1、MYO1E、RABEP1、SCIMP、MGST2、RRM4、SUDS3、EGFR、FADS2、RBBP8、TRNAR-UCU-11共14个与净毛率相关联的基因或标记，且仅包含11个SNP位点的位点组合。

所述11个SNP位点组合的物理信息具体如下表2所示。

表2细毛羊净毛率性状SNP位点组合的物理信息

实施例2细毛羊净毛率相关的SNP的panel制备

基于实施例1获得的SNP位点组合，本申请委托博瑞迪生物科技有限公司进行了净毛率相关的SNP的panel制备。在定量质检合格的DNA中加入多重PCR Panel mix和多重PCR扩增酶体系，置于PCR仪上完成PCR反应。PCR产物利用羧基磁珠进行纯化后，再次计入带有Barcode的测序引物和高保真PCR反应体系进行PCR扩增，不同的Barcode用于区分不同的样品。经过羧基磁珠纯化后扩增产物，即完成多重PCR捕获及文库建库。本领域技术人员根据本发明提供的细毛羊净毛率相关的SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，为常规方法，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得；而且，panel制备也是依据本发明提供的细毛羊净毛率相关的SNP位点组合能够常规制备的。

实施例3 437个细毛羊个体净毛率的检测

基于实施例1获取到的SNP位点组合与实施例2的panel制备对细毛羊的个体进行检测，在本发明的一个实施例中，选择了采用博瑞迪自主研发的GenoBaits(基于液相探针杂交的靶向基因捕获技术方案)对其个体进行羊毛净毛率的检测。该技术的工作原理是基于目标探针与靶向序列互补结合进行定点捕获，对捕获的靶点序列进行洗脱、靶点扩增、建库和测序，最终获得目标SNP的基因型，在经济有效的条件下，所能检测的靶向位点及其标记数目在检测密度和通量上等同于高密度固相芯片。通过该技术从而获得目标样本的结果值。细毛羊净毛率相关位点多态性检测结果如表3所示。

表3细毛羊净毛率相关位点多态性

细毛羊不同基因型与净毛率之间的相关分析结果如表4所示，由χ

表4细毛羊不同基因型与净毛率之间的相关分析

上述结果表明，通过检测本发明所述的11个细毛羊净毛率SNP位点组合的基因型，可以对细毛羊净毛率进行分析，其中11个SNP位点组合分别为：位于chr 1第46959081位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 1第49921099位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第45125479位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 7第48114170位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 11第25845229位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 17第17696652位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 17第56249564位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 19第837291位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 21第39667311位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 21第39691339位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 23第34296893位，其脱氧核苷酸为C或A。

本领域技术人员基于本发明提供的仅由11个SNP位点组成的细毛羊净毛率SNP位点组合可以制成的分析细毛羊净毛率的SNP探针组合、基因芯片和试剂盒，能够在基因组水平上对细毛羊净毛率进行分析，或遗传评估、品种筛选、品种鉴定，以获得更高的育种值估计准确性，控制育种进程，还能够应用于绵羊系谱重构、绵羊品种溯源、种质资源保护和种质资源改良。由于与细毛羊净毛率相关的研究较为稀缺，因此本申请旨在加速细毛羊的分子育种进程，增强对该物种资源的保护与改良，节约大量的育种成本，由此提升细毛羊带来的毛用经济效益。

以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。