钙依赖蛋白激酶基因GhCPK4在植物抗黄萎病中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及钙依赖蛋白激酶基因 在植物抗黄萎病中的应用。

背景技术

棉花黄萎病主要由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起，该病原菌作为土传真菌，在棉花全生育期均可以浸染棉花，造成棉花叶片失绿变黄、萎蔫、 干枯脱落、植株变矮、棉铃变小等，甚至会导致棉花死亡，严重影响棉花产 量、品质和种植棉花的经济效益。由于黄萎病的不可逆性，被称为棉花的“癌 症”。因此，培育抗黄萎病的棉花陆地棉新品种显得尤为迫切。由于棉花黄 萎病致病机理的复杂性及通过传统杂交方法筛选抗病品种的难度大且周期 长，目前还没有培育出对棉花黄萎病具有优良抗性的陆地棉栽培品种。分子 改良棉花抵御黄萎病侵害已成为优质棉基地持续发展的迫切需要。发掘棉花 抗病相关基因解析其抗病机制并利用转基因创制抗性新种质已经成为棉花黄 萎病抗性育种的一种重要手段。

植物在进化过程中形成一系列复杂的信号传递机制来响应病害、低温、 干旱及盐害等胁迫，从而提高植物的环境适应能力，最大程度地减少逆境造 成的伤害。Ca

CPKs在植物体内由多基因编码，参与调控了植物对多种环境胁迫的响应 (Chenet al.,2021)。高温、干旱、盐胁迫、外源激素处理以及病原微生物感 染，都能够引起CPKs基因的表达，通过对Ca

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种钙依赖蛋白激酶基因GhCPK4在植物抗黄 萎病中的应用，为新的抗黄萎病棉花品种的培育奠定应用基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质在植物抗黄萎病中的应 用，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

或在所述SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的N末端和/或C末端链接蛋白 标签得到的融合蛋白质；

或将所述SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

优选的，所述蛋白质来源于棉花。

本发明的另一目的是，提供上述蛋白质相关的生物材料在植物抗黄萎病 中的应用，所述材料为以下任意一种：

A：编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B：含有A所述核酸分子沉默的表达盒；

C：含有A所述核酸分子的表达载体、或含有B所述表达盒的重组载体；

D：含有A所述核酸分子的重组微生物、或含有B所述表达盒的重组微 生物、或含有C所述重组载体的重组微生物。

术语“表达盒”是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的 DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋 白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

优选的，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

或与所述SEQ ID NO：1核苷酸序列同源性在90％以上，且编码权利要 求1所述蛋白质的核苷酸序列。

优选的，所述植物为下述任意一种：

a：棉属植物；b：棉花；c：陆地棉TM-1。

本发明的再一目的是，提供一种提高植物抗黄萎病的方法，通过沉默或 抑制植物中上述蛋白质的编码基因的表达量或上述蛋白质的活性来提高抗黄 萎病的能力。

上述沉默或抑制植物中所述蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的 任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实 现基因功能降低或丧失。

优选的，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明利用GhCPK4基因 序列信息扩增该基因，并构建VIGS植物表达载体转化陆地棉TM-1，获得的 转基因棉花，在接种棉花黄萎病菌V991后表现出对黄萎病的抗性，说明 GhCPK4基因与棉花黄萎病的抗性高度相关。本发明为黄萎病抗性的分子机 制研究、新的抗黄萎病植物新品种培育奠定了应用基础，同时也为新的抗病 基因筛选及抗性植物培育提供了新的借鉴和参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1GhCPK4基因PCR产物电泳图，其中Marker 为2000bpLadder Marker；

图2附图为CPK相关基因家族进化树；

图3附图为GhCPK4基因在不同棉花组织(叶、根、茎、花瓣、萼片、 发育5d纤维)中表达量的qRT-PCR结果；

图4附图为信号分子(茉莉酸JA、水杨酸SA、H

图5附图为黄萎病菌V991浸染诱导GhCPK4基因表达模式的qRT-PCR 分析结果；

图6附图为注射VIGS载体后的陆地棉TM-1植株表型图，其中：A为注 射GhCLA1基因的VIGS载体2周后植株表型；B为陆地棉TM-1的TRV:00 (对照)和TRV:GhCPK4用蘸根法接种黄萎病菌V991孢子液(10

图7附图为GhCPK4基因在陆地棉TM-1的TRV:00和TRV:GhCPK4植 株三叶期叶片中表达量的qRT-PCR结果；

图8附图为转基因陆地棉TM-1接种黄萎病菌后的病情指数统计结果；

图9附图为VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之沉 默植株和对照植株棉花茎秆纵切图；

图10附图为VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之 沉默植株与对照植株表面消毒的茎段进行真菌恢复实验结果比较；

图11附图为VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之 沉默植株与对照植株的棉花黄萎病菌复原率统计结果；

图12附图为VIGS干扰陆地棉TM-1植株对黄萎病菌的抗性分析结果之 沉默植株与对照植株的棉花茎段黄萎病菌DNA相对丰度。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

棉花材料包括：

陆地棉TM-1，由中国农业科学院棉花研究所提供；

植物VIGS沉默表达载体：

黄萎病菌V991：本实验室保存，公众可以从新疆农业科学院核技术生物 技术研究所(新疆维吾尔自治区生物技术研究中心)获得；

引物序列：均由上海生工合成提供；

其他生物材料包括：大肠杆菌菌种DH5α、农杆菌菌种GV3101、BP反 应入门载体、VIGS干涉技术载体pTRV1和pTRV2等均属于商品化菌株或载 体，不再赘述；

实验试剂：质粒提取试剂盒、oligo(dT)18、RNAase抑制剂、dNTP、 pMD18-TVector、T4-DNA连接酶、内切酶EcoRI和KpnI、ExTaq酶、PCR 产物回收试剂盒等均为TaKaRa公司产品，荧光定量PCR试剂盒为TOYOBO 公司产品；

荧光定量PCR专用板为Labwares公司产品；

RNA提取试剂盒购自TIANGEN(Beijing，China)公司；

所用培养基及溶液有：LB液体(固体)培养基、YEP液体(固体)培养 基、察氏(Czapek)培养基、PDA培养基、50×TAE Buffer (Na

其他未描述的抗生素、激素类等试剂均为本领域常用试剂，不再赘述。

实施例1

1、陆地棉GhCPK4基因的获得

种植陆地棉TM-1，提取棉花幼苗叶片的RNA，并进行反转录获得cDNA；

RNA提取步骤参考TIANGEN植物RNA快速提取试剂盒，反转录体系 如下：

执行程序：42℃30min，85℃5s。

以CottonFGD网站(https://cottonfgd.org)中ID号为Gh_A03G1505.1基 因(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示) 的cDNA为模板，设计引物并进行基因的扩增，引物序列为：

GhCPK4-F:5’-GGGGTACCATGGGCAATACATGCCGTG-3’，SEQ ID NO：3；

GhCPK4-R:5’-GCTCTAGATTACATAGCACCTGGGGCA-3’，SEQ ID NO：4。

PCR扩增体系如下：

PCR扩增程序：95℃2min；95℃20s，52℃30s，72℃30s，35个循环； 72℃5min。

对PCR电泳产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。从 图中可以看出，基因GhCPK4大小为1707bp。

2、GhCPK4基因生物学信息分析

利用在线网站(http://web.expasy.org/protparam/)分析GhCPK4蛋白的理 化性质，该蛋白含有568个氨基酸，分子量为63.5kD，等电点pI为5.81。

利用所得的序列在NCBI网站进行在线序列比对，GhCPK4蛋白属于 STKc_CAMK蛋白家族。利用在线网站(http://ffas.burnham.org/Xtal Pred-cgi) 预测GhCPK4蛋白质的二级结构，可知大约42％的氨基酸形成α-螺旋，10％ 的氨基酸形成β-折叠片。

将GhCPK4同拟南芥、玉米、水稻、烟草、小麦中CPK家族进行进化树 分析，结果如附图2所示，GhCPK4在进化关系上与拟南芥的CPK4和CPK11 遗传距离最近。

实施例2

1、自然条件下GhCPK4基因的组织表达模式

分别在棉花盛花期取棉花的叶片、根、茎、花、萼片、发育5d的纤维， 提取其RNA，并使用反转录试剂盒获得cDNA，采用如下定量PCR引物进行 qPCR扩增：

QRT-PCR-GhCPK4F:5’-GTTAACAAGGATGATGATTTC-3’，SEQ ID NO：5；

QRT-PCR-GhCPK4R:5’-GCTATTACCCGTAAAGCCAT-3’，SEQ ID NO：6；

内参基因选用泛素蛋白7(Ubiquitin7，UB7)，引物序列设计如下：

UBQ7F:5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’，SEQ ID NO：7；

UBQ7R:5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’，SEQ ID NO：8。

qRT-PCR是在ABI 7500Real-time PCR序列检测系统和软件 (AppliedBiosystems，USA)上进行的；

20μL反应体系设计如下：

反应体系为10μLSYBR Green Realtime PCR Master Mix，1μL cDNA产 物，上下游引物各0.4μL(10μM)，Nuclease-free Water补充至反应总体积 为20μL。每个基因4个技术重复。

对应的程序为，定量程序为94℃30s；95℃5s，57℃15s，72℃31s， 40个循环。

40个循环后扩增产物的特异性用溶解曲线分析检测。每个反应都包括了 至少三个重复。用单一模板稀释至不同浓度，通过模板稀释倍数的log值对每 个稀释样品的Ct值作图检测引物扩增效率。

检测结果如附图3所示，分析表明GhCPK4基因在棉花所有组织中均有 表达，但转录水平存在显著差异，其中该基因在花中的表达高于其它组织， 其次是萼片；在叶片、根、茎和发育5d的纤维中的表达水平显著低于其它组 织，根中的转录水平略高于叶片、茎和发育5d的纤维。

2、受信号分子胁迫(茉莉酸JA、水杨酸SA、H

将TM-1棉花种子水中浸泡24h后播种于营养土中，12h光照/12h黑暗， 温度为26-28℃光照培养。湿度保持在60％及以上，4-5d浇一次水，在幼苗 两叶一心时选取长势及大小一致的棉苗，分别用200μM茉莉酸、2mM水杨 酸、1mM H

qRT-PCR分析相关引物及PCR反应程序同本实施例第1部分“自然情况 下基因GhCPK4的组织表达模式”。

qRT-PCR的检测结果如附图4所示，GhCPK4的表达量在JA处理1h时 表达量最高，之后下降；GhCPK4的表达量在SA和H

3、黄萎病菌浸染情况下GhCPK4的表达模式

选取两叶一心的陆地棉TM-1进行伤根，所用的黄萎病菌V991分生孢子 液浓度为1×10

qRT-PCR分析相关引物及PCR反应程序同本实施例第1部分“自然情况 下基因GhCPK4的组织表达模式”。

qRT-PCR的检测结果如附图5所示，V991分生孢子液和水处理后， GhCPK4的表达量在接种黄萎病病原菌12h后，显著性下调，48h后表达量 趋于最低。此结果表明，在TM-1的根系被黄萎病菌的浸染后，基因GhCPK4 的表达量变化明显。

实施例3

利用VIGS技术构建VIGS干涉载体，使基因GhCPK4沉默。观察基因沉 默后棉花对黄萎病菌浸染时的表型变化，进一步证明，基因GhCPK4与黄萎 病抗性高度相关。

1、重组表达载体的构建

(1)引物设计和PCR扩增

在基因GhCPK4的非保守区段设计引物，引物设计原则为：在上游引物 加上限制性酶EcoRI的酶切位点和保护碱基，在下游引物加上限制性酶KpnI 的酶切位点和保护碱基；

GhCPK4-1F:5’-GGAATTCGTTAACAAGGATGATGATTTC-3’，SEQ ID NO：9，

GhCPK4-1R:5’-GGGGTACCGCTATTACCCGTAAAGCCAT-3’，SEQ ID NO：10。

提取陆地棉TM-1的总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采 用引物GhCPK4-1F和引物GhCPK4-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。

PCR扩增体系如下：

PCR扩增程序：95℃2min；95℃20s，52℃30s，72℃30s，35个循环； 72℃5min。

PCR扩增目标序列(约488bp)；扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

(2)测序后获得重组表达载体

胶回收PCR扩增产物，与pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(克隆载体)连 接，用GhCPK4-1F/R引物经PCR鉴定后的阳性转化子送测序。

选择测序成功的阳性转化子提取质粒，将质粒和空载体pTRV2，分别用 酶EcoRI和酶KpnI在37℃水浴的条件下进行双酶切，酶切体系如下：

酶切程序：37℃1h；80℃10min。

酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并利用T4 DNA连接酶进行连接，植 物表达载体重组质粒TRV2-GhCPK4转化农杆菌GV3101，用GhCPK4-1F/R 引物经PCR筛选鉴定后，获得VIGS干涉载体TRV2:GhCPK4。

2、转基因棉花的获得

(1)菌液培养

将pTRV1、TRV2-GhCPK4分别转化农杆菌，在含卡那霉素(50μg·mL

(2)重悬液获得

4000rpm离心5min收集菌体细胞，以适当体积的重悬液(配方：10 mmol·L

含有pTRV1载体的重悬液和含有目的基因片段的重组质粒 TRV2-GhCPK4的重悬液按体积比1:1混匀为TRV:GhCPK4溶液注射棉花子 叶，用于获得基因沉默转化株；含有pTRV1载体的重悬液和含有GhCLA1基 因片段的TRV2-GhCLA1载体的重悬液按体积比1:1混匀为TRV:GhCLA1溶 液注射棉花子叶，用于检测基因沉默体系是否正确；含有pTRV1载体的重悬液和含有pTRV2空载体的重悬液按体积比1:1混匀为TRV:00溶液注射棉花 子叶，用于做遗传转化对照株。

(3)受体培养

TM-1棉花种子水中浸泡24h后播种于营养土中，12h光照/12h黑暗， 温度为26-28℃光照培养。湿度保持在60％及以上，4-5d浇一次水，待两片 子叶平展开且真叶尚未发育时即可用于VIGS操作。

(4)GhCPK4基因沉默转化株的获得

先用注射器针头轻轻刺破子叶背面造成微伤口，用去针头的注射器从伤 口处注入上述(2)中准备好的按照体积比1:1混匀的重悬液，获得棉花GhCPK4 基因沉默转化株。避光24h，12h光照/12h黑暗，温度为26-28℃光照培养。

用类似的方法获得GhCLA1基因沉默检测株和pTRV2空载体遗传转化对 照株。

农杆菌VIGS具体方法参考文献：Gao,X.,Shan,L.Functional genomic analysisof cotton genes with agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing.Methods Mol Biol,2013,975:157-165.

3、VIGS遗传转化体系的检测

(1)2周后观察不同处理棉花的表型，采用陆地棉GhCLA1基因 (cloroplastosalterados 1gene)为标记基因进行VIGS体系检测。该基因参与叶绿 体发育过程，编码1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase蛋白，进化中高度保 守，GhCLA1基因沉默后棉株有明显的白化表型，是易于识别的标记性状。如 附图6所示，VIGS侵染2周后，注射TRV1和TRV2-GhCLA1的植株真叶几 乎完全白化(图6A)，而注射空载体pTRV1和pTRV2为对照(TRV:00)的叶 片没有任何变化(图6B TRV:00)。说明在陆地棉TM-1中成功建立了TRV 介导的VIGS体系。

(2)荧光定量Real time-PCR检测

取处理棉花叶片提取RNA(最好是新长的真叶)，然后进行qRT-PCR， 检测目标基因是否被降低表达，并检测目的基因的表达情况。对每种材料处 理30个单株。

利用RNA提取试剂盒提取VIGS浸染棉花植株叶片的总RNA。以棉花 UBQ7为内参基因，通过荧光定量Real time-PCR检测沉默后GhCPK4基因的 被干扰沉默的表达情况。

qRT-PCR分析相关引物及PCR反应程序参考实施例2第1部分“自然情 况下基因GhCPK4的组织表达模式”。

qRT-PCR结果如附图7所示，与空载体(TRV:00)对照相比，在随机选 取的GhCPK4基因VIGS浸染植株中，GhCPK4基因的表达量显著的下降， 沉默效果明显。

4、棉花抗黄萎病接种及抗性鉴定

(1)接种棉花黄萎病菌

将保存的黄萎病致病菌大丽轮枝菌菌株V991在PDA培养基上进行活化。 挑取的菌体于Czapek,s培养液中，25℃，200rpm，培养3～5d。将病原菌培 养液用4层纱布过滤，利用血球计数板统计病原菌浓度，用灭菌双蒸水调整 终浓度至1.0×10

(2)黄萎病发病情况统计

待真叶开始出现变黄、萎蔫时调查统计黄萎病发病情况，采用0～4级方 法统计病级。对每种材料处理30个单株。设3个生物学重复。

病级指数统计参考文献：徐理,朱龙付,张献龙.棉花抗黄萎病机制研究进展. 作物学报,2012,38:1553–1560；Xu L,Zhu L F,Zhang X L.Research on resistancemechanism of cotton to Verticillium wilt.Acta Agron Sin,2012,38:1553–1560.

病情指数＝[(各级病株数×相应病级)/调查总株数×发病最高病级(4)]× 100

试验结果统计：对VIGS侵染2周后的TRV:GhCPK4的沉默植株相比空 载体的对照(TRV:00)植株，接种大丽轮枝菌菌株V991，21d后黄萎病的发病 情况。由附图6B可见，对照(TRV:00)植株与GhCPK4基因沉默株相比叶片 出现浅黄色斑块更多且面积更大，叶缘向下卷曲程度更明显。通过3次生物 学重复观察统计分析，病情指数结果如附图8所示，注射空载体的对照植株， 其平均病情指数达52％，而GhCPK4基因沉默后的植株抗病性显著增强，其 平均病情指数为27％。表明GhCPK4基因参与了黄萎病诱导的过敏反应。在 陆地棉TM-1中沉默GhCPK4基因后，在受到黄萎病病菌浸染时，棉花的发 病率和病指明显降低，说明GhCPK4基因的沉默提高了棉花对黄萎病的抗性。

(3)GhCPK4基因参与黄萎病诱导的过敏反应的验证

为了验证上述表型结果的准确性，本研究继续做了黄萎病菌恢复培养实 验、病植剖杆处理和植株黄萎病菌DNA相对丰度检测。

黄萎病菌恢复培养实验方法为：用剪刀将经黄萎病处理后21d的棉花幼 苗距子叶6cm处的茎剪成1cm长的片段，用70％酒精浸泡1min，再用30％ 双氧水浸泡30min后用无菌水冲洗4-5次，最后将处理后的棉花茎片段放置 于PDA培养基上25℃条件下培养2d，即可观察黄萎病菌恢复培养的生长状 况。

病植剖杆处理方法为：取若干经黄萎病菌接种后21d的棉花茎秆，用锋 利刀片对其进行纵切，暴露出其纵切面，观察茎秆的维管束组织的表型，若 茎秆维管束组织为褐色即表示已感染黄萎病菌并发病，若茎秆维管束组织无 褐色而表型正常即表示未发病。

植株黄萎病菌DNA相对丰度方法为：提取黄萎病处理后的棉花幼苗的茎 的RNA，反转为cDNA后进行qPCR扩增。

所用引物为：

ITS1-F:5’-AAAGTTTTAATGGTTCGCTAAGA-3’，SEQ ID NO：11；

ST-VE1-R:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，SEQ ID NO：12。

反转录及qPCR反应程序条件和程序参考实施例2第1部分“自然情况下 基因GhCPK4的组织表达模式”。

实验结果如附图9-附图12所示，茎秆纵切后发现，注射空载体的对照植 株的茎秆维管束变成淡褐色，而GhCPK4基因沉默后的植株的茎秆维管束为 正常色，TRV:GhCPK4植株材料的剖杆材料褐化程度要低于注射空载体的 TRV:00对照植株材料(附图9)；TRV:GhCPK4植株材料在PDA培养基中 培养出来的黄萎病菌菌落要少于TRV:00植株材料(附图10)；TRV:00对照 植株的黄萎病菌复原率达90％，而TRV:GhCPK4基因沉默后的植株黄萎病菌 复原率达30％(附图11)。TRV:00植株黄萎病菌DNA相对丰度为 TRV:GhCPK4基因沉默后的植株的76倍(附图12)。

这些结果同样表明在沉默GhCPK4基因后，棉花对黄萎病菌的抗性提高， 表明GhCPK4基因参与调控黄萎病的抗性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都 是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 新疆农业科学院核技术生物技术研究所（新疆维吾尔自治区生物技术研究中心）

<120> 钙依赖蛋白激酶基因GhCPK4在植物抗黄萎病中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcaata catgccgtgg atctttaaag gggaaacttc ataagggcga caatcagccc 60

aaagaccatt gttctagccg caacaacact tcttccggcc gttcaaccac caccaccgat 120

tattcccctt ctactttaaa ctctcaacaa ctgattgctc aagaattctc caaagaaacc 180

aaccaaaaag aaacccattt tcctgtcatt aaccctacca agaaagacaa caacaataac 240

accatgagac gtggtattga tcaccaggct tactatgttt tgggtcataa aacacccaac 300

atccgtgacc tttacacttt aggtcgtaag ttaggacaag gacagtttgg gactacttac 360

ttgtgtactg agatctctac aggcactgag tatgcctgta agtctatatc caaaaggaag 420

ttgatctcca atgaggatgt ggaggatgtt cggagggaga ttcagataat gcaccatttg 480

gctggtcata agaatattgt gaccattaaa ggtgcatacg aggatacttt gtatgtgcat 540

attgtgatgg agctttgctc tggaggtgaa ttgtttgatc ggattatcca gagggggcat 600

tactccgaga ggaaagcagc tgaattgact aagatcattg ttggggttgt cgaggcttgt 660

cattcgctcg gggttatgca tagagattta aagcctgaga atttcttgtt agttaacaag 720

gatgatgatt tctctctgaa ggccattgat tttggactct cagtcttctt taaacccggc 780

caagttttta ccgacgtggt tggcagtcca tattacgttg ctccggaagt acttctgaaa 840

cattatggac cagaagcaga tgtatggact gcaggagtta tactctatat attgctaagt 900

ggtgtgccac cattttgggc agaaacacag caaggaatat ttgatgcagt gttaaaagga 960

catattgact ttgattcaga cccttggccc ctaatatctg atagtgcaaa agacctaatt 1020

cgaaagatgt tatgctctcg accttcagag cgactgactg ctcatgaagt attatgtcat 1080

ccttggattt gtgaaaatgg ggttgctcct gatagggccc tggatccagc tgtactttct 1140

cgcctcaaac aattctctgc aatgaataaa ctaaagaaga tggctttacg ggtaatagct 1200

gaaagtcttt ctgaggagga gattgctggt ttaagagaaa tgtttacgtc tatggatact 1260

gataacagtg gtgcaatcac atttgatgaa ctcaaagctg gtttgcgaag atacggctct 1320

accttgaaag atacagagat aagggacctt atggatgcag ctgatgtcga taatagtggg 1380

accattgatt atggagaatt catagctgca acagttcacc ttaataaact agagcgtgag 1440

gagcatctcg ttgctgcatt ccgatacttt gataaggatg gaagtgggta tattacagtt 1500

gatgagcttc aacaagcttg tgctgagcat aacatgacag atgttttgct cgaggatata 1560

atcagagaag ttgatcaaga taatgatgga agaatcgatt atggtgaatt tgttgccatg 1620

atgcaaaaag gcaatgcagg aatcggtaga cgaaccatgc gaaacagtgt gaatataagc 1680

atgagagatg ccccaggtgc tatgtaa 1707

<210> 2

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Asn Thr Cys Arg Gly Ser Leu Lys Gly Lys Leu His Lys Gly

1 5 10 15

Asp Asn Gln Pro Lys Asp His Cys Ser Ser Arg Asn Asn Thr Ser Ser

20 25 30

Gly Arg Ser Thr Thr Thr Thr Asp Tyr Ser Pro Ser Thr Leu Asn Ser

35 40 45

Gln Gln Leu Ile Ala Gln Glu Phe Ser Lys Glu Thr Asn Gln Lys Glu

50 55 60

Thr His Phe Pro Val Ile Asn Pro Thr Lys Lys Asp Asn Asn Asn Asn

65 70 75 80

Thr Met Arg Arg Gly Ile Asp His Gln Ala Tyr Tyr Val Leu Gly His

85 90 95

Lys Thr Pro Asn Ile Arg Asp Leu Tyr Thr Leu Gly Arg Lys Leu Gly

100 105 110

Gln Gly Gln Phe Gly Thr Thr Tyr Leu Cys Thr Glu Ile Ser Thr Gly

115 120 125

Thr Glu Tyr Ala Cys Lys Ser Ile Ser Lys Arg Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Glu Asp Val Glu Asp Val Arg Arg Glu Ile Gln Ile Met His His Leu

145 150 155 160

Ala Gly His Lys Asn Ile Val Thr Ile Lys Gly Ala Tyr Glu Asp Thr

165 170 175

Leu Tyr Val His Ile Val Met Glu Leu Cys Ser Gly Gly Glu Leu Phe

180 185 190

Asp Arg Ile Ile Gln Arg Gly His Tyr Ser Glu Arg Lys Ala Ala Glu

195 200 205

Leu Thr Lys Ile Ile Val Gly Val Val Glu Ala Cys His Ser Leu Gly

210 215 220

Val Met His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Leu Val Asn Lys

225 230 235 240

Asp Asp Asp Phe Ser Leu Lys Ala Ile Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe

245 250 255

Phe Lys Pro Gly Gln Val Phe Thr Asp Val Val Gly Ser Pro Tyr Tyr

260 265 270

Val Ala Pro Glu Val Leu Leu Lys His Tyr Gly Pro Glu Ala Asp Val

275 280 285

Trp Thr Ala Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Val Pro Pro

290 295 300

Phe Trp Ala Glu Thr Gln Gln Gly Ile Phe Asp Ala Val Leu Lys Gly

305 310 315 320

His Ile Asp Phe Asp Ser Asp Pro Trp Pro Leu Ile Ser Asp Ser Ala

325 330 335

Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met Leu Cys Ser Arg Pro Ser Glu Arg Leu

340 345 350

Thr Ala His Glu Val Leu Cys His Pro Trp Ile Cys Glu Asn Gly Val

355 360 365

Ala Pro Asp Arg Ala Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Arg Leu Lys Gln

370 375 380

Phe Ser Ala Met Asn Lys Leu Lys Lys Met Ala Leu Arg Val Ile Ala

385 390 395 400

Glu Ser Leu Ser Glu Glu Glu Ile Ala Gly Leu Arg Glu Met Phe Thr

405 410 415

Ser Met Asp Thr Asp Asn Ser Gly Ala Ile Thr Phe Asp Glu Leu Lys

420 425 430

Ala Gly Leu Arg Arg Tyr Gly Ser Thr Leu Lys Asp Thr Glu Ile Arg

435 440 445

Asp Leu Met Asp Ala Ala Asp Val Asp Asn Ser Gly Thr Ile Asp Tyr

450 455 460

Gly Glu Phe Ile Ala Ala Thr Val His Leu Asn Lys Leu Glu Arg Glu

465 470 475 480

Glu His Leu Val Ala Ala Phe Arg Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly

485 490 495

Tyr Ile Thr Val Asp Glu Leu Gln Gln Ala Cys Ala Glu His Asn Met

500 505 510

Thr Asp Val Leu Leu Glu Asp Ile Ile Arg Glu Val Asp Gln Asp Asn

515 520 525

Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Gly Glu Phe Val Ala Met Met Gln Lys Gly

530 535 540

Asn Ala Gly Ile Gly Arg Arg Thr Met Arg Asn Ser Val Asn Ile Ser

545 550 555 560

Met Arg Asp Ala Pro Gly Ala Met

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 12

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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