缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物及其制备方法和应用。

背景技术

酒精性肝损伤多是由于长期大量饮酒而导致的肝损伤，是临床上较为常见的肝损伤类型。酒精主要在肝脏进行代谢、被氧化成乙醛，而大量的乙醛会造成肝细胞的损害，导致肝脏利用氧能力降低，加速细胞内还原型谷胱甘肽的耗竭而进一步加剧自由基介导的不良反应。大量研究表明，大量酒精摄入会引起血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)等生化指标的显著变化。

活性多糖是指具有某种活性的多糖化合物，广泛存在于植物和微生物细胞壁中，具有毒性小、安全性高、功能广泛的特点。研究表明，活性多糖、活性肽具有很强的抗氧化、清除氧自由基功能，起到保肝的作用，同时也具有免疫调节、抗肿瘤的生物活性。因此，活性多糖、活性肽可以减轻酒精对肝脏的损伤。

如何通过构建慢性酒精性肝损伤小鼠模型，筛选、分离天然活性多糖、天然活性肽成分，并对天然活性多糖、天然活性肽成分组合物进行抗慢性酒精性肝损伤活性评价，优化配方组合对缓解肝损伤的意义重大。

发明内容

本发明的目的是要提供一种采用中医药提取技术、副作用小、疗效独特的缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物，其包括活性多糖及活性肽成分, 所述活性多糖和活性肽的质量百分比为(3-21)：(0.02-0.2)。

上述的一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物，其所述活性多糖包括灵芝活性多糖、人参活性多糖和银耳活性多糖。

上述的一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物，其所述灵芝活性多糖、人参活性多糖和银耳活性多糖的分子量均小于等于15KD，优选的，所述灵芝活性多糖的分子量为3-5kD、人参活性多糖的分子量为3-5kD、银耳活性多糖的分子量为1-3kD。

上述的一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物，其所述活性肽包括结构式为

上述的一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物，其所述牛骨髓肽-1和牛骨髓肽-2的分子量小于等于15KD。

一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)活性多糖的制备：取一定量的灵芝多糖、人参多糖和银耳多糖，分别加入10-20倍重量的纯净水溶解，水溶液用孔径小于等于15kD的透析袋透析，分别收集透析液，冻干制得灵芝活性多糖、人参活性多糖和银耳活性多糖；

(2)活性肽的制备：取牛骨髓肽加入10-20倍重量的纯净水溶解，水溶液用孔径小于等于15kD的透析袋透析，收集透析液，冻干制得牛骨髓肽-1和牛骨髓肽-2；

(3)按照质量百分比为1：(1-10)：(1-10)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1) 的比例称取灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖、牛骨髓肽-1、及牛骨髓肽-2，混和均匀，加去离子水调成固含量为10-15％的浆状液体，浆状液体冻干即制得缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物粉末。

上述的一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物的制备方法，其所述灵芝活性多糖、人参活性多糖和银耳活性多糖的分子量小于等于15KD，优选地，灵芝活性多糖的分子量为3-5kD、人参活性多糖的分子量为3-5kD、银耳活性多糖的分子量为1-3kD。

上述的一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物的制备方法，其所述灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖、牛骨髓肽-1、和牛骨髓肽-2的质量百分比为1：1：1：0.05：0.05。

一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物的应用，其所述缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物粉末添加辅料，制作成适用于缓解慢性酒精性肝损伤的食品、膳食补充剂、功能性食品或药品。

有益效果：

本发明通过简单的、活性评价的方法获得灵芝多糖、人参多糖、银耳多糖及牛骨髓肽最优抗慢性酒精性肝损伤活性成分，然后将5种提取物优化组合用于治疗酒精导致的慢性肝损伤有非常显著的活性，且无副作用。

附图说明

图1本发明牛骨髓肽-1的HPLC-ESI-MS分析图；

图2本发明牛骨髓肽-2的HPLC-ESI-MS分析图；

图3本发明对乙醇所致慢性肝损伤小鼠肝组织中NF-κB p65、IL-1β、TNF- α、IL-6表达的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物，其包括活性多糖及活性肽成分,所述活性多糖和活性肽的质量百分比为(3-21)：(0.02-0.2)。其中，活性多糖包括灵芝活性多糖、人参活性多糖和银耳活性多糖，灵芝活性多糖、人参活性多糖和银耳活性多糖的分子量均小于等于15KD，优选的，所述灵芝活性多糖的分子量为3-5kD、人参活性多糖的分子量为3-5kD、银耳活性多糖的分子量为1-3kD。活性肽包括结构式为

本实施例的制备方法如下：

(1)活性多糖的制备

取灵芝多糖、人参多糖、银耳多糖提取物100g，加入1000-2000g纯净水溶解，水溶液分别用孔径为15kD，10kD，5kD，3kD、1kD透析袋透析，收集不同分子量的透析液，冻干制得不同分子量的灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖。基于构建的慢性酒精性肝损伤小鼠模型评价不同分子量灵芝多糖、人参多糖、银耳多糖的保护活性，实验结果显示，分子量在3-5kD之间的灵芝多糖、分子量在3-5kD之间的人参多糖、分子量在1-3kD之间的银耳多糖对慢性酒精性肝损伤小鼠保护活性最佳。

(2)活性肽的制备

取牛骨髓肽50g，加入500-1000g纯净水溶解，水溶液分别用孔径为15kD， 10kD，5kD，3kD、1kD的透析袋透析，收集不同分子量的透析液，冻干制得不同分子量的牛骨髓肽。基于构建的慢性酒精性肝损伤小鼠模型评价牛骨髓肽透析液冻干物的保护活性。将具有最佳保护活性的牛骨髓肽进一步经HPLC分析，制备牛骨髓肽-1和牛骨髓肽-2。牛骨髓肽-1的结构式为

参照图1，牛骨髓肽-1：HPLC-ESI-MS分析其分子质量为766.3820；离子m/z748.3180为[M-H2O+H]

参照图2，牛骨髓肽-2：HPLC-ESI-MS分析其分子质量为811.3761；离子m/z285.1325为y5，离子m/z 470.2461为b3，离子m/z 527.2581为y3；离子m/z 793.3729为[M-NH2+H]

(2)根据配方称取：分子量在3-5kD之间的灵芝多糖1g、分子量在3-5 kD之间的人参多糖1g、分子量在1-3kD之间的银耳多糖1g、牛骨髓肽-1 0.05 g、牛骨髓肽-2 0.05g。将制备好的上述配方进行混合均匀，加去离子水调成固含量为10-15％的浆状液体，浆状液体经过冻干即可制成本实施例的组合物粉末。

本实施例制得的缓解慢性酒精性肝损伤的活性组合物粉末添加辅料，制作成适用于缓解慢性酒精性肝损伤的食品、膳食补充剂、功能性食品或药品。

本发明通过简单的、活性评价的方法获得灵芝多糖、人参多糖、银耳多糖及牛骨髓肽最优抗慢性酒精性肝损伤活性成分，然后将5种提取物优化组合用于治疗酒精导致的慢性肝损伤有非常显著的活性，且无副作用。

应用效果实验

取小鼠40只，雌雄各20只，随机分为5组，每组8只，分别为空白组、模型组、活性多糖组(由等质量的分子量在3-5kD之间的灵芝多糖、分子量在 3-5kD之间的人参多糖、分子量在1-3kD之间的银耳多糖组成)、活性肽组(由等质量的牛骨髓肽-1、牛骨髓肽-2组成)以及本实施例的活性多糖、活性肽组合物组。实验进行如下，除空白组，模型组、活性多糖组、活性肽组以及活性多糖、活性肽组合物组小鼠每天灌胃白酒(酒精:水-v:v-53:47)8mL/kg(约3.5 g/kg)一次，灌胃白酒前2h灌胃相应药物(10mg/kg/d)或等容积蒸馏水，灌胃体积均为0.2mL/10g。于造模第56天禁食12h，第57天给予白酒后4h，断头取血，同时立即取肝脏，用冰冷的生理盐水冲尽残血，滤纸拭干。称取剩余部分肝脏0.5g，加入5.0mL生理盐水制成10％肝匀浆，按试剂盒说明书方法测定肝匀浆内SOD、GSH-PX、GSH、丙二醛(MDA)、NF-κBp65、IL-1β、TNF-α含量。分离血清，按试剂盒说明书方法测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转移酶(γ-GT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白固醇(LDL-C)、IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MDA、GSH-PX 及GSH的含量。

结果如下：

表1活性多糖、活性肽组合物对乙醇所致慢性肝损伤小鼠肝脏组织中SOD、 MDA、GSH-PX及GSH的影响

由表1可看出，与正常对照组比较，模型组GSH含量及SOD、GSH-Px活力明显降低(p<0.05)，MDA含量明显增加(p<0.05)，说明饮酒导致小鼠肝脏受到严重的氧化损伤。而通过活性多糖、活性肽组合物的治疗，与酒精模型组相比，活性多糖、活性肽组合物组GSH含量及SOD、GSH-Px活力明显升高(p<0.05)， MDA含量明显降低(p<0.05)。且活性多糖、活性肽组合物的保护活性比单独使用活性多糖或活性肽治疗效果更佳。

表2活性多糖、活性肽组合物对乙醇所致慢性肝损伤小鼠肝脏组织中 NF-κB p65、IL-1β、TNF-α、TLR4的影响

酒精引起的氧化损伤还可以继发性激活肝脏炎症反应，导致释放大量炎症介质和细胞因子，氧化损伤活化转录因子NF-κB，NF-κB核转位活化促进靶基因的表达，产生急性期蛋白、酶类、细胞因子、化学因子、黏附因子、生长因子等。TNF-α和IL-1β是由肝细胞表达和分泌的主要前炎性细胞因子，能促进其他细胞因子的表达，引起炎症反应和组织损伤。细胞因子和炎症介质可能引起肝细胞凋亡、炎症甚至坏死，进一步增加了肝组织损伤。

我们发现，酒精性肝损伤小鼠肝组织的TNF-α、IL-1β和NF-κB含量增加，说明酒精性肝损伤可能与炎症损伤有关。而活性多糖、活性肽组合物降低了肝组织中NF-κB和炎症因子TNF-α、IL-1β水平。这可能是活性多糖、活性肽组合物的抗氧化性质，去除了氧化应激的启动因素，导致炎症因子产生减少，也可能是活性多糖、活性肽组合物直接作用炎症的某个环节引起炎症反应降低。且活性多糖、活性肽组合物的保护活性比单独使用活性多糖或活性肽治疗效果更佳。

表3活性多糖、活性肽组合物对乙醇所致慢性肝损伤小鼠模型血清中SOD、 MDA、GSH-PX及GSH的影响

由表3可看出，酒精性肝损伤小鼠肝组织的氧化指标MDA明显升高，抗氧化指标(GSH、GSH-Px、SOD)明显降低。证实酒精摄入可引起肝脏出现氧化应激，抗氧化能力减弱。而活性多糖、活性肽组合物可以改善这种状况，说明活性多糖、活性肽组合物有很强的抗氧化、清除自由基的作用。

表4活性多糖、活性肽组合物对乙醇所致慢性肝损伤小鼠模型血清中ALT、 AST、γ-GT的影响

血清中ALT、γ-GT和AST水平常被用作衡量酒精引起的肝脏损伤的生化指标。表4显示，模型组小鼠的血清中ALT、γ-GT和AST水平明显上升(p<0.05) 说明饮酒导致小鼠肝脏功能明显降低。活性多糖、活性肽组合物能够显著降低小鼠血清中ALT和AST水平(p<0.05)，起到了保护肝脏的作用。

表5活性多糖、活性肽组合物对乙醇所致慢性肝损伤小鼠血清中IL-6， IL-1β及TNF-α的影响

由表5可看出，与空白对照组相比，模型组IL-6，IL-1β及TNF-α含量显著升高，说明酒精导致小鼠受到严重的炎性损伤。而通过活性多糖、活性肽组合物治疗，与酒精组相比，活性多糖、活性肽组合物治疗组IL-6，IL-1β及 TNF-α含量显著降低。且活性多糖、活性肽组合物的保护活性比单独使用活性多糖或活性肽治疗效果更好。

表6活性多糖、活性肽组合物对乙醇所致慢性肝损伤小鼠血清中TC、TG及 LDL-C的影响

血脂异常是以TC、TG、LDL-C水平升高以及HDL-C水平降低为特征的异常脂质代谢，是代谢综合征的一个组成部分，也是心血管疾病的强预测因子。如表6显示，小鼠长时间饮食酒精会引起血清中TC、TG、LDL-C的显著上升，造成血脂异常。活性多糖、活性肽组合物表现出良好的调节作用，能够显著的降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平。

参照图3，酒精性肝损伤的发病与内毒素-Toll样受体(TLRs)通路密切相关。肝细胞上大量分布的TLR4是唯一能通过MyD88依赖性途径与非依赖性途径进行胞内转导的Toll样受体。NF-κB激活后由胞质转入胞核中诱导促炎因子如 TNF-α、IL-6等细胞因子的表达，进而使中性粒细胞、枯否细胞及肝星状细胞聚集、增殖、活化，并产生活性氧自由基及趋化因子、炎症因子，诱导下游级联反应，引起细胞损伤，加快肝脏病变的进程。

本次实验中，模型组小鼠肝组织NF-κB p65、IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显著上升，活性多糖、活性肽组合物能显著降低肝损伤小鼠血清中IL-1β、 TNF-α、IL-6、TLR4含量，降低肝组织中的NF-κB p65、IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达，结果表明TLR4浓度的降低使得下游通路上的NF-κB有一定减少，从而使炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6亦有一定减少，提示活性多糖、活性肽组合物对慢性酒精性肝损伤小鼠的具有很好的保护作用。且活性多糖、活性肽组合物的保护活性比单独使用活性多糖或活性肽治疗效果更好。

慢性毒性试验

1、试验动物：昆明种小鼠，体重21±2g，由广东省实验动物中心提供

2、药物：本发明的活性多糖、活性肽组合物。

3、试验方法：根据国家药品监督管理局颁布修订的“中药新药研究技术要求”，对本发明的活性多糖、活性肽组合物进行慢性毒性实验。因受药物浓度及体积限制，无法测定LD50，故进行最大给药量实验。取昆明种小鼠30只，雌性各半，灌胃给予活性多糖、活性肽组合物1g/mL，每只0.8mL，即小鼠的最大灌胃体积用药后观察小鼠活动状态、饮食、粪便、呼吸、体重及死亡情况，连续观察14d。

4、试验结果：各组小鼠灌胃给药后生长良好，体重增加，行为正常，均未见死亡及明显反应。将动物处死后，肉眼观察各主要脏器无异常现象。

结果表明，本发明的活性多糖、活性肽组合物最大剂量口服应用，对动物无明显损害，未发现对机体产生的毒性反应，是一种安全可靠的药物(膳食补充剂)。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于，灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖、牛骨髓肽-1、及牛骨髓肽-2的质量百分比为1：10：10：0.1：0.1。灵芝活性多糖分子量为5KD、人参活性多糖分子量为5KD、银耳活性多糖分子量为5KD。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于，灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖、牛骨髓肽-1、及牛骨髓肽-2的质量百分比为1：10：10：0.05： 0.05。灵芝活性多糖分子量为15KD、人参活性多糖分子量为15KD、银耳活性多糖分子量为10KD。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于，灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖、牛骨髓肽-1、及牛骨髓肽-2的质量百分比为1：1：10：0.01：0.01。灵芝活性多糖分子量为1-3KD、人参活性多糖分子量为1-3KD、银耳活性多糖分子量为1-3KD。

实施例5

本实施例与实施例1的不同之处在于，灵芝活性多糖、人参活性多糖、银耳活性多糖、牛骨髓肽-1、及牛骨髓肽-2的质量百分比为1：1：10：0.05：0.1。灵芝活性多糖分子量为3-5KD、人参活性多糖分子量为3-5KD、银耳活性多糖分子量为3-5KD。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。