一种检测中东呼吸综合征病毒的MERS冻干管及其制备方法、冻干试剂盒

技术领域

本发明涉及中东呼吸综合征检测领域，具体涉及了一种检测中东呼吸综合征病毒的 MERS冻干管及其制备方法、冻干试剂盒。

背景技术

中东呼吸综合征是冠状病毒引起的病毒性肺炎的一种呼吸道传染病。首先是2012年在沙特被发现的，它的症状类似于SARS，和最近流行的新型冠状病毒肺炎，由于它是在中东地区发生的，所以称之为MERS，MERS简称为MERS。症状和SARS还有新冠肺炎相似，主要都是发热、咽痛、乏力、咳嗽，严重的情况可以出现呼吸困难、呼吸窘迫，甚至可以引起呼吸衰竭，严重的可以危及生命，也可以引起多脏器的损害。相对于SARS流行强度要弱一些，但是也是近几年来比较著名的传染病，共同的特点都是冠状病毒的感染。

中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)属于冠状病毒科,β类冠状病毒的2c亚群，是一种具有包膜、基因组为线性非节段单股正链的RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为120-160nm。基因组全长约30kb。目前已经完成多株MERS-CoV的全基因组序列测定，目前可通过测序、荧光定量PCR等方法进行检测，荧光定量PCR方法目前均采用液态反应体系试剂盒。

如中国发明专利CN109371174A公开的一种特异性检测样品中中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg

又如中国发明专利CN105624335A公开了一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术同时检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因。试剂盒主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、 DEPC H2O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。引物探针混合液由UPE和N基因特异性的正、反向引物，特异性的探针组成，其特征在于UPE基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-TTTCCACTGTTTTCGTGCC-3’和5’-GACCCATAGTAGCGCAGAG-3’；UPE 基因特异性的探针的序列是5’-CAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAG-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；N基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GTGCTGTTTCCTTTGCCGATA-3’和5’-GGTAAGCCCAGTGTACCAAG-3’；N基因特异性的探针的序列是5’-ACAGTGTTATTTGGTGCAGCTCGTGGTT-3’，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。

但是包括上述专利技术在内的现有用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒均是液体保存形式，使用时需要反复冻融，就会影响试剂性能，且需要-20℃保存条件，运输需要干冰等保护措施。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种检测中东呼吸综合征病毒的 MERS冻干管及其制备方法、冻干试剂盒。本发明将采用酶、buffer、引物探针、dNTP、冻干保护剂等全预混成冻干反应体系形成冻干型试剂盒，可于4-25℃稳定保存。如此，可以快速、高效、定性的检测样本中的中东呼吸综合症冠状病毒，而且全封闭反应，仅一次加样操作；本发明为冻干试剂盒，可实现常温保存和运输。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

第一方面，一种检测中东呼吸综合征病毒的冻干试剂盒，所述试剂盒包括MERS冻干管、 MERS阳性对照和阴性对照，所述MERS冻干管包括Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

所述MERS阳性对照包括具有目标基因的质粒；

所述引物探针混合物包括有正向引物、反向引物和寡核苷酸探针，且正向引物、反向引物和寡核苷酸探针的序列分别为：

正向引物序列：TTAGAGACTCCCTGCCGCTGTA

反向引物序列：GAATCTTTCTTCGCAATGCCTATG

寡核苷酸探针序列：CTTCACAAGGGTTTGTGGTGGTCAAT。

在本发明中，进一步地，所述冻干保护剂为5％海藻糖、3％甘露醇、1％BSA、2％乳糖何 0.1％tween80。

在本发明中，进一步地，所述阴性对照为无菌TE溶液。

在本发明中，进一步地，所述寡核苷酸探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。

在本发明中，进一步地，所述目标基因为orf1ab基因。

一种检测中东呼吸综合征病毒的MERS冻干管，所述MERS冻干管包括Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

一种检测中东呼吸综合征病毒的MERS冻干管的制备方法，其包括以下步骤：

(1)配制冻干反应体系：Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

(2)分装：将步骤(1)的冻干反应体系定量分装到反应管；

(3)冻干：将步骤(2)的反应管置于冷冻干燥机进行冻干程序，最后封装。

在本发明中，进一步地，每一所述反应管内装有20μl所述冻干反应体系。

在本发明中，进一步地，所述冻干程序具体为：

A、预冷：板层预冷至3～5℃，保持9～10min；接着，冷却至-50～-40℃，保持170～190min；

B、一次干燥：先在-45～-35℃进行冷冻干燥180～220min；接着，升温至-12～-8℃进行冷冻干燥500～550min；

C、解析干燥：升温至20～25℃，保持280～320min。

在本发明中，进一步地，所述冻干程序具体为：

A、预冷：板层预冷至4℃，保持10min；接着，冷却至-45℃，保持180min；

B、一次干燥：先在-40℃进行冷冻干燥200min；接着，升温至-10℃进行冷冻干燥520min；

C、解析干燥：升温至25℃，保持300min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将采用酶、buffer、引物探针、dNTP、冻干保护剂等全预混成冻干反应体系形成冻干型试剂盒，可于4-25℃稳定保存，可保存12个月。如此，可以快速、高效、定性的检测样本中的中东呼吸综合症冠状病毒，而且全封闭反应，仅一次加样操作；本发明为冻干试剂盒，可实现常温保存和运输，摆脱液体式冷链的运输，有利于保障偏远地区运输保存。

附图说明

图1为本发明MERS冻干试剂盒在1.0×10

图2为本发明MERS冻干试剂盒验证试剂盒的最低检出限的PCR扩增曲线图；

图3为本发明MERS冻干试剂盒验证试剂盒的批内精密度的PCR扩增曲线图；

图4为本发明MERS冻干试剂盒进行特异性实验的PCR扩增曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化学、免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。

下面各实施例以新型冠状病毒为例对本发明进行详细的说明，但可以理解的是，本发明并不仅仅适用于新型冠状病毒。各实施例中的试剂盒制备过程中涉及到的条件参数如微球粒径、结合垫处理液、样品稀释液及划膜条件等等仅是一种实施方式，具体实现时并不局限于此，即并非本发明的特别限定。

实施例一

本实施例提供了一种检测中东呼吸综合征病毒的冻干试剂盒，所述试剂盒包括MERS冻干管(8×3管)、MERS阳性对照1管和阴性对照1mL/管，所述MERS冻干管包括Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

其中，

所述冻干保护剂包括3％海藻糖、3％甘露醇、2％BSA、1％乳糖、0.1％tween80。

以orf1ab基因为目标基因，设计和筛选了一组特异性引物和探针，采用BLAST软件进行比对，结果表明，正向引物、反向引物和寡核苷酸探针与数据库中的中东呼吸综合症冠状病毒对应的序列吻合，与其他病毒序列无明显交叉。具体地，所述引物探针混合物包括正向引物、反向引物和寡核苷酸探针，它们的序列分别为：

正向引物序列：TTAGAGACTCCCTGCCGCTGTA

反向引物序列：GAATCTTTCTTCGCAATGCCTATG

寡核苷酸探针序列：CTTCACAAGGGTTTGTGGTGGTCAAT，

上述寡核苷酸探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。

上述检测中东呼吸综合征病毒的MERS冻干管的制备方法，其包括以下步骤：

(1)配制冻干反应体系：

配制核酸检测PCR反应试剂混合液，其包含有Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

(2)分装：将步骤(1)的冻干反应体系按20μl/管定量分装到反应管；

(3)冻干：将步骤(2)的反应管置于冷冻干燥机进行冻干程序，最后封装；

所述冻干程序具体为：

所述MERS阳性对照包括具有目标基因orf1ab基因的质粒。

所述阴性对照为无菌TE溶液。

检测步骤

1.核酸提取

采用商品化病毒RNA核酸提取试剂盒进行提取，提取物为待测样本模板。

2.添加模板

按照待测样本数量取MERS冻干粉管，加入25μL样本模板，顺序为MERS阴性对照、待测样本模板、MERS阳性对照。盖紧管盖，离心30秒，立即进行扩增反应。

3.扩增反应

按照下表进行PCR仪程序设定；选择FAM通道(Reporter：FAM)检测；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。

注：若使用ABI荧光定量PCR仪，不选ROX校正，淬灭基团选None。

4.结果判定

分析条件设置：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。

如果阳性对照扩增曲线有明显对数扩增曲线，且Ct值≤30，阴性对照无明显扩增曲线，二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效。

实施例二

本实施例提供了一种检测中东呼吸综合征病毒的冻干试剂盒，所述试剂盒包括MERS冻干管(8×3管)、MERS阳性对照1管和阴性对照1mL/管，所述MERS冻干管包括Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

其中，

所述冻干保护剂包括6％海藻糖、1％甘露醇、1％BSA、3％乳糖、0.2％tween80。

以orf1ab基因为目标基因，设计和筛选了一组特异性引物和探针，采用BLAST软件进行比对，结果表明，正向引物、反向引物和寡核苷酸探针与数据库中的中东呼吸综合症冠状病毒对应的序列吻合，与其他病毒序列无明显交叉。具体地，所述引物探针混合物包括正向引物、反向引物和寡核苷酸探针，它们的序列分别为：

正向引物序列：TTAGAGACTCCCTGCCGCTGTA

反向引物序列：GAATCTTTCTTCGCAATGCCTATG

寡核苷酸探针序列：CTTCACAAGGGTTTGTGGTGGTCAAT，

上述寡核苷酸探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。

上述检测中东呼吸综合征病毒的MERS冻干管的制备方法，其包括以下步骤：

(1)配制冻干反应体系：

根据中东呼吸综合征病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液，其包含有Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

(2)分装：将步骤(1)的冻干反应体系按20μl/管定量分装到反应管；

(3)冻干：将步骤(2)的反应管置于冷冻干燥机进行冻干程序，最后封装；所述冻干

程序具体为：

所述MERS阳性对照包括具有目标基因orf1ab基因的质粒。

所述阴性对照为无菌TE溶液。

检测步骤与实施例一的检测步骤相同，在此不再详述。

实施例三

本实施例提供了一种检测中东呼吸综合征病毒的冻干试剂盒，所述试剂盒包括MERS冻干管(8×3管)、MERS阳性对照1管和阴性对照1mL/管，所述MERS冻干管包括Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

其中，

所述冻干保护剂包括8％海藻糖、5％甘露醇、0.1％BSA、2％乳糖、0.05％tween80。

以orf1ab基因为目标基因，设计和筛选了一组特异性引物和探针，采用BLAST软件进行比对，结果表明，正向引物、反向引物和寡核苷酸探针与数据库中的中东呼吸综合症冠状病毒对应的序列吻合，与其他病毒序列无明显交叉。具体地，所述引物探针混合物包括正向引物、反向引物和寡核苷酸探针，它们的序列分别为：

正向引物序列：TTAGAGACTCCCTGCCGCTGTA

反向引物序列：GAATCTTTCTTCGCAATGCCTATG

寡核苷酸探针序列：CTTCACAAGGGTTTGTGGTGGTCAAT，

上述寡核苷酸探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。

上述检测中东呼吸综合征病毒的MERS冻干管的制备方法，其包括以下步骤：

(1)配制冻干反应体系：

根据中东呼吸综合征病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液，其包含有Taq酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Buffer、引物探针混合物、dNTP、MgCl

(2)分装：将步骤(1)的冻干反应体系按20μl/管定量分装到反应管；

(3)冻干：将步骤(2)的反应管置于冷冻干燥机进行冻干程序，最后封装；

所述冻干程序具体为：

所述MERS阳性对照包括具有目标基因orf1ab基因的质粒。

所述阴性对照为无菌TE溶液。

检测步骤与实施例一的检测步骤相同，在此不再详述。

实施例4试剂盒的线性实验

目标靶标探针标记为FAM荧光基团，本发明试剂盒的FAM通道的线性参比品，由含有目的片段的质粒组成，采用TE缓冲液将阳性质粒进行10倍的梯度稀释得到下列梯度溶液(S1：1.0×10

实施例5试剂盒的最低检出限实验

该实验验证试剂盒的最低检出限，采用线性参比品中的S6：1.0×10

实施例6试剂盒的精密度实验

该实验验证试剂盒的批内精密度，采用线性参比品中的S4：1.0×10

实施例7试剂盒的特异性实验

该实验选择与中东呼吸综合症病毒具有相似感染症状的常见病原体作为特异性参考品，采用的是灭活阳性样本。特异性参考品分别为甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒、合胞体病毒、副流感病毒、腺病毒、人基因组。利用深圳市易瑞生物技术有限公司研发的通用性病毒DNA/RNA提取试剂盒提取以上灭活样本中的DNA/RNA作为模板进行实验，实验数据表明这7种特异性参考品均未有典型的“S”型扩增曲线，说明该试剂盒特异性良好，实验结果PCR扩增曲线图参考图4。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。