一种非靶向代谢组学区分卷柏品种真伪的方法及应用

技术领域

本发明涉及卷柏鉴别方法，特别是一种非靶向代谢组学区分卷柏品种真伪的方法及应用。

背景技术

《中国药典》收录，中药卷柏的正品基源为卷柏科植物卷柏[Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring]或垫状卷柏[Selaginella pulvinata(Hook，etGrev.)Max1m.]的干燥全草(药典引用)。作为传统活血化瘀药材，卷柏是在临床应用广泛，可用于治疗经闭痛经、癥瘕痞块和跌扑损伤。

然而，调研发现目前市售卷柏的品种混乱，鱼龙混杂，良莠不齐，卷柏常见混淆品种有翠云草(Selaginella uncinata)、深绿卷柏(Selaginella doederleinii)、薄叶卷柏(Selaginella delicatula)和江南卷柏(Selaginella moellendorffii)等，这些混淆品也来源于卷柏属，外观形态性状上与正品卷柏类似。尤其混淆品药材切成饮片或粉碎成粉末后，肉眼更难以区分鉴别卷柏真伪。这些混淆品极大扰乱卷柏市场秩序，影响卷柏在临床上合理高效使用。

目前，中药的形态特征和性状观察仍然是卷柏真伪区分的主要方法，实践表明肉眼观察可靠性差，难以区分鉴别卷柏真伪。近十多年来，尽管基因组学等多种分子标记已经在卷柏上得到了一定的应用，但是相关试剂昂贵、步骤繁琐、技术难度大、费时费力，难以快速简洁开展卷柏真伪鉴别，因此亟需高效准确快捷的卷柏的鉴定手段。《中国药典》采用高效液相法，对穗花衫双黄酮进行卷柏质量控制，但是穗花衫双黄酮在混淆品也有分布，不能因此区分卷柏和混淆品，不适合作为质量控制标准。

非靶向代谢组学(Untargeted Metabolomics)是以先进的液质联用或核磁共振分析检测手段，获取分析样品中的代谢物图谱，比较代谢物含量差异，从差异代谢物中可系统筛选一些特异性生物标志物。作为一种系统综合的分析方法，代谢组学在中药品种比较、真伪区分、优劣等级划分和质量控制应用广泛。本研究尝试采用代谢组学区分卷柏和其混淆品种的化学表型，比较卷柏和其混淆品种的化学成分异同，快速准确筛选卷柏和其混淆品种的特异性标志物，从而使药用卷柏品种正本清源。

现有技术中公开了众多卷柏提取物的提取方法均较繁琐，导致特异性标志物损耗较大，定量结果不准确，并不能有效提取出卷柏和其混淆品种的特异性标志物。比如公开号为CN101461829B的专利公开了一种卷柏提取物及其提取方法和应用，提取物由以下方法提取而得，将卷柏全草用溶剂重复冷浸2-4次，每次6-8天，过滤，合并滤液，用萃取剂萃取2-4次，得有效部位；将有效部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，经洗脱，TLC检测合并含有穗花衫双黄酮部分，在Sephadex LH-20柱色谱以丙酮进行洗脱，得到单体化合物穗花衫双黄酮。公开号为CN101712604A的专利公开了所述垫状卷柏提取物的提取方法，步骤包括：1)取垫状卷柏全草，用75％乙醇回流提取两次，回收溶剂，得浑浊浓缩液，静置72h，过滤；2)将步骤1)得到的滤液依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后残留滤液进行聚酰胺柱层析，分别用30％、60％、95％乙醇-水梯度洗脱；3)取步骤2)60％醇洗部分进行聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱，再经制备液相色谱洗脱，70％甲醇为流动相，分离提取得到两种新的化合物垫状卷柏醛及垫状卷柏二酚。公开号为CN105954377A的专利公开了一种卷柏中穗花双黄酮的提取方法，包括以下步骤：步骤1：将卷柏粉碎后，过筛；步骤2：称取0.2重量份卷柏粉，与1重量份的硅藻土混合均匀待用；步骤3：将步骤2得到的混合物放入预先放好过滤膜的萃取池中，加入适量的硅藻土至达到萃取池的池口；盖上萃取池的盖子进行静态萃取；萃取结束后得到萃取液；萃取条件为：萃取溶剂为甲醇；萃取温度110℃；静态萃取时间5min；冲洗体积80％；静态循环次数3次。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种非靶向代谢组学区分卷柏品种真伪的方法及应用，鉴定卷柏已知品种，进行卷柏新品种、相似品种及品种真伪的鉴定。

本发明公开了一种非靶向代谢组学区分卷柏品种真伪的方法，包括以下步骤：

S1、分别将卷柏和卷柏混淆品粉碎，分别加入体积浓度为55～85％v/v的甲醇溶液回流提取，滤过，取滤液，分别制得卷柏提取液和卷柏混淆品提取液；

S2、卷柏提取液的检测分析：通过超高效液相色谱串联高分辨率质谱对卷柏提取液与卷柏混淆品提取液进行数据的采集，获得代谢物检测多峰图，对色谱峰进行峰提取与校正，获取所有代谢物的相对峰面积与保留时间；

S3、代谢组学区分筛选卷柏和混淆品化学表型，筛选卷柏特异性标志物：采用多元统计法进行分析，依次进行主成分分析、层次聚类分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析，最后根据变量权重值和t检验中P值分析筛选差异标志物，得到鉴别模型区分卷柏与卷柏混淆品；

S4、基于超高效液相色谱-质谱仪测定S3中确定的差异标志物的含量，建立卷柏的质量标准。

本发明利用非靶向代谢组学技术分析技术获得不同卷柏品种内源性小分子代谢物峰面积数据库，通过多元统计分析，筛选卷柏区分混淆品的显著性差异代谢物，并生成可视化的图谱，除了可以鉴定卷柏已知品种，还可进行卷柏新品种、相似品种及品种真伪的鉴定。

本发明所采用的PCA、OPLS-DA与对比文件CN110398545A原理一致，但筛选对象和达到的目的不同，实现的技术效果是寻找到了区分卷柏品种真伪的特异性标志物。本发明的技术难点在于如何确定卷柏与卷柏混淆品样品的提取方法和超高效液相色谱串联高分辨率质谱的检测参数，使得提取出卷柏与卷柏混淆品的差异标志物，并能用超高效液相色谱串联高分辨率质谱检测得出。

进一步地，S1中甲醇溶液的体积浓度为65～75％v/v。该体积浓度的甲醇溶液能最大限度地提取出差异标志物Selaginellin和Selaginellin A。

进一步地，S1中回流提取的时间为30～75min。进一步优选地，S1中回流提取的时间为50～70min。该回流提取的时间能最大限度地提取出差异标志物Selaginellin和Selaginellin A。

进一步地，为了充分提取出差异标志物Selaginellin和Selaginellin A，S1中卷柏样品或卷柏混淆品样品与甲醇溶液的质量体积比为0.2～0.4g：30mL。进一步优选地，卷柏样品或卷柏混淆品样品与甲醇溶液的质量体积比为0.27～0.33：30mL。

进一步地，S2中，所述超高效液相色谱串联高分辨率质谱为超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱，色谱柱为C18，1.8μm，2.1mm×100mm；

色谱条件为：流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱的程序为0～10min，5～15％乙腈；10～20min，15％～35％乙腈；20～30min，35％～55％乙腈；30～40min，55％～85％乙腈；40～45min，85％～95％％乙腈；45～50min，95％～95％％乙腈；流速0.36～0.44mL/min；柱温22～27℃；进样体积为1.8～2.2μL；质谱主要包括：正离子模式检测，电喷雾离子源温度325℃，质谱电压4000V，帘气35psi，一级质谱扫描范围：50～1100m/z；二级质谱在一级扫描基础上选择前3强进行诱导碰撞解离获得二级质谱数据。

进一步地，S4中所述超高效液相色谱和串联质谱仪为超高效液相色谱三重四级杆质谱，色谱柱为C18，1.8μm，2.1mm×100mm；色谱条件为：流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱的程序为0～8min，20～60％乙腈；8～11min，60％～95％乙腈；11～18min，95％～95％乙腈；流速0.36～0.44mL/min；柱温23～27℃；进样体积为1.8～2.2μL；质谱主要包括：正离子MRM扫描方式，其中513.2→297.1为Selaginellin的定量离子，碰撞能量为22V，513.2→419.2为Selaginellin的定性离子，碰撞能量为42V，483.2→389.1为SelaginellinA的定量离子，碰撞能量为28V，483.2→271.1为Selaginellin A的定性离子，碰撞能量为40V。

步骤二色谱条件是为了非靶向寻找特异性标志物，步骤四是为了靶向测定特异性标志物的含量。

本发明采用该色谱条件相比常规的卷柏检测色谱条件能更加全面地测定卷柏中各种成分，采用常规的卷柏检测色谱条件，只能针对测定卷柏的穗花杉双黄酮含量。本发明对比了不同流动相种类，0.1％甲酸水溶液-乙腈，水-乙腈和10Mm醋酸铵水溶液-乙腈，梯度洗脱，最终确定制备步骤如上。

进一步地，S3中，以变量重要性>1，显著性水平<0.05作为门槛值获取差异标志物。变量重要性(VIP)是衡量代谢物对于分组分型贡献度的指标，VIP越大，对于分组贡献越大。显著性水平(P)是评价代谢物相对含量(峰面积)在两组差异性的，P越小，代谢物相对含量(峰面积)在两组差异性越大。

进一步地，S4中，测定的差异标志物为Selaginellin和Selaginellin A。

本发明通过对照品鉴定Selaginellin和Selaginellin A仅存在于卷柏中，为卷柏特异性标志物。

在正离子模式下，差异标志物排名前两位的为Selaginellin和Selaginellin A。

步骤(3)中采用主成分分析(PCA)和层次聚类分析(HCA)区分卷柏和混淆品化学表型。

本发明还公开了差异标志物Selaginellin和Selaginellin A作为鉴别卷柏和卷柏混淆品的标志物的应用。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：

(1)本发明方法利用广泛靶向代谢组学分析技术获得卷柏和混淆品中的次生代谢产物，基于多元统计分析，筛选鉴别卷柏和混淆品的特异性标志代谢物，可以清晰地展示卷柏和混淆品的化学成分差异，具有很好的区分卷柏和混淆品的效果，为卷柏品种的鉴定和质量评价提供了一种优良的方法。

(2)本发明方法建立了多反应监测的卷柏特异性标志物含量测定方法，可进行卷柏品种的质量评价和质量控制。

附图说明

图1是卷柏和混淆品PCA得分图，其中(JB)表示卷柏，(CYC)表示翠云草，(JN)表示江南卷柏，(SL)表示深绿卷柏。

图2是卷柏和混淆品翠云草OPLS-DA得分图( a )、置换检验图( b )和s-plot图(c )，其中(JB)表示卷柏，(CYC)表示翠云草。

图3是卷柏和混淆品深绿卷柏OPLS-DA得分图( a )、置换检验图( b )和s-plot图( c )，其中(JB)表示卷柏，(SL)表示深绿卷柏。

图4是卷柏特异性标志物在卷柏和混淆品色谱图，其中(JB)表示卷柏，(CYC)表示翠云草，(JN)表示江南卷柏，(SL)表示深绿卷柏。

图5是卷柏特异性标志物Selaginellin和Selaginellin A的结构式。

图6是50％甲醇溶液、70％甲醇溶液、100％甲醇溶液分别提取得到的卷柏提取液的液相色谱图。

图7是超声提取60分钟、回流提取时间60分钟分别提取得到的卷柏提取液的液相色谱图。

图8是回流提取时间30分钟、回流提取时间45分钟、回流提取时间60分钟、回流提取时间75分钟分别提取得到的卷柏提取液的液相色谱图。

具体实施方式

步骤(1)中卷柏和卷柏混淆品样品的制备步骤为：将样品粉碎，每0.27～0.33g样品粉末加甲醇溶液30mL，密塞，称定重量，回流提取，冷却，用甲醇补重，滤过，取续滤液，即得。

本发明样品的制备步骤考察了不同提取溶剂(50％甲醇，70％甲醇和100％甲醇)、不同提取方式(超声和回流提取)和提取时间(30分钟、45分钟、60分钟和75分钟)。

如图6所示，70％甲醇溶液可提取得到卷柏特异性标志物Selaginellin和Selaginellin A，但是50％甲醇和100％甲醇无法提取得到卷柏特异性标志物。

如图7所示，回流提取时间60分钟能够提取出Selaginellin和Selaginellin A，但是超声提取60分钟提取得到的Selaginellin和Selaginellin A的量极少，从图中看不到明显的峰。

如图8所示，回流提取的时间为50～75min时，提取到的卷柏特异性标志物含量较高。

因此，最终确定最优的制备步骤为将样品粉碎，每0.27～0.33g样品粉末加70％甲醇溶液30mL，密塞，称定重量，回流提取，冷却，用70％甲醇补重，滤过，取续滤液，即得。

实施例1

下面结合附图对本发明进一步说明。

1.卷柏和卷柏混淆品样品的制备：

将卷柏和卷柏混淆品粉碎，每0.27～0.33g样品粉末加70％甲醇溶液30mL，密塞，称定重量，回流提取，冷却，用甲醇补重，滤过，取续滤液，18000g×4度离心，取上清即得。

2.卷柏和卷柏混淆品样品成分的LC-MS检测：

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC RBEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱的程序为0～10min，5～15％乙腈；10～20min，15％～35％乙腈；20～30min，35％～55％乙腈；30～40min，55％～85％乙腈；40～45min，85％～95％％乙腈；45～50min，95％～95％％乙腈；流速0.36～0.44mL/min；柱温22～27℃；进样体积为1.8～2.2μL；

质谱主要包括：正离子模式检测，电喷雾离子源温度325℃，质谱电压4000V，帘气35psi，一级质谱扫描范围：50～1200m/z；二级质谱在一级扫描基础上选择前3强进行诱导碰撞解离(CID)获得二级质谱数据。

(3)代谢组学区分筛选卷柏和混淆品化学表型，筛选卷柏特异性标志物：采用多元统计法进行分析，首选采用主成分分析(PCA)和层次聚类分析(HCA)区分卷柏和混淆品化学表型。进而，采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，最后根据变量权重值(VIP)和t检验中P值分析筛选差异标志物，得到鉴别模型区分卷柏与卷柏混淆品；

首先采用无监督的PCA区分卷柏属五个品种成分的化学表型。根据自然聚类法，卷柏、翠云草、深绿卷柏、薄叶卷柏和江南卷柏均分别单独聚成一簇，说明这五个品种卷柏分别具有不同的化学表型(图1)。层次聚类分析(HCA)也显示明显的两大分支和四小，江南卷柏单独一支，其余4种为一支，提示江南卷柏药材成分相比其他差异最显著，另一大支中又分为两小支，薄叶卷柏和翠云草聚类，深绿卷柏和卷柏聚类，提示深绿卷柏和卷柏的化学成分最为接近，其次是翠云草(图1)。

进而，采用OPLS-DA模型筛选卷柏和深绿卷柏的差异标志物(图2(a)) 。200次置换检验R2大于Q2，说明建立模型良好稳定(图2(b) )。散点图显示卷柏和深绿卷柏的差异性成分处于顶端边角top位置，通过p(corr)大于0.5，VIP大于1筛选差异成分。差异成分分布图显示最显著成分是Selaginellin和Selaginellin A(图2(c) 、图2(d) )。

同理，采用OPLS-DA模型筛选卷柏和深绿卷柏的差异标志物，差异成分分布图显示最显著成分是Selaginellin和Selaginellin A(图3)。

(4)基于超高效液相色谱-质谱仪测定上述确定的卷柏特异标志物的含量，建立卷柏的质量标准。提取Selaginellin和Selaginellin A在卷柏和混淆品的色谱图，Selaginellin和Selaginellin A仅存在于卷柏中(图4)。

超高效液相色谱-质谱法

色谱、质谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径1.8μm)；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.4mL。

表1 Selaginellin和Selaginellin A定量测定分析条件

采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对见下表：

表2多反应监测

理论板数按Selaginellin峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备取Selaginellin对照品、Selaginellin A对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含5μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末约0.3g，精密称定，置三角锥形瓶中，加70％甲醇30mL，密塞，称定重量，回流提取1h，冷却，用70％甲醇补重，滤过，取续滤液，即得。

测定法精密量取对照品溶液0.5mL、2mL、5mL、10mL和50mL，分别置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成标准曲线溶液。分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液与供试品溶液各2μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线。从标准曲线读出供试品溶液中相当于Selaginellin和Selaginellin A的量，计算即得。

测定药典收载卷柏与非药典收载深绿卷柏、翠云草、薄叶卷柏和江南卷柏中Selaginellin和Selaginellin A的含量，结果见下表。

表3药典收载卷柏与非药典收载深绿卷柏、翠云草、薄叶卷柏与江南卷柏中Selaginellin和Selaginellin A的含量结果(μg/g)

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