一株蜡样芽孢杆菌、油麦菜微生物菌肥及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料技术领域，尤其涉及一株蜡样芽孢杆菌、油麦菜微生物菌肥及其制备方法与应用。

背景技术

油麦菜(Lactuca sativa L.)为最重要的蔬菜食品之一，菊科莴苣属。因其含有大量的维生素、胡萝卜素和酚类化合物，对减少心血管疾病和慢性疾病有积极的作用，也是蛋白质、矿物质和微量元素的重要来源，广受消费者喜爱。近年来，化学农药和肥料的大量使用，导致土壤出现板结，肥力较低的现象，使得油麦菜在生长过程中表现出长势下降、产量和品质下降。

内生菌(Endophyte)是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官的内部真菌或细菌，是植物生长发育过程中很重要的一部分。内生菌主要通过从土壤中获取养分，并转移到植物中；产生生长调节剂(生长素、乙烯)或信号分子(NO)来促进植物的生长发育；减少宿主的氧化应激；保护植物免受疾病的侵害；阻止食草动物取食；抑制寄生植物对宿主的作用。近年来，因内生菌能有效促进植物的生长与代谢而引起人们极大关注，使内生菌对植物的应用迅速发展。

但是，目前内生菌在农业上的应用并不广，内生菌的保存条件、施用方法、施用条件以及本身的不确定性和安全性使得内生菌在农业上利用率不高，因此，如何提供一种油麦菜微生物菌肥，以解决现有技术当中内生菌利用率不高、安全性低的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明在于针对目前对于内生菌的利用率不高、安全性低的问题，提供一种可以促进油麦菜的生长发育的微生物菌肥，以减少化学肥料的使用，并且微生物菌肥的促生效果优异。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株蜡样芽孢杆菌，拉丁文名为Bacillus cereus；保藏编号为GDMCC No：62282。

优选的，所述油麦菜微生物菌肥为所述的蜡样芽孢杆菌的灭活菌体或所述的蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液。

优选的，所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液的OD

本发明还提供了所述的油麦菜微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蜡样芽孢杆菌接种于培养基中培养，制成蜡样芽孢杆菌原液；

(2)将步骤(1)得到的蜡样芽孢杆菌原液离心，得到蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液和沉淀物；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物烘干，研磨后得到蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

优选的，步骤(1)所述培养基为LB培养基；所述培养时间为8～16h；所述培养温度为35～39℃。

优选的，步骤(2)所述离心的转速为7500～8500rpm；所述离心的时间为4～6min。

优选的，步骤(3)所述烘干的温度为150～170℃；所述烘干的时间为2～4h；所述研磨后的沉淀物过60～80目筛，收集筛下组分。

本发明还进一步的提供了所述油麦菜微生物菌肥、所述的油麦菜微生物菌肥的制备方法制备得到的油麦菜微生物菌肥在油麦菜种植中的应用，S1)在种植前使用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液浸泡油麦菜种子和S2)在油麦菜移栽后每周施用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液或在油麦菜催苗期前和种植后分别施用蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

优选的，所述浸泡时油麦菜种子与所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液的质量体积比为4～8g∶20～30ml；所述浸泡时间为25～35min；所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液的施用量为250～350L/亩。

优选的，在油麦菜催苗期前6～8d和油麦菜长至6～8cm时分别施用所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体；所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体的施用量独立为8～12kg/亩。

本发明供试菌株内生菌LSE01即为所述蜡样芽孢杆菌，分离于龙葵茎内。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明提供了两种新型生物菌肥，经过热处理获得的失活菌和菌株的代谢物用于油麦菜的种植，并与传统霍格兰溶液作比较，发现龙葵茎中分离出的内生菌LSE01产生的代谢物及LSE01灭活后能显著促进油麦菜的生长、改善油麦菜的作物品质，解决了内生菌在农业应用上所存在的生物安全性问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为不同处理组对植株生长的影响图；

图2为不同处理组对油麦菜蛋白质含量的影响；每个值表示SD±平均值(n＝3)，不同的字母在p＜0.05处显示出显著差异；

图3为不同处理组对油麦菜可溶性糖含量的影响；每个值表示SD±平均值(n＝3)，不同的字母在p＜0.05处显示出显著差异；

图4为不同试验组油麦菜生长情况(从左到右依次为对照组(W)、1/2浓度霍格兰(1/2H)、失活菌(HT-B)和菌代谢物(BM)组，三次重复)。

生物保藏说明

蜡样芽孢杆菌，拉丁文名为Bacillus cereus；

该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年03月10日，保藏编号为GDMCC No：62282。

具体实施方式

本发明提供了一株蜡样芽孢杆菌，拉丁文名为Bacillus cereus；保藏编号为GDMCC No：62282。

在本发明中，所述油麦菜微生物菌肥为所述的蜡样芽孢杆菌的灭活菌体或所述的蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液。

在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液的OD

本发明还提供了所述的油麦菜微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蜡样芽孢杆菌接种于培养基中培养，制成蜡样芽孢杆菌原液；

(2)将步骤(1)得到的蜡样芽孢杆菌原液离心，得到蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液和沉淀物；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物烘干，研磨后得到蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

在本发明中，步骤(1)所述培养基为LB培养基；

在本发明中，步骤(1)所述培养时间为8～16h；优选为9～15h；进一步优选为10～14h；更优选为12h。

在本发明中，步骤(1)所述培养温度为35～39℃；优选为36～38℃；进一步优选为37℃。

在本发明中，步骤(2)所述离心的转速为7500～8500rpm；优选为7700～8300rpm；进一步优选为7900～8100rpm；更优选为8000rpm。

在本发明中，步骤(2)所述离心的时间为4～6min；优选为4.5～5.5min；进一步优选为5min。

在本发明中，步骤(3)所述烘干的温度为150～170℃；优选为154～166℃；进一步优选为158～162℃；更优选为160℃。

在本发明中，步骤(3)所述烘干的时间为2～4h；优选为2.5～3.5h；进一步优选为3h。

在本发明中，步骤(3)所述研磨后的沉淀物过60～80目筛，收集筛下组分；优选为64～76目；进一步优选为68～72目；更优选为70目。

本发明还进一步的提供了所述油麦菜微生物菌肥、所述的油麦菜微生物菌肥的制备方法制备得到的油麦菜微生物菌肥在油麦菜种植中的应用，S1)在种植前使用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液浸泡油麦菜种子和S2)在油麦菜移栽后每周施用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液或在油麦菜催苗期前和种植后分别施用蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

在本发明中，所述浸泡时油麦菜种子与所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液的质量体积比为4～8g∶20～30ml；优选为5～7g∶22～28ml；进一步优选为6g∶24～26ml；更优选为6g∶25ml。

在本发明中，所述浸泡时间为25～35min；优选为27～33min；进一步优选为29～31min；更优选为30min。

在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液的施用量为250～350L/亩；优选为270～330L/亩；进一步优选为290～310L/亩；更优选为300L/亩。

在本发明中，在油麦菜催苗期前6～8d和油麦菜长至6～8cm时分别施用所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体；优选为在油麦菜催苗期前7d和油麦菜长至7cm时分别施用所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

在本发明中，所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体的施用量独立为8～12kg/亩；优选为9～11kg/亩；进一步优选为10kg/亩。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所用到的蜡样芽孢杆菌，拉丁文名为Bacillus cereus；保藏编号为GDMCC No：62282。

实施例1

一种油麦菜微生物菌肥的制备方法，步骤如下：

(1)将蜡样芽孢杆菌接种于LB培养基中35℃，恒温摇床转速为140rpm条件下培养8h，制成蜡样芽孢杆菌原液；

(2)将步骤(1)得到的蜡样芽孢杆菌原液离心，得到蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液和沉淀物；

所述离心的转速为7500rpm；所述离心的时间为4min；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物150℃烘干2h，并进行研磨，研磨后的沉淀物过60目筛，收集筛下组分，得到蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

实施例2

一种油麦菜微生物菌肥的制备方法，步骤如下：

(1)将蜡样芽孢杆菌接种于LB培养基中39℃，恒温摇床转速为160rpm条件下培养16h，制成蜡样芽孢杆菌原液；

(2)将步骤(1)得到的蜡样芽孢杆菌原液离心，得到蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液和沉淀物；

所述离心的转速为8500rpm；所述离心的时间为6min；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物170℃烘干4h，并进行研磨，研磨后的沉淀物过80目筛，收集筛下组分，得到蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

实施例3

一种油麦菜微生物菌肥的制备方法，步骤如下：

(1)将蜡样芽孢杆菌接种于LB培养基中37℃，恒温摇床转速为150rpm条件下培养12h，制成蜡样芽孢杆菌原液；

(2)将步骤(1)得到的蜡样芽孢杆菌原液离心，得到蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液(OD

所述离心的转速为8000rpm；所述离心的时间为5min；

(3)将步骤(2)得到的沉淀物160℃烘干3h，并进行研磨，研磨后的沉淀物过70目筛，收集筛下组分，得到蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。

实施例4

一种油麦菜微生物菌肥的使用方法，S1)在种植前使用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液(OD

实施例5

一种油麦菜微生物菌肥的使用方法，S1)在种植前使用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液(OD

实施例6

一种油麦菜微生物菌肥的使用方法，S1)在种植前使用所述蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液(OD

实施例7

一种油麦菜微生物菌肥的使用方法，在油麦菜催苗期前6d和油麦菜长至6cm时分别施用所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体8kg/亩。

实施例8

一种油麦菜微生物菌肥的使用方法，在油麦菜催苗期前8d和油麦菜长至8cm时分别施用所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体12kg/亩。

实施例9

一种油麦菜微生物菌肥的使用方法，在油麦菜催苗期前7d和油麦菜长至7cm时分别施用所述蜡样芽孢杆菌的灭活菌体10kg/亩。

实施例10

对比试验：

(1)将油麦菜种子(购自河北省青县兴运蔬菜良种繁育中心)在50℃水温下浸泡4h，进行表面消毒，后用无菌纸将种子表面擦干。分别用去离子水、实施例3得到的蜡样芽孢杆菌的菌悬液去除菌体后的发酵上清液浸泡30min，浸泡后用去离子水冲洗3次，用纱布包裹放在阴凉遮光处催苗，两天后长出小白点再播种在育苗盘中。

(2)总共设立4个实验组，分别为对照组(W)、1/2浓度霍格兰(1/2H)、失活菌(HT-B)和菌代谢物(BM)组，每个实验组设有3个平行。前三组所用苗为步骤(1)去离子水浸泡种子长出的苗，菌代谢物所用苗为步骤(1)实施例3得到的蜡样芽孢杆菌的去除菌体后的发酵上清液浸泡种子长出的苗。

育苗盘中苗长至3cm高度后移栽到含有400g过筛土壤的盆栽里(南昌航空大学校内沙壤土)，所有盆栽均在大棚培养。HT-B组在催苗期前一周向盆栽中加入0.5g蜡样芽孢杆菌的灭活菌体，长至7cm时再加入0.5g蜡样芽孢杆菌的灭活菌体。其它三组在缓苗一周后分别加入15ml去离子水、1/2浓度霍格兰和实施例3得到的蜡样芽孢杆菌的去除菌体后的发酵上清液，一周一次，直至油麦菜成熟。并在移栽后40天测定不同试验组油麦菜地上部分高度、根长度、植株鲜重以及相对含水率。

(3)蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝G-250染色法测定，随机取各处理组油麦菜叶片0.3g，加入石英砂和去离子水研磨成浆，用去离子水冲洗三次研钵，转入离心管中3500r/min离心15min，取上清液转入25ml比色管，用去离子水定容，即样品液。取0.5ml样品液于另一离心管中，加入0.5ml去离子水和5ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置5min，测定在595nm下的吸光度，计算蛋白质的含量。

可溶性糖含量的测定

采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，随机取各处理组新鲜油麦菜叶片0.3g，剪碎，加入10ml去离子水，用保鲜膜封口，于沸水中提取2次，每次30min，提取液过滤入25ml比色管，用去离子水定容。取0.5ml样品液，依次加入1.5ml去离子水、0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，测定在630nm下的吸光度，计算可溶性糖的含量。测定结果如表1所示。

表1不同处理组40天后油麦菜地上部分高度、根长度、植株鲜重以及相对含水率

每个值表示SD±平均值(n＝3)，不同的字母在p＜0.05处显示出显著差异。

如表1所示，HT-B处理的油麦菜地上部分高度、根长及总植株鲜重都显著高于对照组。其中，地上部分高度为对照组的3倍多，植株鲜重超过10倍。BM处理组的地上部分高度、植株鲜重都显著高于对照组，根长无显著性差异。1/2H处理组的地上部分高度也有显著提高。这可能是由于灭活菌和菌代谢物可以促进植物体内生长激素含量增高，霍格兰溶液给植物提供生长所需的营养物质，从而促进了植物的生长。HT-B和BM处理组相对含水量比对照组少，提高了植物的抗性。从图1可明显看出不同处理组的表观差距。

蛋白质和可溶性糖含量是蔬菜中两个重要的指标。如图2所示，BM处理后的植株蛋白含量最高，HT-B和1/2H霍格兰次之，分别为5.764、5.023、4.86mg/g，比对照组相比各增加了约33％、16％、12％。

如图3所示，HT-B处理组可溶性糖含量最高，达到9.486mg/g，为对照组可溶性糖含量的2倍多，BM和1/2H处理组的可溶性糖含量与对照组相比也显著性增加，分别增加了约53％、30％。这可能是由于菌代谢物和灭活菌的加入改变了植物根际微生物群里结构，提高了植物体内与碳、氮代谢相关酶活性。图4为不同试验组油麦菜生长情况(从左到右依次为对照组(W)、1/2浓度霍格兰(1/2H)、失活菌(HT-B)和菌代谢物(BM)组，三次重复)。

综上所述，灭活菌、菌代谢物以及1/2浓度霍格兰溶液均对油麦菜的生长和营养品质的提高有促进作用。灭活菌及菌代谢物相对于1/2浓度霍格兰溶液来说效果更明显，是两种适于在农业上应用的新型微生物菌肥。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。