凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP及其在促进对虾蜕皮中的应用

技术领域

本发明属水产养殖生物技术领域，具体涉及凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP及其在促进对虾蜕皮中的应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，原产自太平洋东海岸，由于其生长速度块、抗性强、对饲料要求低、肉质鲜美和离水存活时间长等优点，是世界公认的养殖对虾优良品质。自1988年从美国夏威夷引进后，凡纳滨对虾已发展成我国最重要的对虾养殖品种，其养殖产量超过全国对虾养殖总产量的70％。

甲基法尼酯(Methyl farnesoate，MF)是调节凡纳滨对虾生长发育和繁殖过程中重要的内分泌激素之一，由大颚器(Mandibular organ，MO)合成和分泌，在凡纳滨对虾性成熟和幼体变态发育中起着至关重要的作用。20世纪90年代，国外科学家从脊龙虾(Sicyoniaingentis)和蜘蛛蟹(Libinia emarginata)的血淋巴中检测到可以与甲基法尼酯结合的蛋白类物质，但具体是什么蛋白一直不清楚。在凡纳滨对虾中发现甲基法尼酯结合蛋白(Methyl farnesoate bindingprotein，MFBP)并对其在蜕皮中的作用进行研究，将在凡纳滨对虾人工养殖方面具有应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP及其在促进对虾蜕皮中的应用。

本发明通过构建凡纳滨对虾转录组，从中发现一个647碱基组装片段，以此设计基因特异引物，通过3'、5'-RACE方法扩增获得凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白lvMFBP的cDNA全长序列。获得的lvMFBP cDNA序列全长919碱基，其序列如SEQ ID NO.1所示。lvMFBP的cDNA包含一个648碱基开放阅读框(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第28位至675位碱基所示)，其编码蛋白具有215个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。将lvMFBP基因cDNA及编码蛋白序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/)中采用Blastx程序进行序列比对，发现lvMFBP基因cDNA及编码蛋白序列不与先前已公布的蛋白序列完全一致，说明其是新发现的核苷酸与蛋白序列。

本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第28位至675位碱基所示。

本发明的第二个目的是提供一种由所述的凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP编码的凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

本发明根据凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP的cDNA序列合成dsRNA，其正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示，注射到凡纳滨对虾体内，能有效敲降lvMFBP mRNA表达水平，并能有效促进凡纳滨对虾蜕皮。

因此，本发明的第三个目的是提供一种抑制所述的凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP表达的dsRNA。所述的dsRNA的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第四个目的是提供抑制所述的凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP表达的试剂在促进对虾蜕皮发育中的应用。

优选的，所述的试剂为靶向凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白lvMFBP的dsRNA、siRNA、miRNA、核酶或shRNA。

优选的，所述的试剂为dsRNA。

优选的，所述的对虾为凡纳滨对虾。

本发明的第五个目的是提供一种促进凡纳滨对虾脱皮的产品，该产品含有所述的dsRNA。

本发明的第六个目的是提供一种促进凡纳滨对虾脱皮的方法，是将所述的dsRNA注射到凡纳滨对虾体内。

本发明首次从凡纳滨对虾中克隆出凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP，并通过实验证明注射针对该基因设计的dsRNA可以有效促进凡纳滨对虾的蜕皮。本发明针对缺少人工促进凡纳滨对虾蜕皮的方法的问题，提供了一种有效的技术手段，在对虾人工养殖方面具有应用前景。

附图说明

图1是等温滴定量热实验分析凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白lvMFBP与甲基戊二烯(Met)、保幼激素III(JH III)、法尼醇(F-OH)、法尼酸(FA)、甲基法尼酯(MF)的结合能力。

图2是lvMFBP dsRNA注射对凡纳滨对虾蜕皮的作用。PBS为生理盐水对照组，dsGFP为无义RNA组，dsMFBP为RNA干扰组。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

以凡纳滨对虾肝胰腺组织为材料，使用Trizol(购自Invitrogen公司)方法提取总RNA，使用Dnase I(购自Invitrogen公司)消化残留的基因组DNA，使用PrimeScript

中间片段扩增特异性引物名称和序列如下：

MFBP-F：5'-ATGCTTCGCCTTGCCTCCT-3'

MFBP-R：5'-TCAGTCGCGGTACTCCAGC-3'；

3'-RACE基因特异引物名称和序列如下：

MFBP-3F：5'-TCCTGGAGGGCGTCGAGGCG-3'

MFBP-3R1：5'-GCTTTGGCTTAGTTGAAGTCACCAG-3'

MFBP-3R2：5'-GCTGCAAGTGGGACACGGTTAA-3'；

5'-RACE基因特异引物名称和序列如下：

MFBP-5F：5'-CCTCGCTCTTCAGCCAGC-3'

MFBP-5R：5'-TGGTCAGTAACGATGTTC-3'；

所有获得PCR扩增片段克隆到PMD-18载体(购自Takara公司)，并通过桑格法进行测序(由英骏公司提供)。获得的lvMFBP的cDNA序列全长919碱基，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。lvMFBP的cDNA包含一个648碱基开放阅读框(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1中的第28位至675位碱基所示)，其编码蛋白具有215个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。同时将lvMFBP基因cDNA及编码蛋白序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/)中采用Blastx程序进行序列比对，发现lvMFBP基因cDNA及编码蛋白序列不与先前已公布的蛋白序列完全一致，说明其是新发现的核苷酸与蛋白序列。

实施例2

使用大肠杆菌系统重组表达lvMFBP蛋白并通过亲和层析方法纯化，使用等温滴定量热实验对lvMFBP与甲基戊二烯(Met)、保幼激素III(JH III)、法尼醇(F-OH)、法尼酸(FA)、甲基法尼酯(MF)的结合能力进行分析。甲基戊二烯、保幼激素III、法尼醇、法尼酸和甲基法尼酯均购自Sigma，浓度均为20μM，lvMFBP蛋白浓度为200μM。

结果表明：lvMFBP蛋白与甲基法尼酯(MF)具有极强的结合能力，其结合具有高度特异性，与法尼醇(F-OH)、法尼酸(FA)和甲基戊二烯(Met)有极弱的结合能力，而与保幼激素III(JH III)则完全没有结合能力(图1)。

实施例3

根据凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白lvMFBP基因的cDNA序列设计lvMFBP dsRNA序列，dsRNA的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，dsRNA参照试剂盒T7 RiboMax(购自Promega公司)合成。选择体重为4～5g的凡纳滨对虾，每组24只。注射lvMFBP dsRNA(dsMFBP)(2μg/g)或等体积GFP dsRNA(dsGFP，由上海生工公司合成)作为非靶dsRNA对照、PBS作为阴性对照于凡纳滨对虾第三、四腹节处。在显微镜下观察蜕皮4次，每次间隔24小时，并记录。

结果表明：lvMFBP dsRMA注射后能有效加快凡纳滨对虾蜕皮(图2)。因此，在凡纳滨对虾中，lvMFBP具有蜕皮抑制作用，而lvMFBP的RNA敲降则起蜕皮促进作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白基因lvMFBP及其在促进对虾蜕皮中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 919

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

cctcgctctt cagccagctc tgccaccatg cttcgccttg cctccttcct cttgacgctg 60

ggcatcgctc tcgcccagcc tctggacaaa attctcgagg gcgacctcac agctctcctg 120

caggaggcgc tcgcgcccta cgcccccgcc actgtgccag cgatcaccaa cttgaacatc 180

gttactgacc atagcagttt ccttttcaac gcgaccaacg tcgaggtcgc tggctttggc 240

ttagttgaag tcaccagctt cgttcctccg gtccctcttc tctccaaaca cgtctccatg 300

agtctgagag tccctcttct gacggcgctg acgcaggact actcgctgac cggagttcac 360

gatggaacgc ccacggaggc ggcggggacg ggccaactca agttcaccaa cttcgacctg 420

aaggtggatt tcaaggcgga ctcctactcc ctcgacccca tgtccgtgtg catgcagccg 480

ggctccttct ccatcgacct cggcgtcgag agcatcgaga gcaacctgga gggcgcgggc 540

gaggtcaacg acgacatcaa cacggagggc ccggcgctcc tggagggcgt cgaggcgcag 600

atcaacgcca ggtcggacga catcgagcag ctcgtcaacg gtgctctctg cgttcagctg 660

gagtaccgcg actgaagcgc tgcaagcggg acacggttaa tttcccccga gccgctttca 720

gcaaatgacc ccgaacgaat ccccttatcg acatcgcttt tctcgcctgg ggcgttacca 780

tgaacctcga aggcacggcg tgttatggtg ttggctggac tagacggcaa ggaatgcttc 840

gcacggcctt ctcttggctg tcttgtaata aataaatgct gctaaggcag aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 919

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

Met Leu Arg Leu Ala Ser Phe Leu Leu Thr Leu Gly Ile Ala Leu Ala

1 5 10 15

Gln Pro Leu Asp Lys Ile Leu Glu Gly Asp Leu Thr Ala Leu Leu Gln

20 25 30

Glu Ala Leu Ala Pro Tyr Ala Pro Ala Thr Val Pro Ala Ile Thr Asn

35 40 45

Leu Asn Ile Val Thr Asp His Ser Ser Phe Leu Phe Asn Ala Thr Asn

50 55 60

Val Glu Val Ala Gly Phe Gly Leu Val Glu Val Thr Ser Phe Val Pro

65 70 75 80

Pro Val Pro Leu Leu Ser Lys His Val Ser Met Ser Leu Arg Val Pro

85 90 95

Leu Leu Thr Ala Leu Thr Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Gly Val His Asp

100 105 110

Gly Thr Pro Thr Glu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Leu Lys Phe Thr Asn

115 120 125

Phe Asp Leu Lys Val Asp Phe Lys Ala Asp Ser Tyr Ser Leu Asp Pro

130 135 140

Met Ser Val Cys Met Gln Pro Gly Ser Phe Ser Ile Asp Leu Gly Val

145 150 155 160

Glu Ser Ile Glu Ser Asn Leu Glu Gly Ala Gly Glu Val Asn Asp Asp

165 170 175

Ile Asn Thr Glu Gly Pro Ala Leu Leu Glu Gly Val Glu Ala Gln Ile

180 185 190

Asn Ala Arg Ser Asp Asp Ile Glu Gln Leu Val Asn Gly Ala Leu Cys

195 200 205

Val Gln Leu Glu Tyr Arg Asp

210 215

<210> 3

<211> 407

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cuacgccccc gccacugugc cagcgaucac caacuugaac aucguuacug accauagcag 60

uuuccuuuuc aacgcgacca acgucgaggu cgcuggcuuu ggcuuaguug aagucaccag 120

cuucguuccu ccggucccuc uucucuccaa acacgucucc augagucuga gagucccucu 180

ucugacggcg cugacgcagg acuacucgcu gaccggaguu cacgauggaa cgcccacgga 240

ggcggcgggg acgggccaac ucaaguucac caacuucgac cugaaggugg auuucaaggc 300

ggacuccuac ucccucgacc ccauguccgu gugcaugcag ccgggcuccu ucuccaucga 360

ccucggcguc gagagcaucg agagcaaccu ggagggcgcg ggcgagg 407

<210> 4

<211> 407

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccucgcccgc gcccuccagg uugcucucga ugcucucgac gccgaggucg auggagaagg 60

agcccggcug caugcacacg gacauggggu cgagggagua ggaguccgcc uugaaaucca 120

ccuucagguc gaaguuggug aacuugaguu ggcccguccc cgccgccucc gugggcguuc 180

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gacucaugga gacguguuug gagagaagag ggaccggagg aacgaagcug gugacuucaa 300

cuaagccaaa gccagcgacc ucgacguugg ucgcguugaa aaggaaacug cuauggucag 360

uaacgauguu caaguuggug aucgcuggca caguggcggg ggcguag 407