Nrf2在宫内发育受限胎儿肺发育迟缓辅助诊断中的应用

技术领域

本发明涉及Nrf2在宫内发育受限胎儿肺发育迟缓辅助诊断中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

胎儿宫内发育受限(intrauterine growth restriction,IUGR)通常是指胎儿出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的两个标准差或第十百分位数，是胎儿和新生儿发病率和死亡率的主要原因。胎盘功能不全一般发生在妊娠的后半期，此时是腺泡和肺泡的发育期，因此远端肺最容易受到IUGR的影响。怀孕后期长期限制营养或氧气会导致后代的气道和肺部发育异常，包括肺泡简化，中间隔壁和基底膜增厚。胎儿出生后不久出现的结构异常和肺功能损伤持续存在，甚至随着年龄的增长而发展。目前对于妊娠期IUGR的诊断通常采用方法有几种，一种是测量孕妇耻骨联合上缘至子宫底部顶部的距离，另一种是超声检测胎儿，标准的胎儿生物测定包括评估头围、双顶骨直径、腹围和股骨长度，并基于这四个指标估计胎儿的体重。这些方法不仅误差较大，而且精细度不高，无法精确评估胎儿肺部的发育情况，等到发现胎儿肺部出现明显的形态学变化时往往已经错过了最佳干预时机。因此，研发一种辅助诊断IUGR肺发育迟缓的方法具有重要意义。

炎症和氧化应激是IUGR公认的发病机制。核因子-类胡萝卜素2相关因子2(Nrf2)是一种基本的亮氨酸拉链氧化还原敏感的转录因子，是一种多效蛋白，通过与顺式作用元件结合来调节一系列抗氧化剂和其他细胞保护性基因的基础和诱导型表达。增强子序列被称为抗氧化剂响应元件。Nrf2是细胞因子产生的上游调节剂，抑制促炎细胞因子基因的转录上调，可以调控巨噬细胞的炎症反应。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种Nrf2在宫内发育受限胎儿肺发育迟缓诊断中的应用。

本发明的第一个目的是提供Nrf2蛋白在宫内发育受限胎儿肺发育迟缓的诊断标志物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，Nrf2蛋白或定量检测Nrf2蛋白表达情况的试剂在制备宫内发育受限胎儿肺发育迟缓诊断产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述检测产品包括但不限于试剂或试剂盒。

本发明的第二个目的是提供一种宫内发育受限胎儿肺发育迟缓诊断试剂盒，含有Nrf2蛋白的检测试剂。

在本发明的一种实施方式中，所述Nrf2蛋白的检测试剂用于Nrf2蛋白或Nrf2基因的定量检测。

在本发明的一种实施方式中，所述Nrf2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述检测试剂通过荧光定量PCR、Southern杂交、Northern杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、高通量测序法或免疫法检测样本中Nrf2蛋白的表达情况。

在本发明的一种实施方式中，所述免疫法包括ELISA法、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹法。

在本发明的一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增Nrf2基因的引物和/或探针；或者能够特异性结合Nrf2蛋白的抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述Nrf2蛋白的检测试剂为抗Nrf2的抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述抗Nrf2的抗体为单克隆抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述样本为肺组织。

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括检测标记；所述检测标记包括但不限于荧光素、酶、金属离子、或同位素。

在一种实施方式中，所述Nrf2蛋白在肺组织中的表达量高于对照的1.2倍以上视为患有宫内发育受限胎儿肺发育迟缓的风险。

本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含增强Nrf2表达的药物，以及药学上可接受的辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述辅料包括载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧化剂、抑菌剂或者缓冲剂中的任意一种或者至少两种的组合。

在本发明的一种实施方式中，所述至少两种的组合例如稀释剂和赋形剂的组合、粘合剂和湿润剂的组合、乳化剂和助溶剂的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此不在一一赘述。

本发明还提供所述药物组合物在制备缓解和/或治疗宫内发育受限胎儿肺发育迟缓的药物中的应用。

本发明还提供所述药物组合物在制备具有如下至少一种功能的药物中的应用：

(1)缓解宫内发育受限所致肺发育不良中氧化应激；

(2)宫内发育受限所致肺发育不良中的细胞焦亡。

有益效果：

在发明过程中，发明人发现经孕期给予10.5％O

附图说明

图1：小鼠肺组织中Nrf2表达水平；A：免疫印迹实验，B：灰度值。

图2：Nrf2敲除对缺氧导致的小鼠宫内发育不良活胎率、出生与后期体重及4周龄时脑肝比的影响；A：小鼠的活胎率，B：小鼠的出生体重，C：小鼠的后期体重，D：体重变化率，E：2周龄小鼠脑/肝重量比，F：4周龄小鼠脑/肝重量比。

图3：Nrf2敲除对2周龄小鼠肺组织形态的影响；A：H&E染色，B：免疫组化。

图4：Nrf2敲除对4周龄小鼠肺组织氧化应激指标的影响；A：SOD1 mRNA相对表达水平，B：SOD2 mRNA相对表达水平，C：Gclm mRNA相对表达水平，D：Txn mRNA相对表达水平。

图5：Nrf2对肺组织焦亡指标GSDMD、caspase-1和IL-18的影响；A：GSDMD蛋白水平表达情况，B：GSDMD蛋白灰度值，C：免疫荧光检测GSDMD的表达水平，D：NLRP3 mRNA相对表达水平，E：caspase-1mRNA相对表达水平，F：GSDMD mRNA相对表达水平，G：IL-18mRNA相对表达水平。

图6：Nrf2质粒构建图谱；A：空载质粒图谱。B：Nrf2质粒图谱。

图7：GSDMD启动子荧光素酶质粒构建图谱；A：空载质粒图谱。B：GSDMD启动子荧光素酶质粒图谱。

图8：Nrf2对焦亡的抑制作用；A：荧光素酶报告基因检测GSDMD的相对荧光活性，B：过表达Nrf2对GSDMD的抑制作用，C：Nrf2蛋白表达情况的灰度值检测，D：GSDMD蛋白表达情况的灰度值检测，E：GSDMD蛋白表达情况的灰度值检测。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 IUGR小鼠肺组织Nrf2表达情况

(1)宫内发育受限(IUGR)模型构建

选取8-10周龄的野生型C57BL/6鼠，分别随机分成两组，一组作为常氧对照组，一组为IUGR造模组。

IUGR造模方法：将小鼠按照雌：雄2:1的比例合笼，以合笼后的次日早晨检查母鼠的阴道栓，作为成功受孕的标准。将孕鼠从孕第11.5天到17.5天(小鼠肺发育中的假腺-小管期)置于低氧(10.5％O

1)Normal：野生型小鼠置于常氧环境；

2)IUGR：野生型小鼠进行IUGR造模；

(2)免疫印迹实验

按照本实验室已建立的方法进行，主要步骤如下：用试剂盒提取出生后14天小鼠的肺组织样品总蛋白，BCA法定量，常规处理样品、电泳、电转膜。NC膜在5％的脱脂奶粉中封闭2小时，然后加入一抗，在4℃摇床过夜。TBST溶液洗涤三次后加入相应的二抗，室温1h。TBST洗膜后，加入显色剂后曝光显影成像。

结果如图1所示，IUGR组小鼠的肺组织中Nrf2表达升高，为Normal组的1.221倍。

实施例2 Nrf2敲除对小鼠胎鼠的影响

(1)宫内发育受限(IUGR)模型构建

选取8-10周龄的野生型C57BL/6鼠和Nrf2敲除小鼠，分别随机分成两组，一组作为常氧对照组，一组为IUGR造模组。

IUGR造模方法：将小鼠按照雌：雄2:1的比例合笼，以合笼后的次日早晨检查母鼠的阴道栓，作为成功受孕的标准。将孕鼠从孕第11.5天到17.5天(小鼠肺发育中的假腺-小管期)置于低氧(10.5％O

实验分组如下：

1)WTNormal：野生型小鼠置于常氧环境；

2)WT IUGR：野生型小鼠进行IUGR造模；

3)Nrf2

4)Nrf2

全部数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用GraphPad Prism 7.0统计学软件进行统计学分析。进行多重比较时使用单因素或多因素方差分析进行比较。P＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

(2)实验结果

1)脏器体重比

在胎鼠出生后14天和28天时用戊巴比妥钠麻醉，称量体重，颈部至腹部皮肤碘伏消毒后，沿正中线剪开皮肤，钝性分离腺体和肌肉，并剪开胸肋骨，取出脑、肝脏和肺组织，用置于冰上的PBS漂洗，无尘纸沾去水分后称重。

结果如图2所示，相较于野生型小鼠，在低氧环境下，Nrf2敲除明显减低小鼠的活胎率(图2A)、出生体重及后期体重(图2B-D)，加剧不对称发育(图2E-F)。由此可见，低氧环境诱导显著提高了Nrf2敲除小鼠的IUGR发病率。

2)H&E染色

将出生后14天小鼠的肺组织泡于10％中性甲醛溶液中固定48h左右，然后梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，贴片完成后将切片室温放置过夜，之后4℃长期保存；组织切片62℃烘烤2h→二甲苯I中脱蜡15min→二甲苯II中脱蜡15min→无水酒精浸泡5min→95％酒精浸泡5min→90％酒精5min→80％酒精5min→70％酒精5min→双蒸水5min×3次→苏木精染色2min→自来水1min→1％盐酸乙醇分化1-3s→自来水冲洗1min→伊红染色3min→自来水中40s洗去浮色→85％乙醇脱水20s→90％乙醇脱水30s→95％乙醇I脱水1min→95％乙醇II脱水1min→无水乙醇I脱水4min→无水乙醇II浸泡脱水4min→二甲苯I中透明2min→二甲苯II中透明4min→二甲苯III透明4min→中性树胶封片→光镜下观察。

结果如图3A所示，相较于野生型小鼠，在低氧环境下，Nrf2敲除使肺组织形态改变、肺泡壁增厚、炎性细胞浸润。

3)免疫组化

将出生后14天小鼠的肺组织切片于60℃的烘箱中烤片1h，二甲苯脱蜡10min，重复3次，100％-70％梯度酒精复水，每次2min，PBS洗两次各5min。

对切片使用柠檬酸钠溶液进行抗原修复(Solarbio，北京，中国)。依次用抗生物素蛋白和生物素封闭切片，然后将其与1/100稀释的抗CD31抗体(santa)在4℃孵育过夜。用PBS洗去第一抗体后，将切片与生物素化的IgG在37℃温育30分钟。使用SABC(链霉激活素-生物素复合物)方法进行染色，并且使用二氨基联苯胺作为染色底物，通过显微镜观察拍照。

结果如图3B所示，相较于野生型小鼠，在低氧环境下，Nrf2敲除使肺血管发育受阻(图2B)。

4)实时荧光定量PCR

根据试剂盒提取出生后28天小鼠的肺组织样品RNA，测定其纯度以及浓度后将其定量逆转录为cDNA，根据试剂盒指示利用SYBR green荧光染料进行实时荧光定量PCR检测。采用2

结果如图4所示，相较于野生型小鼠，在低氧环境下，Nrf2敲除小鼠中的SOD1、SOD2、Gclm和Txn的mRNA水平显著降低，说明Nrf2缺失会导致小鼠体内氧化应激加重。

5)免疫印迹实验

按照本实验室已建立的方法进行，主要步骤如下：用试剂盒提取出生后14天小鼠的肺组织样品总蛋白，BCA法定量，常规处理样品、电泳、电转膜。NC膜在5％的脱脂奶粉中封闭2小时，然后加入一抗，在4℃摇床过夜。TBST溶液洗涤三次后加入相应的二抗，室温1h。TBST洗膜后，加入显色剂后曝光显影成像。

结果如图5所示，相较于野生型小鼠，在低氧环境下，Nrf2敲除导致焦亡关键分子GSDMD蛋白水平(5A-B)和mRNA水平(5F)的表达量显著升高，caspase-1和IL-18的mRNA水平的表达量(5E、5G)显著升高。

6)免疫荧光

出生后14天小鼠的肺组织切片于60℃的烘箱中烤片1h，二甲苯脱蜡10min，重复3次，100％-70％梯度酒精复水，每次2min；2.PBS洗两次各5min。0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)95℃抗原修复15min，等缓冲液冷却后，将切片取出，PBS洗5min。1％Triton X-100室温孵育10-20min破膜，PBS洗3次，每次5分钟。滴加5％正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。滴加一抗，4℃过夜，4℃过夜后在37℃复温45min，PBS洗3次每次5min。按照一抗的顺序加二抗(二抗PBS 1:300稀释)，室温孵育1小时，PBS洗5min，避光。DAPI(PBS 1:100稀释)染核10min，PBS冲洗5分钟，滴加防猝灭剂封片。使用蔡司正置荧光显微镜观察。

结果如图5C所示，免疫荧光结果显示，Nrf2敲除导致焦亡关键分子GSDMD的表达水平显著升高。

实施例3过表达Nrf2对宫内发育受限肺发育的影响

(1)质粒构建

质粒Nrf2 OE(图6)：

表1 Nrf2质粒构建信息

GSDMD启动子质粒(图7)：

表2 GSDMD荧光素酶质粒构建信息

(2)细胞转染

待293t细胞长至汇合度90％时更换不含抗生素的10％FBS DMEM培养基，2h后，将Nrf2过表达质粒(Nrf2 OE)和阴性对照质粒(pcDNA3.1(+)-3×FLAG-P2A-EGFP)分别用DMEM稀释(即为溶液A)。脂质体转染试剂用DMEM稀释，轻轻吹打混匀(即为溶液B)。溶液A和B室温静置5min后混合，轻轻吹打混匀。室温静置20min后将混合液按照实验分组加入相应的培养皿中，轻轻混匀后置于37℃、5％CO

(3)双荧光素酶报告基因

用Nrf2过表达质粒(Nrf2 OE)、阴性对照质粒(pcDNA3.1(+)-3×FLAG-P2A-EGFP)、GSDMD启动子质粒(pGL4.10-GSDMD Promoter(Wt))、空载质粒(pGL4.10)、海参内参质粒(pRL.CWV)分别转染293t细胞24h后，采用Dual Luciferase ReporterAssay Kit试剂盒检测荧光素酶报告基因的活性。提前取出试剂盒使其温度平衡至室温。吸弃细胞培养基，用PBS洗涤两次，加入适量1×Cell Lysis Buffer，震摇裂解5min，吹打并吸取细胞裂解液于1.5mL离心管中，12000g常温离心2min，取上清备用。将100μl平衡至室温的LuciferaseSubstrate加入酶标板中，小心吸取20μL细胞裂解液上清至酶标板中，迅速混匀后痢疾于酶标仪中检测Firefly luciferase报告基因活性。随后，在以上反应液中加入100μl新鲜配置的Renilla substrate工作液，迅速混匀后立即于酶标仪中检测Renilla luciferase报告基因活性。

结果如图8A显示，过表达Nrf2的293t细胞中的GSDMD启动子的相对荧光值显著下降，说明过表达Nrf2能抑制GSDMD启动子活性，并且梯度抑制GSDMD蛋白表达(图8B-E)。由此可见，过表达Nrf2可以显著抑制细胞焦亡，说明Nrf2对宫内发育受限肺发育具有保护作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> Nrf2在宫内发育受限胎儿肺发育迟缓辅助诊断中的应用

<130> BAA220459A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 605

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Met Asp Leu Glu Leu Pro Pro Pro Gly Leu Pro Ser Gln Gln Asp

1 5 10 15

Met Asp Leu Ile Asp Ile Leu Trp Arg Gln Asp Ile Asp Leu Gly Val

20 25 30

Ser Arg Glu Val Phe Asp Phe Ser Gln Arg Arg Lys Glu Tyr Glu Leu

35 40 45

Glu Lys Gln Lys Lys Leu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Gln Lys

50 55 60

Glu Gln Glu Lys Ala Phe Phe Ala Gln Leu Gln Leu Asp Glu Glu Thr

65 70 75 80

Gly Glu Phe Leu Pro Ile Gln Pro Ala Gln His Ile Gln Ser Glu Thr

85 90 95

Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Ser Gln Val Ala His Ile Pro Lys Ser Asp

100 105 110

Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Cys Met Gln Leu Leu Ala Gln Thr Phe Pro

115 120 125

Phe Val Asp Asp Asn Glu Val Ser Ser Ala Thr Phe Gln Ser Leu Val

130 135 140

Pro Asp Ile Pro Gly His Ile Glu Ser Pro Val Phe Ile Ala Thr Asn

145 150 155 160

Gln Ala Gln Ser Pro Glu Thr Ser Val Ala Gln Val Ala Pro Val Asp

165 170 175

Leu Asp Gly Met Gln Gln Asp Ile Glu Gln Val Trp Glu Glu Leu Leu

180 185 190

Ser Ile Pro Glu Leu Gln Cys Leu Asn Ile Glu Asn Asp Lys Leu Val

195 200 205

Glu Thr Thr Met Val Pro Ser Pro Glu Ala Lys Leu Thr Glu Val Asp

210 215 220

Asn Tyr His Phe Tyr Ser Ser Ile Pro Ser Met Glu Lys Glu Val Gly

225 230 235 240

Asn Cys Ser Pro His Phe Leu Asn Ala Phe Glu Asp Ser Phe Ser Ser

245 250 255

Ile Leu Ser Thr Glu Asp Pro Asn Gln Leu Thr Val Asn Ser Leu Asn

260 265 270

Ser Asp Ala Thr Val Asn Thr Asp Phe Gly Asp Glu Phe Tyr Ser Ala

275 280 285

Phe Ile Ala Glu Pro Ser Ile Ser Asn Ser Met Pro Ser Pro Ala Thr

290 295 300

Leu Ser His Ser Leu Ser Glu Leu Leu Asn Gly Pro Ile Asp Val Ser

305 310 315 320

Asp Leu Ser Leu Cys Lys Ala Phe Asn Gln Asn His Pro Glu Ser Thr

325 330 335

Ala Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ser Gly Ile Ser Leu Asn Thr Ser Pro

340 345 350

Ser Val Ala Ser Pro Glu His Ser Val Glu Ser Ser Ser Tyr Gly Asp

355 360 365

Thr Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ser Glu Val Glu Glu Leu Asp Ser Ala

370 375 380

Pro Gly Ser Val Lys Gln Asn Gly Pro Lys Thr Pro Val His Ser Ser

385 390 395 400

Gly Asp Met Val Gln Pro Leu Ser Pro Ser Gln Gly Gln Ser Thr His

405 410 415

Val His Asp Ala Gln Cys Glu Asn Thr Pro Glu Lys Glu Leu Pro Val

420 425 430

Ser Pro Gly His Arg Lys Thr Pro Phe Thr Lys Asp Lys His Ser Ser

435 440 445

Arg Leu Glu Ala His Leu Thr Arg Asp Glu Leu Arg Ala Lys Ala Leu

450 455 460

His Ile Pro Phe Pro Val Glu Lys Ile Ile Asn Leu Pro Val Val Asp

465 470 475 480

Phe Asn Glu Met Met Ser Lys Glu Gln Phe Asn Glu Ala Gln Leu Ala

485 490 495

Leu Ile Arg Asp Ile Arg Arg Arg Gly Lys Asn Lys Val Ala Ala Gln

500 505 510

Asn Cys Arg Lys Arg Lys Leu Glu Asn Ile Val Glu Leu Glu Gln Asp

515 520 525

Leu Asp His Leu Lys Asp Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Glu Lys Gly

530 535 540

Glu Asn Asp Lys Ser Leu His Leu Leu Lys Lys Gln Leu Ser Thr Leu

545 550 555 560

Tyr Leu Glu Val Phe Ser Met Leu Arg Asp Glu Asp Gly Lys Pro Tyr

565 570 575

Ser Pro Ser Glu Tyr Ser Leu Gln Gln Thr Arg Asp Gly Asn Val Phe

580 585 590

Leu Val Pro Lys Ser Lys Lys Pro Asp Val Lys Lys Asn

595 600 605