小檗碱在制备治疗难治性Hp感染的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及小檗碱在制备治疗难治性Hp感染的药物中的用途。

背景技术

1983年两位澳大利亚学者发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的病因。随后发现Hp感染与胃癌的发生密切相关，是慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一演变过程的始动因素。Hp在全球自然人群的感染率17％～90％。目前相关研究认为，约90％非贲门癌的发生与Hp感染有关。Hp感染是目前预防胃癌最重要的可控的危险因素，根除Hp应成为胃癌的一级预防措施。

目前尽管有多种方案用于Hp的根除治疗，但是仍有20-30％患者不能成功根除，这除了与Hp菌株对抗生素的耐药性、cagA基因分型、Hp球形变、不同菌株混合感染等因素有关外，细菌的内化是Hp根除失败的原因之一。过去认为Hp是一种非侵袭性的病原体，一般只粘附于胃黏膜上皮细胞或在胃腔内存活，但是目前研究证实Hp不仅可在胃黏膜细胞表面生存，还可进入胃黏膜上皮细胞，并在其中存活。

细菌内化可以逃避在细胞外具有抗菌活动性的抗生素的作用，避免被抑制或杀灭，并可在适时的时候再次从细胞中出来，在胃黏膜表面定植并大量繁殖。因此，寻找针对Hp细胞内化的治疗靶点在当前至关重要。

小檗碱(Berberine)亦称黄连素，1826年M.-E.夏瓦利埃和G.佩尔坦从Xanthoxylonclava树皮中首次从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，是黄连抗菌的主要有效成分，临床主要用于治疗肠道感染。小檗碱抗菌谱较广，体外对溶血性链球菌、金葡菌、霍乱弧菌等多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用，且与青霉素、链霉素等并无交叉耐药性。小檗碱的抗菌机理尚未完全阐明，有研究认为是抑制了细菌的RNA、蛋白质和脂质的生物合成；也有部分研究认为可能是与菌体内DNA形成复合物而影响DNA的复制，干扰细菌繁殖。此外，近年来研究发现，小檗碱在调节肠道菌群、调节血脂、血糖代谢、抗心律失常及抗肿瘤方面亦发挥着重要作用。

随着Hp耐药的不断增多，小檗碱在抗Hp方面的潜在作用也受到关注。研究证实，小檗碱在体外发挥着抗Hp作用(MIC50＝12.5mg/mL)。也有研究认为，在传统三联方案的基础上增加小檗碱，可以提高Hp根除率、促进溃疡愈合、及改善相关临床症状。Wu等通过小鼠实验证实，小檗碱抑制Hp相关胃炎的机制可能与其调节Th17细胞反应有关；小檗碱可负向调控IRF8-IFN- γ信号通路，降低IL-17,CXCL1和CXCL9等炎症因子的。然而，小檗碱对胞内Hp是否有清除作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小檗碱在制备治疗难治性 Hp感染的药物中的用途，该含有小檗碱的药物能通过调控靶向自噬-溶酶体通路有效清除人体内难治性幽门螺杆菌和人类胃黏膜上皮细胞内幽门螺杆菌，用于难治性Hp感染具有显著效果。

为实现上述目的，本发明提供一种小檗碱在制备治疗难治性Hp感染的药物中的用途。

本发明通过构建Hp活菌与胃黏膜上皮细胞共培养模型及Hp感染小鼠模型，发现小檗碱可以有效降低Hp在细胞内及动物胃内的定植与感染，同时通过进一步的研发现，小檗碱通过调控靶向自噬-溶酶体通路进而有效清除细胞内Hp，同时还具修复自噬-溶酶体通路的功能。

进一步的，所述难治性Hp感染是指经根除失败2次及以上次数的Hp感染。

一般而言，“难治性”在临床上的定义需要药物、剂量、疗程的说明，而对于Hp的治疗，从药物方面讲：其组成复杂，方案众多；从剂量方面讲：有一定范围；从疗程方面讲：不统一，有10d～14d疗程，因此其定义难以标准化。目前对于“难治性Hp感染”的定义，大多都提到按照相关共识推荐。因此，发明人将此研究中的“难治性Hp感染”也可称之为“多次治疗失败”的Hp 感染，定义为根除失败≥2次的Hp感染。

进一步的，所述难治性Hp感染是指细胞内Hp感染。

进一步的，所述小檗碱通过靶向自噬-溶酶体通路清除Hp。

进一步的，所述小檗碱通过靶向自噬-溶酶体通路清除细胞内Hp。

进一步的，所述药物通过小檗碱降低Hp在细胞内及动物胃内的定植和感染。

进一步的，所述治疗难治性Hp感染的药物为片剂、粒剂或丸剂。

进一步的，所述治疗难治性Hp感染的药物使用时，口服，0.3-0.6g小檗碱/次，一日3次。

本发明具有的有益效果是：

本发明通过研究发现，小檗碱能降低Hp在细胞内及动物胃内的定植与感染，同时能以靶向自噬-溶酶体通路为清除细胞内Hp及难治性Hp的治疗靶点，所制备的药物可用于根除难治性Hp和细胞内Hp，效果显著；

本发明通过挖掘小檗碱能清除细胞内Hp和调控自噬-溶酶体通路的新机理，同时结合多种经典实验方法，对开发新的根除Hp感染方案具有重要的科学和实践意义，最终为制订高效的Hp根除方案奠定理论基础；

本发明的新机理目前尚未见同类研究报道，该研究结果将进一步为揭示宿主和病原菌的互作关系提供新思路，也将为根除失败的难治性Hp感染人群提供新的治疗途径。

附图说明

图1为本发明实施例1中荧光定量PCR检测结果图；

图2为本发明实施例1中免疫荧光检测结果图；

图3为本发明实施例1中细菌菌落总数检测结果图；

图4为本发明实施例2中荧光定量PCR检测结果图；

图5为本发明实施例2中免疫荧光检测结果图；

图6为本发明实施例2中细菌菌落总数检测结果图；

图7为本发明实施例3中荧光定量PCR检测结果图，其中a为幽门螺杆菌532，b为幽门螺杆菌536；

图8为本发明实施例4蛋白免疫印迹实验结构图；

图9为本发明实施例5蛋白免疫印迹实验结构图；

图10本发明实施例6中添加有巴弗洛霉素A1的荧光定量PCR检测结果图；

图11本发明实施例6中添加有渥曼青霉素的荧光定量PCR检测结果图；

图12本发明实施例6中添加有3-甲基嘌呤抑制剂的荧光定量PCR检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的原料若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。

本发明所使用的相关试剂、指标及解读：

细胞为：人类胃黏膜上皮细胞HFE145；

小鼠造模流程为：

A组(对照组)：C57BL/6小鼠(每组8只)未经任何处理；

B组(感染组)：C57BL/6小鼠(每组8只)感染或不感染幽门螺杆菌PMSS1 菌株3周，定植一个月；

C组(小檗碱组)：C57BL/6小鼠(每组8只)感染幽门螺杆菌PMSS1菌株 3周，定植一个月，然后每隔一天给予小檗碱(40mg/kg)，连续3周。

CTSD(组织蛋白酶D)：是一种主要的溶酶体天冬氨酸蛋白酶，负责蛋白质的长期降解；CTSD蛋白从其无活性前体(Pre-CTSD)向成熟形式 (Mature-CTSD)的转化被认为是溶酶体成熟和降解功能的标志之一。

p62和LC3B：p62和LC3B是自噬成熟的标志物；LC3B-I向脂化形式 LC3B-II的转化是自噬体形成的标志之一，而p62降低则表明自噬通量的动态变化。

下面结合图示和实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：小檗碱清除人类胃黏膜上皮细胞内的幽门螺杆菌

1、荧光定量PCR实验

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(MOI 100:1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别用不同浓度的小檗碱(0μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)处理16小时。细胞内幽门螺杆菌的含量采用实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA，GAPDH作为内部对照，荧光定量PCR结果如图1所示，其中，*P<0.05；**P<0.01；***P< 0.001。

结果：从图1的结果可以看出，与单纯感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(未添加小檗碱)的HFE145细胞内幽门螺杆菌表达量相比，加用不同浓度小檗碱后细胞内的幽门螺杆菌含量明显依次降低，差异具有统计学意义。

2、免疫荧光实验

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(MOI 100:1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别不用小檗碱和用小檗碱(20μg/mL) 处理16小时。细胞内幽门螺杆菌的含量采用免疫荧光进行检测，观察细胞核中幽门螺旋杆菌的含量，比例尺为10μm，结果如图2所示。

结果：从图2的结果可以看出，与单纯感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(未添加小檗碱)的HFE145细胞内幽门螺杆菌表达量相比，加用小檗碱后细胞内的幽门螺杆菌含量明显降低。

3、CFU(细菌菌落总数)检测实验

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(MOI 100:1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别不用小檗碱和用小檗碱(20μg/mL) 处理16小时，之后两组细胞分别使用0.5％皂苷在室温下通透性15分钟，并用无菌PBS匀浆后，将连续稀释后的样品置于幽门螺杆菌选择血琼脂平板上，培养1周，计数两组血琼脂平板上的菌落数量，结果如图3所示，其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

结果：从图3的结果可以看出，与单纯感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(未添加小檗碱)的HFE145细胞组形成的幽门螺杆菌菌落数量相比，加用小檗碱后细胞组形成的的幽门螺杆菌菌落数量明显降低，差异具有统计学意义。

从上述三个实验结果可以得出，小檗碱可有效清除人类胃黏膜上皮细胞内的幽门螺杆菌，效果显著。

实施例2：小檗碱清除小鼠体内幽门螺杆菌

1、荧光定量PCR实验

方法：取B、C组小鼠的胃组织，并分别提取两组小鼠胃组织内幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA，两组小鼠胃组织中幽门螺杆菌的含量采用实时荧光定量PCR检测，GAPDH作为内部对照，结果如图4所示，其中，*P<0.05； **P<0.01；***P<0.001。

结果：从图4的结果可以看出，与单纯感染幽门螺杆菌菌株PMSS1小鼠 (B组)胃组织内幽门螺杆菌表达量相比，加用小檗碱后小鼠(C组)胃组织内的幽门螺杆菌含量明显降低，差异具有统计学意义。

2、免疫荧光实验

方法：取B、C组小鼠的胃组织，并分别使用石蜡包埋两组小鼠胃组织，切片后对小鼠胃组织内幽门螺杆菌的含量采用免疫荧光进行检测，观察细胞核中幽门螺旋杆菌的含量，比例尺为10μm，观察结果如图5所示。

结果：从图5的结果可以看出，与单纯感染幽门螺杆菌菌株PMSS1小鼠 (B组)胃组织内幽门螺杆菌表达量相比，加用小檗碱后小鼠(C组)胃组织内的幽门螺杆菌含量明显降低。

3、CFU(细菌菌落总数)检测实验

方法：取B、C组小鼠的胃组织，分别将两组小鼠胃组织在细菌冻存液中碾碎并用无菌PBS匀浆，后将连续稀释后的样品置于幽门螺杆菌选择血琼脂平板上孵育1周，培养1周，计数两组血琼脂平板上的菌落数量，统计结果如图6所示，其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

结果：从图6的结果可以看出，与单纯感染幽门螺杆菌菌株PMSS1小鼠 (B组)胃组织形成的幽门螺杆菌菌落数量相比，加用小檗碱后小鼠(C组) 胃组织形成的幽门螺杆菌菌落数量明显降低，差异具有统计学意义。

从上述三个实验结果可以得出，小檗碱可有效清除小鼠胃黏膜上皮细胞内的幽门螺杆菌，效果显著。

实施例3：小檗碱清除人类胃黏膜上皮细胞内难治性的临床幽门螺杆菌

荧光定量PCR实验：收集临床中难治性Hp感染病人的胃部幽门螺杆菌 532菌株及536菌株。

方法：

(1)人类胃黏膜上皮细胞HFE145感染临床幽门螺杆菌菌株532(MOI 100: 1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别不用小檗碱和用小檗碱(20 μg/mL)处理细胞16小时。细胞内幽门螺杆菌532的含量采用实时荧光定量 PCR检测幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA，GAPDH作为内部对照，结果如图7a所示；

(2)人类胃黏膜上皮细胞HFE145感染临床幽门螺杆菌菌株536(MOI 100: 1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别不用小檗碱和用小檗碱(20 μg/mL)处理细胞16小时。细胞内幽门螺杆菌536的含量采用实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA，GAPDH作为内部对照，结果如图7b所示，其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

结果：从图7的结果可以看出：

(1)与单纯感染临床幽门螺杆菌菌株532的HFE145细胞内幽门螺杆菌表达量相比，加用小檗碱后细胞内的幽门螺杆菌含量明显降低，差异具有统计学意义；

(2)与单纯感染临床幽门螺杆菌菌株536的HFE145细胞内幽门螺杆菌表达量相比，加用小檗碱后细胞内的幽门螺杆菌含量明显降低，差异具有统计学意义。

从上述实验结果可以得出，小檗碱可有效清除人类胃黏膜上皮细胞内难治性的临床幽门螺杆菌，效果显著。

实施例4：小檗碱修复人类胃上皮细胞内被幽门螺杆菌破坏的自噬-溶酶体功能

蛋白免疫印迹(Western blotting)实验：

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌TN2GF4菌株9小时后，用PBS 洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再加入小檗碱(20μg/mL)处理16小时，使用蛋白质印迹实验检测全细胞裂解液中CTSD、p62和LC3B的蛋白水平，结果如图8所示。

结果：与对照组细胞相比，感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4的HFE145细胞内Pre-CTSD蛋白水平增加，而Mature-CTSD蛋白水平减少，p62蛋白水平增加，LC3B-II的蛋白转化被抑制，加用小檗碱后细胞内三种蛋白水平基本恢复到与对照组一致。

从上述试验结果可以得出，与未感染幽门螺杆菌的人类胃黏膜上皮细胞相比，幽门螺杆菌感染可抑制人类胃黏膜上皮细胞内的自噬-溶酶体功能，而加用小檗碱后可重新激活人类胃黏膜上皮细胞内被幽门螺杆菌感染所抑制的自噬-溶酶体功能。说明小檗碱可有效修复人类胃黏膜上皮细胞内被幽门螺杆菌破坏的自噬-溶酶体功能。

实施例5：小檗碱修复小鼠胃黏膜上皮细胞内被幽门螺杆菌破坏的自噬- 溶酶体功能

蛋白免疫印迹(Western blotting)实验：

方法：取A组、B组及C组小鼠各3只，分别将三组小鼠胃组织碾碎后提取蛋白，使用蛋白质印迹实验检测全组织裂解液中CTSD、p62和LC3B的蛋白水平，结果如图9所示。

结果：从图9的结果可以看出，与对照组小鼠(A组)相比，感染幽门螺杆菌菌株PMSS1小鼠(B组)胃组织内Pre-CTSD蛋白水平增加，而 Mature-CTSD蛋白水平减少，p62蛋白水平增加，LC3B-II的蛋白转化被抑制，加用小檗碱小鼠(C组)胃组织内三种蛋白水平基本恢复到与对照组一致。。

从上述试验结果可以得出，与未感染幽门螺杆菌的小鼠相比，幽门螺杆菌感染可抑制小鼠胃黏膜上皮细胞内的自噬-溶酶体功能，而加用小檗碱后可重新激活小鼠胃黏膜上皮细胞内被幽门螺杆菌感染所抑制的自噬-溶酶体功能。说明小檗碱可有效修复小鼠胃黏膜上皮细胞内被幽门螺杆菌破坏的自噬-溶酶体功能。

实施例6：小檗碱通过自噬途径发挥清除人类胃黏膜上皮细胞内幽门螺杆菌的功能

1、荧光定量PCR实验

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(MOI 100:1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别只用小檗碱(20μg/mL)和添加小檗碱(20μg/mL)与自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(100μM)处理16h，细胞内幽门螺杆菌的水平采用实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA， GAPDH作为内部对照，结果如图10所示，其中，*P<0.05；**P<0.01；***P <0.001。

结果：从图10的结果可以看出，与单独使用小檗碱组相比，加用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1后细胞内的幽门螺杆菌含量明显增加，差异具有统计学意义。

从上述试验结果可以得出，单独使用小檗碱可以明显降低被幽门螺杆菌感染细胞内的幽门螺杆菌含量，而加用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1后小檗碱无法降低细胞内幽门螺杆菌含量，说明小檗碱清除人类胃黏膜上皮细胞内幽门螺杆菌的功能是通过自噬途径所介导的。

2、荧光定量PCR实验

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(MOI 100:1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别只用小檗碱(20μg/mL)和添加小檗碱(20μg/mL)与自噬抑制剂渥曼青霉素(5mM)处理16h，细胞内幽门螺杆菌的水平采用实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA，GAPDH 作为内部对照，结果如图11所示，其中*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

结果：从图11的结果可以看出，与单独使用小檗碱组相比，加用自噬抑制剂渥曼青霉素后细胞内的幽门螺杆菌含量明显增加，差异具有统计学意义。

从上述试验结构可以看出，单独使用小檗碱可以明显降低被幽门螺杆菌感染细胞内的幽门螺杆菌含量，而同时加用自噬抑制剂渥曼青霉素后小檗碱无法降低细胞内幽门螺杆菌含量，说明小檗碱清除人类胃黏膜上皮细胞内幽门螺杆菌的功能是通过自噬途径所介导的。

3、荧光定量PCR实验

方法：将HFE145细胞感染幽门螺杆菌菌株TN2GF4(MOI 100:1)9小时后，用PBS洗涤三次，然后加入庆大霉素100mg/L孵育1.5小时，以清除细胞外细菌，之后用PBS洗涤2次，再分别用小檗碱(20μg/mL)和/或自噬抑制剂3-甲基嘌呤抑制剂(5mM)处理16h，细胞内幽门螺杆菌的水平采用实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌特异性16S核糖体DNA，GAPDH作为内部对照，结果如图12所示，其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

结果：从图12的结果可以看出，与单独使用小檗碱组相比，加用自噬抑制剂3-甲基嘌呤抑制剂后细胞内的幽门螺杆菌含量明显增加，差异具有统计学意义。

从上述试验结果可以得出，单独使用小檗碱可以明显降低被幽门螺杆菌感染细胞内的幽门螺杆菌含量，而同时加用自噬抑制剂3-甲基嘌呤抑制剂后小檗碱无法降低细胞内幽门螺杆菌含量，说明小檗碱清除人类胃黏膜上皮细胞内幽门螺杆菌的功能是通过自噬途径所介导的。

综上所述，本发明利用小檗碱能修复和利用自噬-溶酶体通路的功能，可有效清除细胞内Hp和难治性Hp，效果显著，将小檗碱应用于制备治疗难治性 Hp感染的药物中，为根除Hp感染的方案提供重要科学指导和实践意义。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。