长牡蛎高温响应基因ATG7表达调控SNP标记及其在鉴定高温耐受牡蛎个体中的应用

技术领域

本发明属于基因工程与遗传育种领域，具体涉及长牡蛎高温响应基因 ATG7表达调控SNP标记及其在鉴定高温耐受牡蛎个体中的应用。

背景技术

牡蛎是全球性分布的贝类，在亚洲、欧洲、美洲、非洲都有分布，也是一种重要的经济物种，在我国占海水养殖产量的25％。但是自上世纪中期开始，世界范围内出现了夏季大规模死亡现象，很多学者认为这种现象可能与全球日益加剧的气候变化有关，温度是一个重要的影响因子。高温会使生物体处于脆弱的状态，降低牡蛎的免疫能力，使牡蛎更易死亡。因此确定牡蛎高温调控机制和如何提高牡蛎抗高温能力成为产业亟需解决的问题。

长牡蛎和福建牡蛎是进化上相近的两个姊妹亚种，也是我国沿岸分布的优势种和主养种。长牡蛎分布在我国长江口以北，而福建牡蛎分布在我国长江口以南，二者的栖息地环境存在巨大差异，尤其是年均海水表层温度差异可达6.6℃，年平均气温差异高达8.7℃。两者在纬度分布上的差异揭示了二者在温度适应上的差异性。福建牡蛎具有更高的热胁迫存活率、阿伦尼乌斯温度和Q

研究表明生物体应对高温胁迫响应的基因主要是参与细胞稳态和能量平衡的基因。课题组前期对渤海和南黄海两个存在遗传分化和群体结构的野生长牡蛎群体做选择位点分析结果显示ATG7基因的Fst值显著大于总体 Fst均值，受到强烈的选择作用。虽然已有研究报道ATG7基因与耐高温群体的分化有关，但是对于ATG7基因的表达调控机制尚不清楚。

发明内容：

本发明的目的在于提供长牡蛎高温响应基因ATG7表达调控SNP标记及其在鉴定高温耐受牡蛎个体中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种长牡蛎高温响应基因ATG7表达调控SNP标记，SNP标记为 SEQ ID NO:2所示序列中第251位碱基，突变类型为T/C(反式调控位点Marker14346-48)；或/和SEQ ID NO:2所示序列中第288位碱基，突变类型为C/T(反式调控位点Marker14346-85)。

所述第251位、第288位碱基基因型为纯合或杂合，且这两个标记相距很近完全连锁，构成有三种单倍型：CC、CT或TT。

一种用于检测SNP标记的引物组，所述引物组为特异性外围引物和单碱基延伸引物序列，

特异性外围引物为

Marker14346-48/85-F：5’-GATGTAATTTCGTAGATGCGTCG-3’；

Marker14346-48/85-R：5’-AACCCCCTCCTCCCTCCTA-3’；

和下述单碱基延伸引物基因序列中的至少一种，

Marker14346-48:

5’-TTAGATCTCAATTTATAAGTTCTACTGGTA-3’；

Marker14346-85:

5’-TTTTTTTTTTTGTATACAGGTAATACAATGTAGTTGTT-3’。

一种用于检测所述的SNP标记的试剂盒，包含所述的引物组。

SNP标记、引物组或试剂盒在鉴别高温耐受牡蛎个体中的应用。

一种鉴定高温耐受牡蛎个体的方法，通过对待测牡蛎进行SNP标记的检测，而后确定待测牡蛎的基因型，而后根据基因型确定高温耐受牡蛎的优势个体。

具体为：提取待测牡蛎的基因组DNA；利用所述的引物组，以待测牡蛎的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增包含目标SNP位点的片段，而后利用单碱基引物对SNP位点进行分型检测，进而鉴定待检测牡蛎的基因型，确定高温耐受牡蛎个体。

所述确定待检测牡蛎的SNP位点并进行分型检测：

a.提取的DNA样品作为PCR模板，利用权利要求3所述特异引物，进行外围扩增；外围引物序列为：

Marker14346-48/85-F：5’-GATGTAATTTCGTAGATGCGTCG-3’；

Marker14346-48/85-R：5’-AACCCCCTCCTCCCTCCTA-3’；

PCR反应体系：

PCR扩增的反应程序为：

b.SNaPshot PCR:以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，产物纯化后，进行一个个位点的检测，单碱基引物序列为：

Marker14346-48:

5’-TTAGATCTCAATTTATAAGTTCTACTGGTA-3’；

Marker14346-85:

5’-TTTTTTTTTTTGTATACAGGTAATACAATGTAGTTGTT-3’；反应体系：

反应程序：

c.利用上述扩增产物鉴定每个个体在2个标记的基因型。

本发明的优点：

本发明通过检测个体基因型的方法预测牡蛎个体高温响应基因的表达高低，可快速大批量筛选不同表达水平牡蛎个体，鉴定耐高温牡蛎，且可应用于育种中通过无损取样技术在繁育前检测亲本基因型，并选择目标基因型组合个体作为亲本，进行分子标记辅助选择育种，繁育抗高温的子代，也可以作为预测当今全球变暖的环境背景下牡蛎适应潜力的潜在标记。

本发明针对高温响应基因ATG7基因，获得与其表达水平显著相关的两个潜在调控标记，即ATG7的上游调控位点：Marker14346-48、 Marker14346-85，且Marker14346-48和Marker14346-85上游3kb左右有个转录因子RNF1，已有研究报道过该转录因子可以通过结合在ATG7 基因启动子区调控ATG7基因的表达，可见这两个调控位点可通过介导 RNF1的表达进一步调控ATG7基因的表达；并鉴定出最佳基因型组合，其中，Marker14346-48标记优势基因型(TC)比劣势基因型(TT)ATG7 基因表达量高33.8％；Marker14346-85标记优势基因型(CT)比劣势基因型(CC)ATG7基因表达量高31.0％，且后续可以通过鉴定牡蛎个体的基因型筛选高温响应ATG7不同表达水平的个体，进而筛选耐高温牡蛎亲本，用于牡蛎分子育种，也可以预测当今气候变化下牡蛎个体的适应潜力。

牡蛎高温响应基因潜在调控SNP位点的筛选，其优势在于可以快速大批量筛选不同表达水平的牡蛎个体，且可以在繁育前对亲贝进行基因型鉴定，筛选耐高温的牡蛎亲本，提高子代耐高温能力，也可以预测当今气候变化下牡蛎的适应潜力。本研究的结果可靠，获得的SNP位点可信度高，效果稳定。

附图说明

图1为ZF2-3家系106个牡蛎个体的ATG7基因表达量频率分布直方图。

图2为ATG7基因eQTL定位图。

图3为ATG7基因表达水平和调控位点Marker14346-48和 Marker14346-85基因型的关联图。

1.SEQ ID NO:1为长牡蛎ATG7基因全序列，序列特征长度：1721bp，基因ATG7，基因ID：CGI_10025698.

2.SEQ ID NO:2为ATG7基因表达调控的SNP标记序列，信息序列特征长度：501bp，scaffold1750,位点227035和227072，227035位点上下游250bp.

具体实施方式：

以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本发明利用通过对构建遗传图谱的106个长牡蛎和福建牡蛎回交F2 子代个体进行高温响应候选基因ATG7表达水平测定，进而进行eQTL 连锁定位，对于定位到的候选调控SNP位点，在另一长牡蛎和福建牡蛎回交家系中关联分析验证结果。

上述的高密度遗传图谱，上图标记为1,694个，标记间平均距离为 0.8cM，基因组覆盖度为98.7％。

所述的高温响应基因：自噬相关基因ATG7，序列为NO.1所示。

在作图的长牡蛎和福建牡蛎回交F2代家系106子代个体中检测每个个体ATG7基因的表达量，通过基因型和基因表达的连锁定位分析，定位到一些反式调控位点(trans-eQTLs)。经另一长牡蛎和福建牡蛎回交 F2代家系95个子代个体中做关联分析验证：得到Marker14346-48和 Marker14346-85位点与ATG7基因的表达显著相关(p<0.05)，可用于筛选抗高温牡蛎个体。

与高温响应基因表达相关的SNP标记筛选步骤是：

实验材料的构建：收集长牡蛎和福建牡蛎野生个体，构建两个长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系：父本是长牡蛎和福建牡蛎子一代个体，母本为采集于青岛的野生长牡蛎。

基因分型：采用精简基因组(GBS)对其中一个拟回交家系106个子代个体进行全基因组分型，并构建高密度遗传图谱。

基因表达量的测定：qRT-PCR法测定ATG7基因表达量。

eQTL连锁分析：利用MapQTL6软件通过区间作图法和多重QTL 定位法进行连锁定位，eQTL定位图见附图2，得到ATG7基因的两个候选反式调控位点Marker14346-48和Marker14346-85。

由上述可获得牡蛎高温响应基因：自噬相关基因ATG7。通过表达数量性状定位(eQTL)鉴定出ATG7基因的两个表达调控位点 Marker14346-48和Marker14346-85，并在另一独立群体中通过关联分析进一步验证了这两个位点与ATG7基因表达的相关性。针对这两个SNP 位点，开发了一种快速检测基因型的方法。Marker14346-48标记优势基因型(TC)比劣势基因型(TT)ATG7基因表达量高33.8％；Marker14346-85 标记优势基因型(CT)比劣势基因型(CC)ATG7基因表达量高31.0％。 Marker14346-48和Marker14346-85两个位点完全连锁，与ATG7基因的表达显著相关。后续可以通过鉴定牡蛎个体的基因型筛选高温响应ATG7不同表达水平的个体，进而筛选耐高温的牡蛎亲本，用于牡蛎育种，除此之外也为预测当今严峻的全球气候变化下海洋生物的适应潜力提供基础研究。本发明提供了两个与ATG7基因表达显著相关的SNP标记，其优势在于可以在苗种繁育前对亲贝基因型进行鉴定，提高子代对高温环境的耐受。本研究获得的SNP标记可信度高，结果稳定。

实施例1：

与高温响应基因表达相关的SNP标记筛选步骤是：

A)实验材料的构建：收集长牡蛎和福建牡蛎野生个体，构建两个长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系ZF2-3：父本是长牡蛎和福建牡蛎子一代个体，母本为采集于青岛的野生长牡蛎。

B)基因分型：采用精简基因组(GBS)对该家系106个子代个体进行全基因组分型，并构建高密度遗传图谱。详细步骤请参考Wang等的文章(Wang et al.2016)。

1.限制性内切酶双酶切2.设计接头及barcode 3.接头退火4.构建测序文库5.文库质检和上机测序6.利用Stack软件对原始Reads进行SNP 分型7.利用JoinMap 4.0构建遗传图谱

C)基因表达量的测定：qRT-PCR法测定ATG7基因表达量，ZF2-3 家系106个牡蛎个体ATG7基因表达量频率分布直方图见图1。

D)eQTL连锁分析：利用MapQTL6软件通过区间作图法和多重QTL 定位法相结合进行连锁定位依据区间作图法选择辅因子，并多次选择辅因子进行多重QTL定位，直至得到稳定的结果。置换检验3000次得到 LOD阈值，超过染色体水平的阈值的位点被认为是与目的基因表达显著相关的调控位点，得到ATG7基因的两个候选反式调控位点 Marker14346-48和Marker14346-85。eQTL定位图见附图2。

实施例2

利用上述获得位点验证其与ATG7基因表达相关：

A)实验样品的预处理：取长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系(ZF) 子代95个个体,父本是长牡蛎和福建牡蛎子一代个体，母本为采集于青岛的野生长牡蛎。分成单体清洗干净后置于35℃海水中应激，3小时后取鳃组织于液氮速存，后置于-80℃保存备用。

B)DNA的提取：按照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书提取95个牡蛎个体的DNA。Nanodrop 2000分光光度计测定 DNA浓度。采用1.0％凝胶电泳法进行质量鉴定。

C)基因分型：采用SNaPshot(多重单碱基延伸技术)检测每个个体目标位点(Marker14346-48和Marker-14346-85)基因型。

用上述提取的DNA模板，通过外围引物扩增出目的片段，进而对得到的PCR产物采用特异性的单碱基引物进行SNaPshot PCR，上机检测目标位点基因型。

1)外围引物对该SNP位点进行外围扩增：

模板：提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板；

外围引物序列：

Marker14346-48/85-F：5’-GATGTAATTTCGTAGATGCGTCG-3’；

Marker14346-48/85-R：5’-AACCCCCTCCTCCCTCCTA-3’；

反应体系：

反应程序：

2)采用特异性引物对该SNP位点进行检测：SNaPshot PCR：在该反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。

模板：上述PCR产物纯化后用作SNaPshot PCR的反应模板。

单碱基延伸引物序列：

Marker14346-48:

5’-TTAGATCTCAATTTATAAGTTCTACTGGTA-3’；

Marker14346-85:

5’-TTTTTTTTTTTGTATACAGGTAATACAATGTAGTTGTT-3’；

单碱基延伸引物稀释到10μM，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到Pooled Primers，进行SNaPshot PCR。

反应体系：

反应程序：

3)3730测序仪毛细血管电泳：鉴定每个个体在2个标记的基因型反应体系：

按照上述体系依次加入各组分后，95℃加热预变性5分钟，-20℃冷却后上3730测序仪进行毛细管电泳检测。

结果用Gene mapper 4.1软件进行准确位点数据分析，分析数据按照 SNP位点对应峰的情况进行基因分型；得到长牡蛎和福建牡蛎拟回交家系ZF的每个子代个体的基因型。分型结果见下表1。

表1

D)RNA的提取：使用天根RNAprep pure Tissue Kit试剂盒提取 RNA。Nanodrop2000分光光度计测定DNA浓度。采用1.0％凝胶电泳法进行质量鉴定。

E)ATG7基因表达量的测定：

定量PCR：针对ATG7基因的序列设计定量PCR引物，使用日本 TaKaRa公司SYBR荧光定量试剂盒进行实验，引物序列：

ATG7-F：5‘-CACTGGACACCCCTGAAC-3’

ATG7-R：5‘-GCAACAAAGAAACCCTGAT-3’

反应体系：

反应程序：

长牡蛎延伸因子elongation factor(CgEF)作为内参基因，基因表达水平通过内参进行归一，然后利用2

表2

E)关联分析：将上述获得ZF家系95个牡蛎个体在Marker14346-48 和Marker14346-85位点基因型数据和上述获得ATG7基因表达数据导入 Graph Primer软件进行关联分析，Mann-Whitney检验结果显示： Marker14346-48位点与ATG7基因的表达显著相关(p<0.0001)，ATG7 基因表达量：TC>TT；Marker14346-85位点与ATG7基因表达显著相关，表达量：CT>CC。两个标记连锁鉴定3种单倍型：CC、CT、TT，单倍型关联分析显示三种单倍型与ATG7基因的表达显著相关(p<0.001)。结果见下表3、表4和图2。

表3

表4

由上述表1和图2可看到Marker14346-48和Marker14346-85两个调控位点都与ATG7基因的表达显著相关：Marker14346-48位点的优势基因型是TC，对应ATG7基因的表达量高(即，Marker14346-48标记优势基因型(TC) 比基因型(TT)ATG7基因表达量高33.8％)；Marker14346-48位点的优势基因型是CT，对应ATG7基因的表达量高(即，Marker14346-85标记优势基因型(CT)比基因型(CC)ATG7基因表达量高31.0％)。且这两个标记完全连锁，鉴定得到三种单倍型，均与ATG7基因的表达显著相关。

实施例3

利用上述获得Marker14346-48和Marker14346-85两个调控位点与ATG7基因的表达显著相关，进一步验证两个标记基因型与高温耐受性之间的关系：对上述两个位点在福建牡蛎(高温耐受)和长牡蛎(高温敏感)验证其与高温耐受的关系：

A)实验样品的准备：分别在厦门和青岛采集野生福建牡蛎和长牡蛎个体各 50只用于后续实验。

B)DNA的提取：采用按照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书提取这100个牡蛎个体的DNA。Nanodrop 2000分光光度计测定 DNA浓度。采用1.0％凝胶电泳法进行质量鉴定。

C)基因分型：采用SNaPshot(多重单碱基延伸技术)检测每个个体目标位点(Marker14346-48和Marker-14346-85)基因型。

D差异分析：采用卡方检验的分析方法，检验两个位点的基因型在长牡蛎和福建牡蛎中的差异，进而构建基因型与高温耐受性的关联。结果显示 Marker14346-48和Marker-14346-85两个位点的基因型频率在长牡蛎和福建牡蛎中差异显著(P<0.01)：Marker14346-48位点的优势基因型(TC) 和Marker14346-85位点的优势基因型(CT)频率均在福建牡蛎中显著高于长牡蛎(见下表，0代表碱基类型与参考基因组一致，1代表突变碱基型)。

由上述可见，可通过本发明SNP标记鉴定牡蛎个体的基因型筛选高温响应ATG7不同表达水平的个体，进而筛选耐高温的牡蛎亲本，用于牡蛎育种，除此之外也为预测当今严峻的全球气候变化下海洋生物的适应潜力提供基础研究。本发明提供了两个与ATG7基因表达显著相关的 SNP标记，其优势在于可以在苗种繁育前对亲贝基因型进行鉴定，提高子代对高温环境的耐受。本研究获得的SNP标记可信度高，结果稳定。

序列表(1)NO.1的信息序列特征长度：1721bp

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：

分子类型：DNA

来源：长牡蛎

序列描述：

GATGGAACAGTTTCTGCAAGCTTATGACACATTCCAAGATGCTCAT CCAACATATCAGGGTTTCTTTGTTGCTGTCCTTTCTAAAGGGAACA TTGTAATTGAGGATGTAAAACATATGAACAAGTTTGAAAATACTC AGGAGATGTCATTTCAACAGGTGTACTTTGGATTCTGTGATCCCAG TAATATTGAGGACTATCCAGGCTGGCCTCTTAGGAATTTCCTGATG TTGATATCCTATCATTGGAAGGGAGACCTGCGAGGTGTAAATGTAC TGTGTTTGCGAGATAGGAGTCGAGACGGGACTCGAGATATATCAC ACAGTCTTCTGCTTTCCCTTAATGTCCCGGATATTAGGAATGTGCCAGAATGTCCAAAGTGTGTGGGTTGGGAGAAAAATGAAAAACAAA AGCTGGCTCCAAGATTTGTTAATCTCAGTGCTAGCATGGACCCCAC AAGACTGGCAGCCTCAGCTGTTGACCTCAATCTAAAGCTTATGAGA TGGAGGCTTCTCCCAGAGCTTGACCTTGACCTTATATCAAGGACAA AATGTCTGCTGCTAGGAGCTGGAACTCTTGGATGTAATGTGGCAAG GTGTCTGATGGGCTGGGGAGTAAGAACCATAACTCTGGTGGACAA TGGCCGCGTGTCTTACTCTAACCCAGTACGCCAGTCCTTGTTTCAG TTTGAAGACTGTGTAAAGGGAGGTAAGCCAAAAGCGGAGGCTGCT GCAGAGGCCATGAAGAAGATATTCCCTGGAGTGAATGCAAAAGGG TTGAGTTTATCCATTCCTATGCCTGGACATGCAGTACCTGAGAGTG CAATAGAGGGTGTGAAGAAAGACGTTGAAACCCTCCAGGATCTGG TGAATTCTCATGATGCAGTGTTTTTACTGTTGGATACGCGGGAGAG CCGTTGGCTTCCTACATTGATGGCAGCAGAAAAACAAAAGATAGT GATATGCTCTGCCCTGGGCTTTGACACATATCTAGTGATGCGCCAC GGCGTGAGGTCAGACACAGAGGGAGCTGACCCTGCCCCCCTGTCC TCTTACAGCTCCATCCCCGGGGATCAGCTAGGCTGCTACTTCTGCA ATGATGTAGTGGCACCAGGGAATTCTTTGAAGGACCGTACTCTGG ACCAGCAGTGTACAGTATCCAGGCCGGGCATCTCCTACATGGCGTCCGCGCTCGCCGTAGAACTCCTTGTGTCCGTGCTCCAGCATCCAGAA CTAGGGAAAGCCCCGGCGGATACAAGCGCTAGTGATGAGCACCTG AGTAAAGACTTTGTCTGCCCCCTAGGGCTGGTCCCTCACCAGCAGA TTCGATGCTTTGTGTCCCGCTTCCAGCAAGTGTTACCGGCCTGTAA GGCATTTGATAAATGTACAGCTTGTTCAAAGACTGTGATAGAACA GTTCCGACGGGACGGCTTTGACTTCCTGAGGCGGGCGTTCAATGAC CCGTCCTACCTGGAGGATCTTACAGGGCTCACACAGATGCATCAG GAAACCCTCGACGCTGAGGTGTGGGGGTTCAGTGATGACGAGGAA TGTAGCAGCATGGAAGTCTCCAGCTCTTGACCCAGTTTTAAATTGT GACCCAACTGAAGACTTTCATTTTTATTTTATTTATTTACCAATCAG ACATTTATCAGTGTTATAAGCTTTTCATGGTATTACATGTAATGTAC TTTTGTATTACATGTAATAAGTACATTGTAGC

序列表(1)NO.2的信息序列特征

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：

分子类型：DNA

来源：长牡蛎

序列描述：

AGTTAAATAAAACATCATTTAAATTCCAATTTTTGTGGATTGTGCG TTTTTTGCTTAATCATGGGGATGTAATTTCGTAGATGCGTCGGTTTT CAGTTTCAGTAAGGTAACAAACTCTTTCAAAATTTGTTTTCGTCGA GGATGTAAATTCGTGGGGAAGAGCTACCCACGAAGACAACGAAAA TTGAGCCACCATGAATTCAAATTATTCCACAGTAATCAAGATCTCA ATTTATAAGTTCTACTGGTATAAAAAAAATGTATACAGGTAATACA ATGTAGTTGTTCATGGTTGTAGTCCAAGTCTTATTTCACCATCTTTC ACTCAAATGTATCGAACTGTACGCCATTGGCAAAACTTTGTTCTAA TTCAAAACACTGGATGCACACTTCTTCTGTAGCTACATGTTGATCA ATCAATGTTTACCACAATGCATCACTGCCCCTAATAGTTTCGTTGT AGGAGGGAGGAGGGGGTTCATTGCCCATGGCTGGTCGATG 。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 长牡蛎高温响应基因ATG7表达调控SNP标记及其在鉴定高温耐受牡蛎个体中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1721

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatggaacag tttctgcaag cttatgacac attccaagat gctcatccaa catatcaggg 60

tttctttgtt gctgtccttt ctaaagggaa cattgtaatt gaggatgtaa aacatatgaa 120

caagtttgaa aatactcagg agatgtcatt tcaacaggtg tactttggat tctgtgatcc 180

cagtaatatt gaggactatc caggctggcc tcttaggaat ttcctgatgt tgatatccta 240

tcattggaag ggagacctgc gaggtgtaaa tgtactgtgt ttgcgagata ggagtcgaga 300

cgggactcga gatatatcac acagtcttct gctttccctt aatgtcccgg atattaggaa 360

tgtgccagaa tgtccaaagt gtgtgggttg ggagaaaaat gaaaaacaaa agctggctcc 420

aagatttgtt aatctcagtg ctagcatgga ccccacaaga ctggcagcct cagctgttga 480

cctcaatcta aagcttatga gatggaggct tctcccagag cttgaccttg accttatatc 540

aaggacaaaa tgtctgctgc taggagctgg aactcttgga tgtaatgtgg caaggtgtct 600

gatgggctgg ggagtaagaa ccataactct ggtggacaat ggccgcgtgt cttactctaa 660

cccagtacgc cagtccttgt ttcagtttga agactgtgta aagggaggta agccaaaagc 720

ggaggctgct gcagaggcca tgaagaagat attccctgga gtgaatgcaa aagggttgag 780

tttatccatt cctatgcctg gacatgcagt acctgagagt gcaatagagg gtgtgaagaa 840

agacgttgaa accctccagg atctggtgaa ttctcatgat gcagtgtttt tactgttgga 900

tacgcgggag agccgttggc ttcctacatt gatggcagca gaaaaacaaa agatagtgat 960

atgctctgcc ctgggctttg acacatatct agtgatgcgc cacggcgtga ggtcagacac 1020

agagggagct gaccctgccc ccctgtcctc ttacagctcc atccccgggg atcagctagg 1080

ctgctacttc tgcaatgatg tagtggcacc agggaattct ttgaaggacc gtactctgga 1140

ccagcagtgt acagtatcca ggccgggcat ctcctacatg gcgtccgcgc tcgccgtaga 1200

actccttgtg tccgtgctcc agcatccaga actagggaaa gccccggcgg atacaagcgc 1260

tagtgatgag cacctgagta aagactttgt ctgcccccta gggctggtcc ctcaccagca 1320

gattcgatgc tttgtgtccc gcttccagca agtgttaccg gcctgtaagg catttgataa 1380

atgtacagct tgttcaaaga ctgtgataga acagttccga cgggacggct ttgacttcct 1440

gaggcgggcg ttcaatgacc cgtcctacct ggaggatctt acagggctca cacagatgca 1500

tcaggaaacc ctcgacgctg aggtgtgggg gttcagtgat gacgaggaat gtagcagcat 1560

ggaagtctcc agctcttgac ccagttttaa attgtgaccc aactgaagac tttcattttt 1620

attttattta tttaccaatc agacatttat cagtgttata agcttttcat ggtattacat 1680

gtaatgtact tttgtattac atgtaataag tacattgtag c 1721

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttaaataa aacatcattt aaattccaat ttttgtggat tgtgcgtttt ttgcttaatc 60

atggggatgt aatttcgtag atgcgtcggt tttcagtttc agtaaggtaa caaactcttt 120

caaaatttgt tttcgtcgag gatgtaaatt cgtggggaag agctacccac gaagacaacg 180

aaaattgagc caccatgaat tcaaattatt ccacagtaat caagatctca atttataagt 240

tctactggta taaaaaaaat gtatacaggt aatacaatgt agttgttcat ggttgtagtc 300

caagtcttat ttcaccatct ttcactcaaa tgtatcgaac tgtacgccat tggcaaaact 360

ttgttctaat tcaaaacact ggatgcacac ttcttctgta gctacatgtt gatcaatcaa 420

tgtttaccac aatgcatcac tgcccctaat agtttcgttg taggagggag gagggggttc 480

attgcccatg gctggtcgat g 501