一种用于毛花猕猴桃赣猕6号品种鉴定的分子标记引物及开发和应用方法

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物。本发明还涉及用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物的开发和应用方法。

背景技术

猕猴桃是原产于中国的猕猴桃科猕猴桃属的特色浆果树，果实营养密度较高，花色多样极具观赏性，是鲜食与观赏兼备的多年生落叶藤本果树。目前，全世界共有猕猴桃属植物54个种及21个变种。猕猴桃的鲜果富含抗坏血酸和氨基酸，目前市场上主要以鲜食为主，也可加工成果脯、果酒、果汁等，均具有独特的风味，因此深受大众青睐。毛花猕猴桃为中国特有的猕猴桃属中的一个重要种类，广泛分布于浙江、福建、江西、湖南、广西、广东和贵州等地，是继中华猕猴桃和美味猕猴桃之后极具开发潜力的特色浆果，野生种质资源十分丰富。由于毛花猕猴桃分布范围狭小、均为二倍体、基因保守等因素，在外观形态上毛花猕猴桃表现出一致性较高。通过传统的观察树势、叶片形态、物候期、果实形状、花器官颜色等难以区分。猕猴桃种植区的频繁引种，更使得猕猴桃品种较混杂，普遍存在同名异物和同物异名现象。

利用分子标记技术鉴别品种已成为目前最为高效、精准且不易受环境影响的一种手段，分子标记技术已在柑橘、石榴、葡萄、桃上一些研究，可以利用其进行亲缘关系分析、种质鉴定等。其中SSR分子标记技术应用最为广泛，利用SSR进行分子身份证的构建已在许多物种上取得了成功，分子身份证构建不仅可以鉴别亲缘关系相近的种质，对于知识产权的保护也是十分重要的手段。

“赣猕6号”系从野生毛花猕猴桃自然变异群体中选育而成的品种。果实长圆柱形，果面密被白色短茸毛。果实中大，平均单果质量72.5g。果肉墨绿，可溶性固形物含量13.6%，可滴定酸含量0.87%，干物质含量为17.3%，抗坏血酸含量7.23 mg/g，果实成熟期为10月下旬。果实后熟达食用状态时易剥皮，肉质细嫩清香，风味酸甜适度。通过开发适用于毛花猕猴桃“赣猕6号”的分子标记，有利于从分子水平鉴定品种，更有利于知识产权的保护。

发明内容

本发明的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物。本发明的另外一个目的在于提供该分子标记引物在猕猴桃品种鉴定中的开发和应用方法。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记命名为EST-Ad42，EST-Ad42分子标记包括两个引物，分别为分子标记引物EST-Ad42-F和分子标记引物EST-Ad42-R，所述分子标记引物EST-Ad42-F结构为gttaatttgatcgggatgg，所述分子标记引物EST-Ad42-R结构为gaggagcttgagctgctat，退火温度为62℃。

本发明要解决的另一个问题是于提供一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物的开发方法，其步骤包括，

（1）从NCBI db EST数据库下载所有的猕猴桃EST序列，并利用SSR Hunter1.3软件，对所有下载的EST序列进行SSR筛查；

（2）SSR筛查的标准是：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为7次、5次、4次、4次、3次，获得中间序列；

（3）应用Primer 5.0软件设计猕猴桃EST-SSR引物；

（4）利用设计合成的引物，对毛花猕猴桃“赣猕6号”品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记EST-Ad42，EST-Ad42分子标记包括两个引物，分别为分子标记引物EST-Ad42-F和分子标记引物EST-Ad42-R，所述分子标记引物EST-Ad42-F结构为gttaatttgatcgggatgg，所述分子标记引物EST-Ad42-R结构为gaggagcttgagctgctat，退火温度为62℃。

为了获得更好的技术效果，步骤（3）中，猕猴桃EST-SSR引物的设计方法为，选取步骤（2）获得的中间序列200-300bp，输入Primer 5.0软件进行设计，设计参数为：引物序列22±2bp，产物大小150-200bp，引物GC含量40-55%，退火温度50-65℃。

本发明要解决的另一个问题是于提供一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物的应用方法，其步骤包括，

利用上述分子标记引物EST-Ad42-F和分子标记引物EST-Ad42-R对“赣猕6号”及“华特”、“赣绿1号”、“赣绿2号”等已报道品种的DNA进行扩增，使用8（w/v）%丙烯酰胺凝胶进行检测，硝酸银染色显影，凝胶图谱中的每一条带（DNA片段）作为一个分子标记，每条多态性带可视为一个等位基因，根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位点的二元数据，有带记为“1”，无带记为“0”，根据不同条带的大小和数目绘制成1/0矩阵，构建成特异性分子身份证，通过特异性分子身份证鉴定“赣猕6号”。

为了获得更好的技术效果，通过特异性分子身份证，对“华特”、“赣绿1号”、“赣绿2号”进行区分。

与现有技术相比，本发明的优点：

1.形态标记简单直观，但是易受环境条件影响，部分性状难以界定。分子标记操作简便，可随时取得植物组织用于检测；数量多，遍及整个基因组；多态性高，品种间存在许多等位变异。

2.本发明的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的DNA片段。该分子标记扩增稳定，能用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定。

3.本发明提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可从30个不同品种的猕猴桃中对毛花猕猴桃“赣猕6号”品种进行鉴定，利用分子标记EST-Ad42引物对DNA进行扩增，构建特异性的DNA分子身份证。

4.根据不同条带的大小和数目，对“华特”、“赣绿1号”及“赣绿2号”猕猴桃进行区分。

分子标记引物EST-Ad42-F结构：gttaatttgatcgggatgg；

分子标记引物EST-Ad42-R结构：gaggagcttgagctgctat。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均为来源于商业或公开的渠道。

实施例1

一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记命名为EST-Ad42，EST-Ad42分子标记包括两个引物，分别为分子标记引物EST-Ad42-F和分子标记引物EST-Ad42-R，所述分子标记引物EST-Ad42-F结构为gttaatttgatcgggatgg，所述分子标记引物EST-Ad42-R结构为gaggagcttgagctgctat，退火温度为62℃。

实施例2

一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物的开发方法，其步骤包括，

（1）从NCBI db EST数据库下载所有的猕猴桃EST序列，并利用SSR Hunter1.3软件，对所有下载的EST序列进行SSR筛查；

（2）SSR筛查的标准是：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为7次、5次、4次、4次、3次，获得中间序列；

（3）应用Primer 5.0软件设计猕猴桃EST-SSR引物；

猕猴桃EST-SSR引物的设计方法为，选取步骤（2）获得的中间序列200-300bp，输入Primer 5.0软件进行设计，设计参数为：引物序列22±2bp，产物大小150-200bp，引物GC含量40-55%，退火温度50-65℃；

（4）利用设计合成的引物，对毛花猕猴桃“赣猕6号”品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记EST-Ad42，EST-Ad42分子标记包括两个引物，分别为分子标记引物EST-Ad42-F和分子标记引物EST-Ad42-R，所述分子标记引物EST-Ad42-F结构为gttaatttgatcgggatgg，所述分子标记引物EST-Ad42-R结构为gaggagcttgagctgctat，退火温度为62℃。

实施例3

一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物的应用方法，其特征在于，

利用上述分子标记引物EST-Ad42-F和分子标记引物EST-Ad42-R对“赣猕6号”及“华特”、“赣绿1号”、“赣绿2号”等已报道品种的DNA进行扩增，使用8（w/v）%丙烯酰胺凝胶进行检测，硝酸银染色显影，凝胶图谱中的每一条带（DNA片段）作为一个分子标记，每条多态性带可视为一个等位基因，根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位点的二元数据，有带记为“1”，无带记为“0”，根据不同条带的大小和数目绘制成1/0矩阵，构建成特异性分子身份证，通过特异性分子身份证鉴定“赣猕6号”。

为了获得更好的技术效果，通过特异性分子身份证，对“华特”、“赣绿1号”、“赣绿2号”进行区分。

实施例4

一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物的应用方法，用于猕猴桃育种的应用，其步骤包括，

（1）按照CTAB法分别提取30个不同品种猕猴桃的DNA样品，并且稀释至150 ng/μl；

（2）参照以下PCR反应体系，加入相应试剂到灭菌后的200 μl离心管，涡旋仪振荡混匀后2000 rpm离心1 min；

表中上游引物为分子标记引物EST-Ad42-F：gttaatttgatcgggatgg，下游引物为分子标记引物EST-Ad42-R：gaggagcttgagctgctat；

（3）参照以下PCR反应程序，利用PCR仪进行扩增；

（4）用移液枪将PCR产物注入到制备好的8（w/v）%丙烯酰胺凝胶中进行检测，硝酸银染色显影，扫描图像保存至电脑，以50 bp DNA ladder为参照，估算扩增产物分子量；

（5）读取200-300bp分子量间的条带信息，凝胶图谱中的每一条带（DNA片段）作为一个分子标记，每条多态性带可视为一个等位基因，根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位点的二元数据，有带记为“1”，无带记为“0”；

（6）利用分子标记EST-Ad42扩增猕猴桃品种，根据不同条带的大小和数目绘制成1/0矩阵，构建成特异性分子身份证，见表1，有效鉴定毛花猕猴桃“赣猕6号”并区分“华特”，

序列表

<110> 江西农业大学

<120> 一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物及开发和应用方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 毛花猕猴桃(actinidia eriantha)

<400> 1

gttaatttga tcgggatgg 19

<210> 2

<211> 19

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<213> 毛花猕猴桃(actinidia eriantha)

<400> 2

gaggagcttg agctgctat 19。

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<110> 江西农业大学

<120> 一种用于毛花猕猴桃“赣猕6号”品种鉴定的分子标记引物及开发和应用方法

<160> 2

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<212> DNA

<213> 毛花猕猴桃(actinidia eriantha)

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<213> 毛花猕猴桃(actinidia eriantha)

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