公开/公告号CN114836442A
专利类型发明专利
公开/公告日2022-08-02
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院武汉病毒研究所;
申请/专利号CN202210249414.2
申请日2022-03-14
分类号C12N15/40(2006.01);C12N15/12(2006.01);C12N15/11(2006.01);C12N15/85(2006.01);C12N15/65(2006.01);C12N7/01(2006.01);C12Q1/70(2006.01);C12R1/93(2006.01);
代理机构北京金智普华知识产权代理有限公司 11401;
代理人张晓博
地址 430000 湖北省武汉市武昌区水果湖街小洪山中区44号
入库时间 2023-06-19 16:12:48
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-04-14
授权
发明专利权授予
2022-08-19
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/40 专利申请号:2022102494142 申请日:20220314
实质审查的生效
2022-08-02
公开
发明专利申请公布
技术领域
本申请涉及艾比湖病毒技术领域,尤其涉及艾比湖病毒的核酸组合物及其应用。
背景技术
艾比湖病毒(Ebinur Lake virus,EBIV),属泛布尼亚病毒科正布尼亚病毒属,是布尼亚韦拉(Bunyamwera)血清群的新成员,2014年在我国新疆艾比湖地区的凶小库蚊中首次分离得到。该病毒的粒子呈球形,有囊膜,基因组由三个相互独立的单链RNA片段构成,分别为L、M和S片段。前期研究发现,小鼠对EBIV高度易感,甚至极低的感染剂量(1PFU)也对小鼠致死。感毒小鼠的周围组织和中枢神经系统中均检测到病毒,且在肝脏、脾脏、胸腺和脑中均观察到明显的组织病理学变化。血液成分分析显示感染小鼠的白细胞、血小板减少,谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶明显升高。此外,EBIV感染在小鼠的血清,脾脏和大脑中可引起明显的细胞因子变化。值得注意的是,艾比湖周边人群血清流行病学调查结果表明,人群中存在 EBIV的IgM、IgG以及中和抗体,暗示该病毒对人类具备潜在的致病和感染风险。利用反向遗传学系统可获得人工重组的病毒,进一步还可用于研究病毒的复制、入侵、基因功能、药物筛选和疫苗开发等。然而,目前还未见利用反向遗传学系统构建重组艾比湖病毒的相关研究报导,其阻碍了对新发蚊媒艾比湖病毒的深入研究。
发明内容
有鉴于此,本申请的目的在于开发一种重组艾比湖病毒及其构建方法,以弥补现有技术中的对该病毒相关基因序列功能研究的空白,并为更加深入探讨该病毒致病性和传播机制等提供基础帮助。
第一方面,本申请实施例公开了用于表达重组艾比湖病毒相关蛋白的核酸序列组合,其中包括:艾比湖病毒L节段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示;艾比湖病毒M节段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示;艾比湖病毒S节段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示;以及绿色荧光蛋白的基因片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
第二方面,本申请实施例公开了质粒组合物,其中包括分别以SEQ ID NO.14、15、16和17 所示的核苷酸序列构建的重组质粒,用于构建野生型或重组艾比湖病毒。其中,术语“野生型艾比湖病毒”即在自然环境中筛选和分离得到的艾比湖病毒,术语“重组艾比湖病毒”即利用反向遗传学手段对所述的野生型艾比湖病毒拯救,或对野生型艾比湖病毒进行基因改造、基因标记、基因重组等得到的既能表达艾比湖病毒常规的遗传特性、还能过表达/缺失某些基因、亦或者能够表达某些标签基因的艾比湖病毒毒株。
第三方面,本申请实施例公开了用于第一方面所述的核酸组合物的引物组,其中包括:用于扩增如SEQ ID NO.14所示的核酸序列的引物对,如SEQ ID NO.1~2所示;用于扩增如SEQ ID NO.15所示的核酸序列的引物对,如SEQ ID NO.3~4所示;以及用于扩增如SEQID NO.16 所示的核酸序列的引物对,如SEQ ID NO.5~6所示。
第四方面,本申请实施例公开了用于扩增第一方面所述核酸组合物的试剂盒,其中包括第三方面所述引物组。
第五方面,本申请实施例公开了一种重组艾比湖病毒毒株,所述毒株携带如SEQID NO.14、15、16和17所示基因序列,并于2022年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCC NO.V202204。
第六方面,本申请实施例公开了一种重组宿主菌,携带如SEQ ID NO.14、15、16和17所示的核酸序列。
第七方面,本申请实施例公开了一种制备重组艾比湖病毒毒株的方法,所述方法包括以下步骤:用第三、四方面所述的引物组及试剂盒扩增出第一方面所述的核酸组合物;将所述基因序列与载体质粒连接,以得到第二方面所述的重组质粒;获得携带所述重组质粒的第六方面所述的重组宿主菌的阳性克隆培养物;从所述阳性克隆培养物中获得大量的所述重组质粒;将所述重组质粒转染至宿主细胞,并进行培养;收获转染后的培养物,所述培养物中含有所述重组艾比湖病毒毒株。
第八方面,本申请实施例公开了第一方面所述的核酸组合物的应用,所述应用包括制备重组艾比湖病毒、于体内外示踪的重组艾比湖病毒、表达与所述艾比湖病毒感染克隆的相关蛋白、筛选抗艾比湖病毒的药物、制备艾比湖病毒疫苗和制备艾比湖病毒检测相关产品中的至少一项。
与现有技术相比,本申请至少具有以下有益效果:
本申请中涉及的重组艾比湖病毒不仅对多种细胞具有感染性,可稳定传代,还带有绿色荧光,能够为体内外病毒示踪、病毒检测、抗病毒药物筛选、疫苗制备等领域中提供研究基础,具有十分重大的应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例提供的用于构建重组艾比湖病毒的重组质粒结构示意图;A:pLCK- EBIV-S质粒;B:pLCK-EBIV-eGFP/S质粒;C:pLCK-EBIV-M质粒;D:pLCK-EBIV-L质粒;E:重组艾比湖病毒的转染策略。
图2为本申请实施例提供的重组艾比湖病毒的L节段、M节段、S节段和线性化pLCK质粒的PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图。
图3为本申请实施例提供的重组质粒pLCK-EBIV-L菌落PCR产物、重组质粒pLCK-EBIV- M菌落PCR产物和重组质粒pLCK-EBIV-S菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图。
图4为本申请实施例提供的eGFP片段PCR产物、线性化重组质粒pLCK-EBIV-S PCR产物和重组质粒pLCK-EBIV-eGFP/S菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图。
图5为本申请实施例提供的重组艾比湖病毒的细胞感染示意图;A:紫外光激发下的感毒细胞图;B:明场下的感毒细胞图。
图6为本申请实施例提供的重组艾比湖病毒在BHK-21细胞中连续传10代的荧光稳定性鉴定图;A:P1-P10在BHK-21细胞中的感毒细胞图(紫外光激发);B:P1-P10病毒提取RNA后RT-PCR结果琼脂糖凝胶电泳示意图。
图7为利巴韦林和法匹拉韦对携带绿色荧光蛋白的重组艾比湖病毒的EC50(半最大效应浓度)值;横坐标为药物浓度的常用对数,纵坐标为抑制率。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂,均可从商业途径获得;未详细特别说明的方法均为常规实验方法,可从现有技术中获知。
本申请所用艾比湖病毒原始毒株是由新疆军区疾病预防控制中心从凶小库蚊(Culex modestus)中分离获得,并利用其扩增得到L、M和S节段,具体实施过程如下:
1、材料
毒株来源:原始毒株由新疆军区疾病预防控制中心从凶小库蚊(Cx.modestus)中分离获得。用PBS将库蚊漂洗3次,加入2mL DMEM细胞培养液反复研磨,3000r/min离心5min,离心上清液经0.22μm滤膜过滤后,取1mL接种于BHK-21细胞中(细胞培养在25cm
2、RT-PCR
将分离的艾比湖病毒进行倍比稀释,以感染复数(MOI)0.01的接种量接种至BHK-21细胞培养液(细胞浓度为1×10
结果如图2所示,将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和测序,用L-F及L-R引物 (SEQ ID NO.1~2所示)扩增的PCR产物在6970bp处有条带,用M-F及M-R引物(SEQ IDNO.3~4所示)扩增的PCR产物在4591bp处有条带,用S-F及S-R引物(SEQ ID NO.5~6所示)扩增的PCR产物在1002bp处有条带,依次为艾比湖病毒L、M和S节段,其核苷酸序列如SEQ IDNO.14~16所示。
1、pLCK-EBIV-L、pLCK-EBIV-M和pLCK-EBIV-S的构建
利用同源重组的方法,使用
三质粒转化过程:将制得的三个质粒(pLCK-EBIV-L、pLCK-EBIV-M和pLCK-EBIV-S)连接反应物分别取5μL转化入三管XL10(Vazyme)感受态细胞中,冰浴30min后42℃热激90s,再次冰浴2min后,向感受态中加入900mL LB培养基,在37℃200rpm的摇床中孵育1 h,然后取菌液涂在含有卡那霉素的平板上,在37℃培养箱中培养过夜。
三质粒菌落PCR过程:待平板上菌落长至可见大小后,挑取单菌落加入300μL LB培养基中,在37℃220rpm的摇床中孵育3~4h,之后吸取2μL菌液进行菌落PCR。
菌落PCR:使用2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)进行菌落PCR扩增反应,体系为50 μL:2×Rapid Taq Master Mix 25μL、上下游引物(见引物表1中L-F/R,M-F/R,S-F/R)各2 μL、菌液2μL、ddH
如图2所示,pLCK-F及pLCK-R引物(SEQ ID NO.7~8所示)扩增的PCR产物在2319bp处有条带,即为pLCK空载体的扩增产物。如图3所示,质粒pLCK-EBIV-L、pLCK-EBIV-M和pLCK-EBIV-S的菌落PCR结果显示,分别在6970bp、4591bp和1002bp处有条带,证明质粒连接成功。
2、pLCK-EBIV-eGFP/S的构建
本步骤中,由于I型猪捷申病毒自剪切多肽2A序列(P2A序列)长度太短仅66bp,不便于胶回收,故将其序列分别加入到引物eGFP-R和CS-F中,后续通过同源重组的方式将其插入到质粒中。使用引物的序列如表1所示。
表1
(1)扩增得到绿色荧光蛋白eGFP片段
以携带eGFP的质粒pcDNA3.1-eGFP(Biofeng)为模板,使用KOD One
PCR的反应体系为50μL:2×Reaction Mix Buffer 25μL、10μM eGFP-F 2μL、10μMeGFP- R 2μL、Template DNA 1μL、Nuclease-Free Water 20μL。扩增条件为:98℃10s、57℃5s、 68℃30s、16℃10min,循环数为25。
(2)扩增得到pLCK-EBIV-S线性化片段
以(1)中构建的pLCK-EBIV-S质粒为模板,使用KOD One
PCR的反应体系均为50μL:2×Reaction Mix Buffer 25μL、10μM CS-F 2μL、10μMCS-R 2μL、Template DNA 1μL、Nuclease-Free Water 20μL。扩增条件为:98℃10s、57℃5s、68℃30s、16℃10min,循环数为25。
(3)构建pLCK-EBIV-eGFP/S质粒
由于P2A仅66bp,所以将其加入到引物eGFP-R和CS-F中,再通过同源重组的方法将二者连接插入到载体中。同源重组的反应体系为20μL:5×Reaction Buffer 4μL、eGFP片段30 ng、cS片段60ng、Enzyme 2μL、Nuclease-Free Water 33μL。反应条件为:37℃30min,16℃ 10min。利用感受态XL10进行连接产物的转化,对培养出的单菌落利用引物eGFP-F与eGFP-R 进行菌落PCR,结果如图4所示,条带大小约为760bp。eGFP菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序,测序正确的克隆命名为pLCK-EBIV-eGFP/S。
本实施过程将上述制得的pLCK-EBIV-L、pLCK-EBIV-M和pLCK-EBIV-eGFP/S测序后的序列如SEQ ID NO.18~20所示,将三质粒共转染进入BSR-T7细胞,以制得重组艾比湖病毒。
1、制备方法
利用Nanodrop测定质粒pLCK-EBIV-eGFP/S、pLCK-EBIV-M及pLCK-EBIV-L的浓度;准备BSR-T7细胞(RE59683,Sciencell),将其接种到12孔细胞培养板中(每孔细胞数量为 2×10
病毒滴度检测:将拯救的病毒用DMEM培养液按10倍梯度稀释至10
2、结果
结果如图5所示,实验组使用波长为405nm的激发光激发后可见明显的绿色荧光,而对照组无荧光,由此表明按照上述过程制得的重组病毒可表达绿色荧光蛋白。
表2
同时通过表2结果显示,pLCK-EBIV-eGFP/S、pLCK-EBIV-M以及pLCK-EBIV-L三质粒共转染时质量比为1:2:3时,重组艾比湖病毒的拯救效率高于转染三质粒质量比为1:1:1。进一步的,本申请将构建的重组艾比湖病毒(命名为绿色荧光标记的重组艾比湖病毒rEBIV/eGFP/S)于2022年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCC NO.V202204。
进一步地,本申请还对重组艾比湖病毒连续传代的荧光信号稳定性进行研究,具体如下。
1、材料与方法
(1)准备BHK-21细胞(仓鼠肾细胞,武汉普诺赛生命科技有限公司)6孔板,培养基使用含有10%FBS(Gibco)的DMEM培养基(Gibco),待细胞长至40~50%时进行实验。
(2)取100μL上述获得的重组艾比湖病毒接种到BHK-21细胞中,在37℃培养箱孵育1h 后,弃去细胞上清液,加入含有2%FBS的DMEM培养基,放入温度为37℃和CO
(3)取P1-P10每代病毒进行RNA提取及RT-PCR。
(4)RNA提取:对P1-P10病毒各取200μL,使用S-48通量核酸提取仪(纳磁生物)及其配套试剂盒磁珠法病毒RNA提取试剂盒(纳磁生物)进行病毒RNA提取。
(5)RT-PCR:使用PrimeScript
2、结果
如图6所示的结果表明eGFP基因在P1-P10中稳定存在且可表达出绿色荧光蛋白。
进一步地,本申请实施例公开的重组艾比湖病毒还能应用于抗病毒药物的筛选,例如可用于抗病毒化合物的筛选。具体如下:
(1)准备BHK-21细胞96孔板,10
(2)去除96孔板中原有培养基,将病毒按感染复数(MOI)为0.01,体积为100μL/孔接种入96孔板,同时将稀释好的待测药物按100μL/孔分别加入同一块96孔板,与病毒液混匀,在温度为37℃,CO
(3)使用高内涵筛选(HCS)系统对96块板进行拍照及数据分析,测定每孔荧光数量,并计算每种化合物的Z因子:
(4)在显微镜下观察每孔细胞存活率(及每孔剩余细胞的百分比),使用GraphPadPrism 9软件计算药物的半最大效应浓度(EC50)并绘制EC50图。
如图7可看出,利巴韦林(Ribavirin)的EC
表3
以上实验结果证明,本申请中的稳定携带绿色荧光蛋白的重组艾比湖病毒能够为体内外病毒示踪、病毒检测、抗病毒药物、疫苗筛选等领域中提供研究基础,具有十分重大的应用前景。
以上所述,仅为本申请较佳的具体实施方式,但本申请的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 艾比湖病毒的核酸组合物及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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ccacccgtga aggtgagcca gtgagttgat tgcagtccag ttacgctgga gtctgaggct 4020
cgtcctgaat gatatcaagc ttgaattcgt t 4051
机译: 与腺病毒(AAV)相关的重组病毒,组合物,分离的衣壳蛋白,分离的或合成的核酸颗粒,生产重组病毒的方法,宿主细胞,掺入衣壳蛋白AAV片段的蛋白,人工蛋白,重组病毒,颗粒,方法向细胞提供转基因的方法,病毒序列血清型的鉴定方法,诊断工具,新病毒的分离方法,新血清型的病毒,分离的病毒,重组细胞,病毒的应用
机译: 与腺病毒(AAV)相关的重组病毒,组合物,分离的衣壳蛋白,分离的或合成的核酸颗粒,生产重组病毒的方法,宿主细胞,掺入衣壳蛋白AAV片段的蛋白,人工蛋白,重组病毒,颗粒,方法向细胞提供转基因的方法,病毒序列血清型的鉴定方法,诊断工具,新病毒的分离方法,新血清型的病毒,分离的病毒,重组细胞,病毒的应用
机译: 分离的负义单链RNA病毒,分离的或重组的核酸或其特定功能的mpv片段,载体,宿主细胞,分离的或重组的蛋白质分子或其特定的功能mpv片段,抗原,抗体,将病毒分离物鉴定为mpv,病毒分离物,用于病毒学和血清学诊断哺乳动物mpv感染的方法,用于诊断mpv感染的诊断试剂盒,病毒,核酸,载体,细胞宿主,蛋白质分子或其片段,抗原的用途,或抗体,药物组合物,用于治疗或预防mpv感染和呼吸道疾病以及获得可用于治疗疾病的抗病毒剂的方法。呼吸道,抗病毒药,病毒药的使用,禽apv感染的病毒学诊断和逻辑诊断方法,诊断测试的使用以及检测样品中针对mpv的抗体的方法