一种PEDV-IgA抗体水平间接ELISA检测方法

技术领域

本发明适于病毒检测技术领域，尤其涉及一种PEDV-IgA抗体水平间接 ELISA检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种高度传染性的肠道疾病，其特征是严重的水样腹泻、呕吐和脱水，给全球养猪业造成巨大的经济损失。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是属于冠状病毒科冠状病毒属，编码4个主要的结构蛋白，包括纤突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。PEDV可感染各个年龄段的猪，主要导致成年猪生长缓慢，新生仔猪高死亡率，死亡率接近100％。

传统的PEDV检测方法基于实验室检测，包括病毒分离、常规逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时RT-PCR、间接荧光抗体(IFA)分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)。然而，这些传统的方法费时费钱，特异性和灵敏度低，需要训练有素的技术人员和特殊的仪器。目前，不同类型的ELISA，包括间接ELISA，竞争ELISA和阻断的ELISA等，已经被广泛应用于猪场临床样品中PEDV的抗体水平的检测，但这些商品化的PEDV抗体检测试剂盒是基于PEDV特异性的单克隆或多克隆抗体的使用，这些抗体需要更多的支持成本，表现出低的表达量和高水平的不稳定性。

因此，目前急需一种新的PEDV检测方法来有效的解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PEDV-IgA抗体水平间接ELISA检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种PEDV-IgA抗体水平间接ELISA检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL稀释样品,37℃孵育1h， PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育40min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm吸光值；

(6)根据稀释样品的cut off值判断阴性样品和阳性样品。

优选地，所述猪流行性腹泻病毒NH-TA2020(Porcine epidemic diarrhea virus,strain NH-TA2020),病毒的生物保藏编号为：CCTCC NO.V202097，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏时间为2020年12月16日。

优选地，所述稀释样品包括血清样品，口腔样品，乳汁样品。

优选地，所述血清样品的稀释浓度为1；10,所述血清样品的cut off值为 0.359，当OD值≥0.359时，检测结果为阳性，当OD值<0.359时，检测结果为阴性。

优选地，所述口腔样品的稀释浓度为1：1，所述口腔样品的cut off值为0.336，当OD值≥0.336时，检测结果为阳性，当OD值<0.359时，检测结果为阴性。

优选地，所述乳汁样品的稀释浓度为1:100，所述乳汁样品的cut off值为0.606，当OD值≥0.606时，检测结果为阳性，当OD值<0.606时，检测结果为阴性。

本发明的有益效果是：

本研究建立的间接ELSIA方法利用从PEDV发病猪场分离到的用于猪场驯化PEDV毒株为原材料，建立了针对该毒株的间接ELISA检测方法，用于评估猪场驯化后血清、口腔液、乳汁样品中的PEDV IgA抗体水平的高低，与商品化试剂盒相比，在特异性、实用性上具有无法比拟的优势。

附图说明

图1商品化试剂盒的敏感性检测结果；

图2本发明检测方法的敏感性检测结果；

图3本发明检测方法的特异性检测结果；

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

筛选PEDV抗原的最佳包被浓度和HRP Goat@Pig IgA(H+L)的最佳稀释度

(1)PEDV-NH-TA2020病毒用CBS按照1：500，1：1000，1：1500，1：2000比例稀释后，每孔100μL，包被于酶标板中4℃过夜；

(2)5％脱脂奶粉37℃封闭1h，PBST洗三遍；

(3)每孔加入100μL 1：10稀释的血清，37℃孵育1h，PBST洗三遍；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体按照1：8000，1：10000，1：15000， 1：20000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，PBST洗三遍；

(5)TMB避光显色15min，加入50μL终止液终止，15min内读取OD450nm 吸光值，得到的结果如表1所示。

表1PEDV抗原的最佳包被浓度和HRP Goat@Pig IgA(H+L)的最佳稀释度的确定

从表1可以看出，P/N的最大值为7.09，PEDV抗原的最佳稀释度为1：1000， HRPG@P的最佳稀释度为1：15000。

实施例2

确定血清最佳稀释度

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL 1：10，1:20,1:40,1:80 和1:160的血清稀释样品,37℃孵育1h，PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育40min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm吸光值，

(6)根据稀释样品的cut off值判断阴性样品和阳性样品，得到的结果如表2所示。

表2血清最佳稀释度的确定

从表2可以看出，当血清的稀释度为1：10时，P/N值最大，所以血清样品的最佳稀释度为1：10。

实施例3

确定口腔液的最佳稀释度

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL 1：1，1:2,1:5,1:10和1:20的口腔液稀释样品,37℃孵育1h，PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育40min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm吸光值，

(6)根据稀释样品的cut off值判断阴性样品和阳性样品，得到的结果如表3所示。

表3口腔液最佳稀释度的确定

从表3可以看出，当口腔液的稀释度为1：1时，P/N值最大，所以口腔液的最佳稀释度为1：1。

实施例4

确定乳汁最佳稀释度

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL 1：50， 1:100,1:200,1:300,1:400和1:500的口腔液稀释样品,37℃孵育1h，PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育40min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm吸光值，

(6)根据稀释样品的cut off值判断阴性样品和阳性样品，得到的结果如表4所示。

表4乳汁最佳稀释度的确定

从表4可以看出，当口腔液的稀释度为1：100时，P/N值最大，所以口腔液的最佳稀释度为1：100。

实施例5

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL 1：50， 1:100,1:200,1:300,1:400和1:500的口腔液稀释样品,37℃孵育1h，PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育10,20,40或60min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min或15min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm 吸光值，

(6)根据稀释样品的cut off值判断阴性样品和阳性样品，得到的结果如表5所示。

表5最佳孵育和显色时间的确定

如表5所示，样品的最佳孵育时间为40min，加入TMB后的最佳显色时间为10min的时候P/N的值最大，因此最佳孵育时间为40min，最佳显色时间为 10min。

实施例6

按照如下步骤，分别检测55份阴性血清、55份阴性口腔液和40份阴性乳汁的OD值

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL稀释样品,37℃孵育1h， PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育40min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm吸光值；

(6)计算这些阴性样品各自的OD450nm平均值(Х)和标准方差(SD)。样品OD450 nm值≥X+3SD，样品OD450 nm值

检测55份已知阴性的血清的OD450nm的吸光值，其中，55份阴性血清的 OD450nm的吸光值平均值为0.17，SD值为0.063，为保证有99％的置信区间， cut-off值为平均值加3倍SD值，最终计算得到cut-off值为0.359；

检测55份已知阴性的口腔液的OD450nm的吸光值，其中，55份阴性口腔液的OD450nm的吸光值平均值为0.102，SD值为0.078，为保证有99％的置信区间，cut-off值为平均值加3倍SD值，最终计算得到cut-off值为0.336；

检测46份已知阴性的乳汁的OD450nm的吸光值，其中，46份阴性乳汁的 OD450nm的吸光值平均值为0.303，SD值为0.101，为保证有99％的置信区间，cut-off值为平均值加3倍SD值，最终计算得到cut-off值为0.606。

实施例7

本发明最终确定的检测方法

(1)将PEDV-NH-TA2020病毒使用CBS缓冲液按照1:1000比例稀释后，包被于96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜；

(2)使用5％脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST清洗三遍；

(3)在包被后的96孔板的每个孔中加入100μL稀释样品,37℃孵育1h， PBST清洗3次；

(4)将HRP Goat@Pig IgA(H+L)抗体用封闭液按照1：15000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育40min，PBST清洗三次；

(5)TMB显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm吸光值；

(6)根据稀释样品的cut off值判断阴性样品和阳性样品；

稀释样品包括血清样品，口腔样品，乳汁样品；

血清样品的稀释浓度为1；10,血清样品的cut off值为0.359，当OD值≥ 0.359时，检测结果为阳性，当OD值<0.359时，检测结果为阴性；

口腔样品的稀释浓度为1：1，口腔样品的cut off值为0.336，当OD值≥0.336时，检测结果为阳性，当OD值<0.359时，检测结果为阴性；

乳汁样品的稀释浓度为1:100，乳汁样品的cut off值为0.606，当OD值≥0.606时，检测结果为阳性，当OD值<0.606时，检测结果为阴性。

实施例8

敏感性检测

将8份阳性的血清进行倍比稀释后用建立的间接ELISA方法(图2)和商品化试剂盒比较最低稀释度(图1)。同时，用商品化试剂盒确定的180份阳性样品，确定该方法的敏感性。

从图中，可以看出，本发明检测方法的敏感性为97％。

实施例9

特异性检测

(1)使用本发明所提供的方法检测临床TGEV(30份)、PRRSV(26份)、SIV(20份)、CSFV(30份)、PCV(22份)、PRV(25份)，PEDV抗体阴性的血清共153份，PEDV抗体阳性(40份)的血清，检测本方法的特异性；

(2)同时用市售商品化试剂盒确定的80份阴性血清，确定该方法的特异性，实验结果如图2所示。

从图2可以看出，该方法的特异性为100％。

实施例10

一致性检测

(1)选取9份已知阳性血清通过板内板间差异来评价本发明检测方法的一致性，将9份阳性血清在同一批次包被的酶标板中试验，每份血清做3个重复孔，计算板内OD450nm吸光值的变异系数；

(2)将9份阳性血清在不同时间用不同批次包被的酶标板试验3次，计算板间OD450nm吸光值的变异系数，结果如表6所示。

表6间接ELSIA的重复性评价

从表6可以看出，本发明所提供的方法，重复性优异。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。