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2022-08-19
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K 7/06 专利申请号:2022106587682 申请日:20220613
实质审查的生效
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及多肽及自然杀伤细胞培养，具体涉及一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用。
背景技术
20世纪70年代初期，研究者在淋巴细胞中发现了自发性的细胞毒作用，找到了新的淋巴细胞亚群，将其命名为自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)。自然杀伤细胞是抗肿瘤及病毒的固有免疫细胞，在天然免疫中扮演着重要的角色，在早期抗肿瘤和免疫监视方面也具有重要的作用，并且无需抗原特异性识别就可以直接杀伤肿瘤细胞。由于自然杀伤细胞在人体的数量较少，限制了大规模的研究实验。研究其细胞生物学特征，并在体外扩增获得大量高纯度的NK细胞成为了热点问题。
多肽是氨基酸连结成的化合物，由肽键相连，通常指的是由三个或三个以上氨基酸组成的化合物。多肽可包括活性多肽和人工合成多肽，活性多肽作为蛋白质水解产物，具有一定生理作用。人工合成多肽可以根据需要自由控制氨基酸连接顺序，为构建多肽库提供了可能，成为活性筛选的重要来源。
基于促进人自然杀伤细胞增殖的多肽的发现，特提出本发明创造。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用。
本发明目的通过下述技术方案得以实现：
一种多肽，氨基酸序列为RNDWTMDEQ。
上述多肽在促进人自然杀伤细胞体外增殖中的应用。
上述多肽在制备促进人自然杀伤细胞体外增殖的培养基中的应用。
有益效果：
本发明提供的多肽具有促进人自然杀伤细胞增殖的作用，可用于开发制备促进人自然杀伤细胞体外增殖的培养基。
附图说明
图1为多肽的液相检测图；保留时间8.273min，HPLC纯度95.327％。
图2为NK细胞分离培养的流式鉴定图，代表NK细胞的CD3-CD56+表型比例显著升高。
图3为westernblot检测结果，多肽J组NK细胞中杀伤力相关蛋白表达明显升高。
具体实施方式
以下实施例仅用于具体介绍本发明的实质内容，但不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
序列为RNDWTMDEQ(Sequence NO.1)的多肽J由南京肽谷生物科技有限公司采用常规固相合成法合成。多肽J的分子式为C
NK细胞培养基，赛德特生物制药有限公司(主要组成成分为RPMI 1640、IL-15、IL-2、SCF，仅用于人淋巴细胞中分离的NK细胞的体外扩增培养，不具备对细胞的选择、诱导、分化功能)；RPMI 1640培养基和胎牛血清，GIBCO公司。
MTT试剂和单抗以及Westernblot一抗、二抗，碧云天。
二、实验方法
1、NK细胞分离培养
按照外周血分离培养NK细胞的操作规程，取健康志愿者外周抗凝血100mL，分离单个核细胞，用NK细胞培养基重悬接种于6孔板中于37℃、5％CO
2、MTT法检测NK细胞的体外增殖活性
取培养14d的NK细胞消化，用RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)重悬后按5×10
3、Western blot法检测NK细胞杀伤活性标志蛋白表达水平
取培养14d的NK细胞消化，用RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)重悬后按2.5×10
4、统计学分析
应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，多组均数比较用单因素方差分析(ANOVA)，两两组间比较用独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
三、实验结果
1、NK细胞分离培养
CD3-CD56+表型细胞的比例检测结果如图2所示，CD3-CD56+表型比例从培养起始的14.9％迅速上升到78.5％。CD3-CD56+表型细胞即为NK细胞。该检测结果表明已经成功从外周血中分离培养得到NK细胞。
2、NK细胞体外增殖活性
各组吸光度值如表1所示，多肽J-L组和多肽J-H组NK细胞的增殖活性明显强于对照组(与对照组比差异有统计学意义，*P<0.05)，且多肽J浓度越高NK细胞增殖活性越强(与多肽J-L组比差异有统计学意义，#P<0.05)。
表1各组吸光度值
3、NK细胞杀伤活性标志蛋白表达水平
Granzyme B、Perforin蛋白是NK细胞发挥杀伤活性的2个关键蛋白，其表达水平高低决定了NK细胞的杀伤活性强弱。Western blot检测结果如图3所示，多肽J-L组和多肽J-H组NK细胞中Granzyme B、Perforin蛋白表达水平明显高于对照组，且多肽J浓度越高这2个蛋白的表达水平越高。
上述结果说明，本发明提供的多肽具有促进人自然杀伤细胞增殖的作用，还可以提高NK细胞杀伤活性，可用于开发制备人自然杀伤细胞的培养基。
序列表
<110> 陈飞
<120> 一种多肽及在促进人自然杀伤细胞增殖并制备人自然杀伤细胞培养基中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Asn Asp Trp Thr Met Asp Glu Gln
1 5
机译： 包含cd56 +胎盘中间自然杀伤细胞的人胎盘灌洗液在制备药物中的用途
机译： 分离纯化DNA，肽，人和鼠sphk2的氨基酸序列，重组DNA的构建，宿主细胞。小鼠和人2型鞘氨醇激酶2型亚型的肽的制备方法，并检测抑制或促进2型鞘氨醇激酶活性的药物或药物，药物或产物的调节方法，用于治疗哺乳动物的生物学过程的方法，用于治疗或改善由细胞死亡引起的疾病的方法，增加或减少的细胞增殖用于治疗或管理由减少的细胞死亡或细胞增殖引起的疾病，以及用于治疗或改善由癌症，再狭窄和糖尿病性神经病变组成的组中的细胞异常迁移或运动导致的疾病。用于治疗或改善由细胞死亡引起的UIMA疾病的组合物可增加或减少细胞增殖。
机译： 制备hpG-CSF多肽产物的方法，及其在制备用于诱导人骨髓细胞增殖的药物中的用途
