一种探针捕获联合高通量测序技术在新型冠状病毒病原确认及变异检测中的应用技术

技术领域

本发明涉及一种新型冠状病毒病原检测技术领域，具体是一种探针捕获联合高通量测 序技术在新型冠状病毒病原确认及变异检测中的应用技术。

背景技术

自然界中存在着数量庞大的未知新型病毒种类，而人类认知的病毒只占所有潜在病毒 类型的0.1％，这些潜在的未知新型病毒极易造成新发病毒感染性疾病。近30年来全球出 现的新发传染病达100多种，并以每年新发2-3种的态势发展，对社会危害巨大，已经成 为全球公共卫生领域关注的焦点。由于新发传染病的不可预见性，这种病毒目前尚无有效 的疫苗储备。

因此，如何能够在潜伏期或感染早期，及时有效的检测出新冠病毒，从而达到准确的 诊断和有效的隔离，是控制传染病流行的最为有效的手段。采用快速、准确、灵敏、操作简便的检测技术，对病原体进行特异性强、敏感度高的实时检测，是防控疫情蔓延的至关重要的环节，因此提出探针捕获联合高通量测序技术在新型冠状病毒病原确认及变异检测中的应用技术对此进行解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种探针捕获联合高通量测序技术在新型冠状病毒病原确认 及变异检测中的应用技术，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种探针捕获联合高通量测序技术在新型冠状病毒病原确认及变异检测中的应用技 术，按如下步骤进行：

步骤一：捕获探针的制备，利用Global Initiative on Sharing All InfluenzaData 和GenBank和信息分析确定35种β种属冠状病毒序列，根据确定的基因序列设计并制备 特异杂交探针，将探针合成在液相芯片上，基于液相探针杂交的基因捕获技术能够更专注 于微生物基因组的某些特定区域，减少研究成本、降低来自宿主基因组或环境中的噪声， 在同等数据量下大大增加测序深度，帮助临床和科研工作者们更为快速、准确、低价的获 得目标微生物或微生物基因组上特定区段信息，为流行病原检测、微生物变异信息，难分 离和提取病原微生物研究等提供基因组学新思路和新方法，优化探针与芯片结合的反应条 件，研制出检测35种β种属冠状病毒的捕获芯片，对杂交捕获芯片包括捕获效率、覆盖度、测序深度和分布等方面的评估优化，同时优化探针制备RNA样品结合的反应条件，研 制能一次性同时检测35种β种属冠状病毒全基因组的探针捕获杂交技术；

步骤二：高通量测序，提取患者及疑似患者咽拭子、痰和肺泡灌洗液总RNA，构建总RNA文库并与液相芯片进行探针杂交，采用新一代测序技术对杂交产物进行高通量测序；

步骤三：生物信息分析流程建立，通过去除人来源基因组污染，比对病毒库基因组， 去除PCR重复及病毒进化树分析的步骤，建立能够准确区分35种β种属冠状病毒的生物信息分析流程；

步骤四：方法性能评估，使用现有市面上荧光定量PCR试剂盒验证该捕获芯片的准确 性，对该技术和形成的检测系统进行性能评估，确定该技术在检测实际样品时的性能；

步骤五：新型冠状病毒病原基因检测及其临床应用，在得到患者及家属知情同意和医 院伦理委员会同意的情况下，挑选在我院发热门诊，呼吸内科等科室就诊的新型冠状病毒 的疑似病例，利用上述已建立的体系对这些患者进行快速基因检测，明确基因诊断，在此 基础上，根据患者资料库中的临床信息，观察基因变异与临床表现的关系，探讨基因变异 在新型冠状病毒诊断及治疗过程中的临床意义，结合临床资料，建立新型冠状病毒的规范 化的基因诊断和筛查标准。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中35种β种属冠状病毒包括SARS、MERS和新型冠状病毒2019-nCoV。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中捕获探针需尽可能避开人源DNA/RNA同 源性重复，以提高探针捕获的特异性。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中的性能包括敏感度、特异度和重复度及稳 定性。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中临床资料包括临床症状、体征、各项检测 指标、实验室检测结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明研究出准确设计覆盖35种β种属冠状病毒的DNA捕获探针，并且避开人同源性重复。

2、本发明可建立了一种从患者咽拭子、痰和肺泡灌洗液中提取微量病毒RNA方法。

3、本发明可构建微量RNA捕获测序文库的实验方法。

4、本发明可建立对应的生物信息学分析流程。

5、本发明可持续跟踪病毒基因型变异及部分功能性分析。

6、本发明可与临床特征相结合，做联合分析探索。

7、本发明通过覆盖35种β种属冠状病毒整个基因组的捕获探针的研究，并联合高通 量测序技术建立35种β种属冠状病毒快速基因检测体系，在此基础上研究病毒基因序列变异规律，并进一步探讨基因变异与疾病的发病、进程及药物疗效的关系。不仅为暴发疫情的防控提供快速有效的技术支撑，更为患者的快速诊断提供服务。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，一种探针捕获联合高通量测序技术在新型冠状病毒病原确认及变异 检测中的应用技术，按如下步骤进行：

步骤一：捕获探针的制备，利用Global Initiative on Sharing All InfluenzaData 和GenBank和信息分析确定35种β种属冠状病毒序列，根据确定的基因序列设计并制备 特异杂交探针，将探针合成在液相芯片上，基于液相探针杂交的基因捕获技术能够更专注 于微生物基因组的某些特定区域，减少研究成本、降低来自宿主基因组或环境中的噪声， 在同等数据量下大大增加测序深度，帮助临床和科研工作者们更为快速、准确、低价的获 得目标微生物或微生物基因组上特定区段信息，为流行病原检测、微生物变异信息，难分 离和提取病原微生物研究等提供基因组学新思路和新方法，优化探针与芯片结合的反应条 件，研制出检测35种β种属冠状病毒的捕获芯片，对杂交捕获芯片包括捕获效率、覆盖度、测序深度和分布等方面的评估优化，同时优化探针制备RNA样品结合的反应条件，研 制能一次性同时检测35种β种属冠状病毒全基因组的探针捕获杂交技术；

步骤二：高通量测序，提取患者及疑似患者咽拭子、痰和肺泡灌洗液总RNA，构建总RNA文库并与液相芯片进行探针杂交，采用新一代测序技术对杂交产物进行高通量测序；

步骤三：生物信息分析流程建立，通过去除人来源基因组污染，比对病毒库基因组， 去除PCR重复及病毒进化树分析的步骤，建立能够准确区分35种β种属冠状病毒的生物信息分析流程；

步骤四：方法性能评估，使用现有市面上荧光定量PCR试剂盒验证该捕获芯片的准确 性，对该技术和形成的检测系统进行性能评估，确定该技术在检测实际样品时的性能；

步骤五：新型冠状病毒病原基因检测及其临床应用，在得到患者及家属知情同意和医 院伦理委员会同意的情况下，挑选在我院发热门诊，呼吸内科等科室就诊的新型冠状病毒 的疑似病例，利用上述已建立的体系对这些患者进行快速基因检测，明确基因诊断，在此 基础上，根据患者资料库中的临床信息，观察基因变异与临床表现的关系，探讨基因变异 在新型冠状病毒诊断及治疗过程中的临床意义，结合临床资料，建立新型冠状病毒的规范 化的基因诊断和筛查标准。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中35种β种属冠状病毒包括SARS、MERS和新型冠状病毒2019-nCoV。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中捕获探针需尽可能避开人源DNA/RNA同 源性重复，以提高探针捕获的特异性。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中的性能包括敏感度、特异度和重复度及稳 定性。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中临床资料包括临床症状、体征、各项检测 指标、实验室检测结果，探究新型冠状病毒基因组变异规律，探讨病毒基因变异与疾病的 发病、进程及药物疗效的关系。

从而建立基于探针捕获联合高通量测序技术的35种β种属冠状病毒快速基因检测体 系，

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。