用于治疗肾病综合征的中药组合物及其制备方法、用途

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体公开一种用于治疗肾病综合征的中药组合物及其制备方法、用途。

背景技术

肾病综合征(NS)是严重威胁人类健康的重要疾病之一，其是由肾小球疾病引起的，以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症以及不同程度的水肿等为特征的临床症候群。

西医治疗肾病综合征主要采用利尿剂和糖皮质激素，糖皮质激素有明显的肝损伤和糖尿病副作用，使其应用受到限制。

蒙药“蒜变剂泻药”冲击疗法为近500年的蒙医特色方剂，具有冲击疗法作用，过去70年在蒙医临床应用于急救、危重患者、中毒性疾病、肿瘤、浮肿、炎症、病毒感染等。该疗法来自扎赉特旗寺庙喇嘛祖师天仓喇嘛传授，天仓传授内蒙古名蒙医阿日木扎主任医师，阿日木传授于张全，张全博士历经31年临床应用。由于原有的“蒜变剂泻药”药方多用于急救及疑难症，且服药量较大，本研究发明人基于原方意图将其改进成具有冲击、康复、养生、保健作用的药剂，并减少临床使用量，使患者服用更加方便。

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种用于治疗肾病综合征的中药组合物，其按重量份数计由以下原料组成：巴豆800～1200份、红花800～1200份、肉豆蔻800～1200份、冰片300～400份、石膏300～400份、草果300～400份、丁香300～400份、白蔻300～400份、柯子800～1200份、大蒜1200～1500份、牛奶1200～1500份。

优选地，其按重量份数计由以下原料组成：巴豆1000份、红花1000份、肉豆蔻1000份、冰片350份、石膏350份、草果350份、丁香350份、白蔻350份、柯子1000份、大蒜1500份、牛奶1500份。

本发明还提供一种治疗肾病综合征的中药组合物的制备方法，其特征在于，将巴豆、石膏、草果、红花、丁香、豆蔻、白蔻、冰片、柯子、大蒜粉碎，与牛奶混合，成团，晒干，消毒，包装，即得。

本发明还提供了所述中药组合物在制备治疗肾病综合征的药物中的用途。

优选地，所述肾病综合征为II型糖尿病肾病、IgA肾病或高血压肾病。

本发明还提供一种用于治疗肾病综合征的药物，其包括所述中药组合物。

优选地，还包括药学上可接受的辅料或载体。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的组方中以大蒜为主，巴豆为冲击作用，红花、肉豆蔻、冰片、石膏、草果、丁香、白蔻为辅助，柯子粉、牛奶为协助作用，属于冲击疗法作用，相当于现代医学激素和化疗药物作用，但是与激素和化疗药物相比无副作用，复发率低，费用低，疗程更少，主要起到冲击、化瘀、解毒、解散、疏通、排毒的功效及治疗作用，具有康复、养生、保健的作用。

2、本发明提供的组方能够大幅度提升对各种肾病治疗及人体预防疾病、康复、养生、保健作用。

3、为了治疗各种肾病及扩大治疗五脏、心血管、肠道疾病，通过反复临床应用及观察，将传统的“蒜变剂泻药”由7味增加到11味，临床应用由15粒减少为1粒。经过临床观察及课题研究证明，该方剂大幅度提高了临床疗效，增加病种，改进疗效，具有用途广泛、痛苦减少、应用方便、康复养生、预防疾病等优势。

附图说明

图1是实验例1中各组小鼠GFR活体成像图片；A：正常组，B：T2DM组，C：DN组，D：强的松组，E：低剂量组，F：中剂量组，G：中剂量组；

图2是实验例1中各组小鼠肾脏HE染色(100×)；A：正常组，B：T2DM组，C：DN组，D：强的松组，E：低剂量组，F：中剂量组，G：中剂量组；

图3是实验例2中各组小鼠肾脏HE染色结果；A、正常对照组；B、IgA肾病组；C、阳性组；D、低剂量组；E、中剂量组；F、高剂量组；

图4是实验例2中IgA免疫荧光强度；A、正常对照组；B、IgA肾病组；C、阳性组；D、低剂量组；E、中剂量组；F、高剂量组；

图5是实验例2中各组小鼠肾脏组织透射电镜图；A、正常对照组；B、IgA肾病组；C、阳性组；D、低剂量组；E、中剂量组；F、高剂量组；

图6是实验例3中各组大鼠肾脏病理HE染色结果(100×)；A、正常组，B、高血压组，C、高血压肾病组，D、强的组，E、低剂量组，F、中剂量组，G、高剂量组；

图7是实验例3中各组大鼠肾组织中NLPR3和NF-κB在蛋白水平的表达；L、低剂量组；M、中剂量组；H、高剂量组。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供一种用于治疗肾病综合征的中药组合物，其按重量份数计由以下原料组成：巴豆800～1200份、红花800～1200份、肉豆蔻800～1200份、冰片300～400份、石膏300～400份、草果300～400份、丁香300～400份、白蔻300～400份、柯子800～1200份、大蒜1200～1500份、牛奶1200～1500份。

该用于治疗肾病综合征的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：将巴豆、石膏、草果、红花、丁香、豆蔻、白蔻、冰片、柯子粉粹，与牛奶、大蒜末混合，手工团粒，阴凉处晒干，红外线消毒包装。

上述中药组合物能够用于制备治疗糖尿病肾病、IgA肾病及高血压肾病的药物。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种用于治疗肾病综合征的中药组合物，由以下原料组成：巴豆1000g、红花1000g、肉豆蔻1000g、冰片350g、石膏350g、草果350g、丁香350g、白蔻350g、柯子1000g、大蒜1500g、牛奶1500g。

实施例2

一种用于治疗肾病综合征的中药组合物，由以下原料组成：巴豆1200g、红花1200g、肉豆蔻1200g、冰片400g、石膏400g、草果400g、丁香400g、白蔻400g、柯子1200g、大蒜1500g、牛奶1500g。

实施例3

一种用于治疗肾病综合征的中药组合物，由以下原料组成：巴豆800g、红花800g、肉豆蔻800g、冰片300g、石膏300g、草果300g、丁香300g、白蔻300g、柯子800g、大蒜1200g、牛奶1200g。

由于实施例1～3制备得到的中药组合物的效果基本相同，故以下仅以实施例1制备的中药组合物为例进行效果说明。

实验例1

对II型糖尿病肾病的治疗

1、实验试剂及仪器

荧光探针GFR-Vivo 680(PerkinElmer，NEV30000)、4％多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)、2.5％戊二醛固定液(SPI，100703)、苏木素伊红染色液(雷根生物，DH0006)、812包埋剂(SPI，90529-77-4)；

活体近红外光学成像系统(SWIR 1.0)、全自动生化分析仪(日本日立公司，7020)、脱水机(武汉俊杰电子有限公司，JJ-12)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司，JB-P5)、病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)、普通光学显微镜(Leica，NikonEclipseTi-SR)、超薄切片机(Leica，UC7)、钻石切片刀(Daitome，Ultra45°)、透射电子显微镜(FEI公司，TECNAI G 20TWIN)。

2、模型建立

选择db/db小鼠，在动物房适应饲养1周后，用0.6％戊巴比妥钠按照10ml/kg剂量按体重进行腹腔注射麻醉，去除背部毛发，小鼠俯卧，绑定小鼠四肢，用75％酒精涂抹裸露皮肤处后，涂碘伏消毒，找出肾的大约位置，切开皮肤及肌肉层约1cm，翻开肾周脂肪，找出左侧肾动脉和静脉及输尿管进行结扎，然后切除肾脏，依次缝合肌肉层和皮肤，再次消毒，将小鼠放入笼子，待清醒，术后将小鼠单独饲养，术后3d内每天腹腔注射抗菌素预防感染。

3、药物干预

II型糖尿病肾病小鼠模型建立成功后，将动物随机分为正常对照组、II型糖尿病组(T2DM组)、II型糖尿病肾病组(DN组)、强的松组、低剂量组(L)、中剂量组(M)、高剂量组(H)，强的松组给予30mg/kg强的松、低剂量组给予30mg/kg实施例1提供的中药组合物、中剂量组给予60mg/kg实施例1提供的中药组合物、高剂量组给予90mg/kg实施例1提供的中药组合物，正常对照组、II型糖尿病组和II型糖尿病肾病组分别灌胃等量的生理盐水，每组5只，每天固定时间灌胃一次，连续给药7天。

4、检测

4.1、尿微量白蛋白(mAlb)检测

分别于干预第3、6天将鼠放入小鼠代谢笼，收集动物尿液，用比色法测定小鼠24h尿微量白蛋白。

4.2、肾小球滤过率检测

每组小鼠连续给药7d后，尾静注射2nmol荧光探针GFR-Vivo 680(溶于100μL无菌PBS中)，45min后于活体近红外光学成像系统680nm荧光波长下检测信号，观察并比较不同处理组荧光变化情况。

4.3、HE染色观察病理变化

取肾脏组织，4％多聚甲醛固定48h，水洗过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋，制成4μm厚的石蜡切片，行HE染色，用光学显微镜在20倍物镜下观察拍照。

4.4、透射电镜观察肾组织形态学变化

将切好的肾脏组织置于2.5％的戊二醛固定液中4℃过夜，再用1％锇酸磷酸缓冲液室温固定2h，梯度酒精脱水，依次经丙酮：环氧树脂(2：1)、丙酮：环氧树脂(1：1)、环氧树脂渗透，37℃温箱内，每次渗透8～12小时，之后用环氧树脂包埋，60℃温箱中聚合48小时，超薄切片机切片80nm厚，铀铅双染色，室温干燥，电镜下观察、拍照。

5、结果

5.1尿微量白蛋白(mAlb)检测

各组动物mAlb结果如表1所示。

表1尿微量白蛋白(mg/L，

由表1可知，与正常组比较，DN组的mAlb明显升高，且差异具有显著性(P＜0.0001)；高剂量组与DN组比较，mAlb明显降低，差异显著，具有统计学意义(P＜0.0001)。

5.2、肾小球滤过率检测

各组动物GFR变化情况如图1所示。

由图1可知，正常组和T2DM小鼠肾小球滤过功能完全正常，而DN组GFR却显著下降，阳性对照强的松组较DN组改善显著，低剂量组效果较差，中剂量组有所缓解，高剂量组效果最好。

5.3、HE染色

各组小鼠肾脏HE染色(100×)如图2所示。

由图2可知，与正常组比较，T2DM组肾小管可见明显扩张，明显管状缘脱落，部分肾小球可见明显萎缩坏死，组织未见明显炎症细胞浸润；DN组肾小管可见明显扩张及明显管状缘脱落，组织可见少量炎症细胞浸润；强的松组肾小管可见轻微扩张，明显管状缘脱落，肾小球结构清晰可见，部分肾小球可见明显萎缩，组织未见明显炎症细胞浸润；高剂量组肾小管上皮细胞未见明显脱落水肿坏死，肾小球结构清晰可见，未见肾小球明显肿胀萎缩，组织未见明显炎症细胞浸润。由此可见，本发明提供的中药组合物对DN有显著的病理改善作用。

实验例2

对IgA肾病的治疗

1、方法

将IgA肾病小鼠随机分模型组、阳性组、实施例1低剂量组、实施例1中剂量组及实施例1高剂量组，阳性组给予30mg/kg强的松，实施例1低剂量组给药30mg/kg、实施例1中剂量组给药60mg/kg、实施例1高剂量组给药90mg/kg，空白对照小鼠以及IgA模型组小鼠灌胃同量的生理盐水，每组8只，每天固定时间灌胃一次，连续给药7天。

蛋白WB(蛋白质印迹)检测、电镜检测、病理及免疫荧光IgA检测(n＝8，每组8只小鼠，均取其中3只小鼠的右肾脏分别进行蛋白WB、电镜、病理检测，其它备用)中，取右肾脏分为2份，一份电镜液固定，用来进行电镜检测；一份冻存，用于WB实验。取左肾用4％PFA固定，用来固定包埋切片，进行HE染色及免疫荧光IgA检测。

A.光镜检查(n＝3)小鼠左肾组织经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋进行苏木精-伊红染色，光镜下观察系膜区系膜细胞及基质有无增生。

B.电镜检查(n＝3)小鼠右肾组织经2.5％戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间，用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次，1％锇酸固定液固定2.5小时，用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分三次。

脱水：50％乙醇20分，70％乙醇20分，90％乙醇20分。样本包埋：经0.1mol L-1的磷酸缓冲液清洗3次后，再用1％锇酸于4℃下振荡固定3h；然后用缓冲液清洗3次，乙醇逐级脱水，环氧丙烷置换，Spurr树脂浸透包埋；最后在70℃烘箱中聚合。切片染色观察：将不同材料的包埋块置于超薄切片机上进行切片，超薄切片厚度70nm，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜下观察并拍照。

C.免疫荧光(n＝3)与A中HE染色共用样本，小鼠肾组织经4％PFA固定，石蜡包埋，5μm切片依次经二甲苯ⅰ20min，二甲苯ⅱ20min，95％乙醇5min，95％乙醇ⅱ5min，双蒸水5min×3次，3％h2o210 min,pbs 5min×3次，抗原修复(微波炉中高火5min,低火15min)，自然冷却，pbs 5min×3次，5％羊血清1h，兔抗大鼠IgA(博奥森公司，bs-0774R)(1∶100)，4℃过夜，pbs 5min×3，fitc标记羊抗兔IgG(1∶100)4℃过夜，pbs 5min×3，甘油封片，荧光显微镜下观察摄像。蛋白免疫印迹(n＝3)取出右侧肾组织冻存的样本，按比例加入蛋白裂解液充分裂解，提取总蛋白，进行BCA蛋白定量，通过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、ECL显色，观察核转录因子Kappa B(NF-KB)、炎症小体(NLRP3)在肾脏表达变化。

2、结果

2.1各组肌酐、尿素氮、胱抑素和24h尿微量白蛋白含量见表2。

表2肌酐、尿素氮、胱抑素和24尿微量白蛋白

注：

由表2可知，与IgA肾病模型组比较，实施例1中剂量组和高剂量组的肌酐、尿素氮、胱抑素和24h尿微量白蛋白均显著下降(P＜0.0001)，说明本发明提供的中药组合物对肾功能具有较佳的修复作用。

2.2HE染色

结果如图3所示。

由图3可知，IgA肾病模型组小鼠肾组织主要表现为系膜细胞及基质明显增生，毛细血管腔部分闭锁，部分小管扩张；光镜下正常对照组小鼠肾小球、肾小管及间质组织形态结构未见异常，系膜细胞及细胞基质未见增多；高剂量组系膜细胞及基质增生减少，毛细血管腔结构基本恢复正常，说明本发明提供的中药组合物对肾脏结构具有很好的恢复作用。

2.3IgA免疫荧光

结果如图4所示。

由图4可知，与正常组比较，IgA肾病组肾小球系膜区有大量IgA表达，表达强度约为正常组的6倍，低剂量组治疗效果较差，与模型组表达强度基本一致，高剂量组表达量最低，说明本发明提供的中药组合物对小鼠IgA肾病具有较好的治疗效果。

2.4透射电镜

结果如图5所示。

由图5可知，IgA肾病模型组小鼠肾小球系膜区有大量电子致密物沉积，而正常组小鼠肾小球系膜区无或有少量的电子致密物沉积，高剂量组与模型组比较，只有少量的电子致密物沉积。表明本发明提供的中药组合物对IgA肾病的良好治疗效果。

综上，本发明提供的中药组合物通过抑制肾小球系膜中IgAICs沉积，修复肾小球系膜结构来恢复肾小球结构功能，且能够降低动物的尿蛋白含量，减少红细胞渗漏，改善IgA肾病。

实验例3

对高血压肾病的治疗

1、实验动物

购买70只SPF级大鼠(购自维通利华)，其中WKY大鼠10只，SHR高血压大鼠60只，11周龄，雌雄各半。将大鼠饲养于温度22～25℃、湿度65％的饲养室内，昼夜轮替交换光照12h。

2、实验试剂

4％多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)、2.5％戊二醛固定液(SPI，100703)、苏木素伊红染色液(雷根生物，DH0006)、812包埋剂(SPI，90529-77-4)、Anti-NF-KB抗体(abcam，ab32360)、Anti-NLRP3抗体(affinity，DF7438)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZSGB-BIO，ZB-2301)、BCA法蛋白质定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，P1511)。

3、主要仪器

全自动生化分析仪(日本日立公司，7020)、大鼠无创血压计(北京众实迪创科技有限公司，ZS-Z)、脱水机(武汉俊杰电子有限公司，JJ-12)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司，JB-P5)、病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)、普通光学显微镜(Leica，NikonEclipseTi-SR)、台式低速离心机、高速组织研磨仪(武汉康涛科技有限公司，KZ-11)、酶标仪(Thermo，MULTISKAN MK3)、电泳仪(Tanon，VE-180)、转膜仪(Tanon，VE-186)。

4、造模方法与分组

动物适应性饲养1周，待12周时，行单侧肾动脉狭窄手术。术后2周建模成功后，除正常对照组和SHR高血压对照组各10只大鼠外，其余50只SHR高血压肾病大鼠随机分为5组，每组10只，分别为高血压肾病模型组、强的松阳性对照组、低剂量组(L)、中剂量组(M)、高剂量组(H)。

5、药物干预

建模成功后的第1天，强的松阳性对照组大鼠给予100mg/kg强的松、低剂量组(L)给予100mg/kg实施例1提供的中药组合物、中剂量组(L)给予200mg/kg实施例1提供的中药组合物、高剂量组(L)给予300mg/kg实施例1提供的中药组合物，正常对照组WKY大鼠以及SHR高血压大鼠每天固定时间灌胃1次等体积生理盐水，连续给药7天。

6、检测指标

6.1、尿微量白蛋白检测

分别于干预第3、5、7天将大鼠放入代谢笼，收集尿液，全自动生化分析仪检测大鼠尿微量白蛋白含量。血压检测分别于干预第4、6、8天，各组大鼠进行收缩压和舒张压检测。

6.2、HE染色观察病理变化

取被结扎处理一侧的肾脏组织，4％多聚甲醛固定48h，水洗过夜，梯度酒精脱水，石蜡包埋，制成4μm厚的石蜡切片，行HE染色，用光学显微镜在20倍物镜下观察拍照。

6.3、Western blot检测肾组织炎症变化

取新鲜的肾脏组织，液氮研磨，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制12％的SDS分离胶和5％的SDS浓缩胶，每个涌道蛋白上样量为30μg，电泳，转膜，5％脱脂牛奶封闭，一抗孵育过夜，NF-KB稀释比1:2000，NLRP3稀释比1:1000，1×TBST洗三次，每次5min，二抗室温孵育1h，稀释比1:4000，1×TBST洗三次，每次8min，ECL化学发光，将膜置于凝胶成像仪中进行检测，将所得图片用ImageJ软件分析目的条带灰度值。

7、统计学方法

实验数据以

8、结果

8.1、尿微量白蛋白变化

各组大鼠不同治疗时间点尿微量白蛋白含量变化如表3所示。

表3各组大鼠不同干预时间尿微量白蛋白变化(mg/L)

注：*表示与高血压肾病组比较，P＜0.05，**表示与高血压肾病组比较，P＜0.01，#表示与正常组比较，P＜0.05。

由表3可知，正常组第3、5、7天尿微量白蛋白无变化，高血压组有轻微升高，但差异不显著(P＞0.05)；高血压肾病组与正常组比较，于第5天和第7天有大幅度上升(P＜0.05)；强的松组与高血压肾病组比较，尿微量白蛋白降低，第5天开始，差异有显著性，第7天，差异更加显著(P＜0.01)；高、中、低组大鼠，在第7天24h尿蛋白均出现明显下降(P＜0.01)，但高剂量治疗组在第5天便开始起效(P＜0.05)，其功效不亚于阳性对照药物强的松。该结果表明本发明提供的中药组合物对肾病大鼠肾功能具有良好的改善作用。

8.2血压变化

各组不同时间点治疗的大鼠血压检测结果如表4所示。

表4各组大鼠不同干预时间血压变化(mmHg)

注：*表示与高血压肾病组比较，P＜0.05，**表示与高血压肾病组比较，P＜0.01，***表示与高血压肾病组比较，P＜0.001。###表示与正常组比较，P＜0.001。

由表4可知，高血压组和高血压肾病组大鼠与正常组大鼠的收缩压、舒张压比较，均显著升高(P＜0.001)；与高血压肾病组比较，强的松组的收缩压和舒张压均显著降低，于治疗3天时便开始下降(P＜0.05)，第5天和第7天时，效果更显著(P＜0.01)。而中剂量组于第5天开始起效(P＜0.05)，高剂量于第3天开始起效(P＜0.05)，在第7天时效果最佳(P＜0.001)。以上结果说明本发明提供的中药组合物具有较好的降压作用。

8.3肾组织病理变化

病理HE染色结果如图6所示。高血压组肾小球结构模糊，肾小管上皮细胞有明显的水肿，但未发现炎症细胞浸润；高血压肾病组肾小球萎缩，肾小管上皮细胞明显脱落、水肿、坏死，大量炎症细胞浸润；强的松组肾组织结构基本正常，肾小管局部可见扩张，管状缘脱落，肾小球结构清晰可见，组织有部分炎症细胞浸润；低剂量组肾小管上皮细胞坏死仍很严重，肾小管肿胀，存在大量炎症细胞；而高剂量组相比于高血压肾病组，肾小球结构清晰，肾小管未见明显异常，无炎症细胞浸润。该结果显示，本发明提供的中药组合物对高血压肾病具有良好的治疗效果。

8.4、Western blot结果

对炎症小体NLRP3和核因子NF-κB蛋白表达水平检测结果如图7所示，高血压组与正常组比较，NLRP3和NF-κB表达无差异，高血压肾病组与正常组比较，NLRP3和NF-κB表达显著升高，说明高血压肾病中存在严重炎症；高剂量组与高血压肾病组比较，NLRP3和NF-κB表达明显下降，说明该药物对炎症因子表达具有强烈抑制作用。

综上，本发明提供的中药组合物对基于微炎症的肾病综合征具有良好的预后。通过给予高血压肾病大鼠本发明提供的中药组合物治疗7天后，高血压肾病大鼠尿微量白蛋白明显下降，提示肾小球滤过功能得到明显改善；且大鼠血压显著下降，基本恢复到正常水平；病理结果进一步验证，药物的对肾小球结构、肾小管上皮细胞修复具有良好作用，且抑制了炎症细胞生长和浸润。高血压肾病是一种慢性炎症性肾病。依据前期研究成果，对NF-κB介导的信号通路相关蛋白因子进行检测发现，本发明提供的中药组合物可显著下调炎症小体NLPR3和核因子NF-κB蛋白表达，因此，NLPR3和NF-κB可能是本发明提供的中药组合物作用的重要靶点。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。