尿液保存液、保存方法和尿液保存管

技术领域

本发明涉及生物样本保存技术领域，具体涉及一种尿液保存液、保存方法和尿液保存管。

背景技术

尿液是血液经过肾脏的过滤和重吸收形成的终末代谢产物，尿液中不仅含有身体内的排泄物如无机盐、尿酸、尿素、葡萄糖等，还含有身体其它器官的代谢物质和基因变异信息，如游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)等，因此，尿液可用作检测诊断一些泌尿系统疾病和其他系统疾病的生物样本，比如，尿液中的cfDNA可用于进行肿瘤的早期筛查诊断。尿液采集完全无创且可实现居家采集，将是一个非常值得研究的肿瘤早筛早诊的标本类型，比如对于早筛早诊尿路上皮癌等疾病。但是，由于尿液成分复杂，临床上从样本采集至样本检测需要一定的时间间隔，而尿液中cfDNA含量低且易降解，导致检测结果的准确性并不理想，比如血尿患者和糖尿病患者的尿液成分非常复杂。因此，有必要开发新的尿液保存产品以提高尿液检测的准确性。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够同时保护DNA和RNA的尿液保存液，此外还提供了相关的保存方法和尿液保存管。该尿液保存液能够在存储后仍能有效保存尿液中的DNA和RNA信息，实现较高的检测准确性。

本发明的第一目的在于提供一种尿液保存液，为包含以下质量百分数的物质的水溶液：0.02％-1％的RNA酶抑制剂、2％-10％的DNA酶抑制剂0.2％-0.8％的非离子型的表面活性剂、1％-5％的细胞固定剂、1％-5％的防腐剂和1％-5％的醛基猝灭剂，其中，所述RNA酶抑制剂至少包括焦碳酸二乙酯，所述DNA酶抑制剂至少包括乙二胺四乙酸。

在其中一个实施例中，所述焦碳酸二乙酯在所述尿液保存液中的质量百分数为0.02％-0.1％。

在其中一个实施例中，所述焦碳酸二乙酯在所述尿液保存液中的质量百分数为0.05％-0.1％。

在其中一个实施例中，所述乙二胺四乙酸在所述尿液保存液中的质量百分数为4％-10％。

在其中一个实施例中，所述乙二胺四乙酸在所述尿液保存液中的质量百分数为6％-10％。

在其中一个实施例中，所述RNA酶抑制剂还包括硫酸铵和异硫氰酸胍中的一种或两种；和/或，

所述DNA酶抑制剂还包括二乙基三胺五乙酸和柠檬酸中的一种或两种。

在其中一个实施例中，所述非离子型的表面活性剂选自吐温20和Triton X-100中的一种或两种；优选地，所述非离子型的表面活性剂至少包括吐温20。

在其中一个实施例中，所述尿液保存液还包括pH缓冲剂，所述尿液保存液的pH值选自7-8。

在其中一个实施例中，所述细胞固定剂选自多聚甲醛和咪唑烷基脲中的一种或两种；和/或，

所述防腐剂选自重氮烷基脲、多聚甲醛、福尔马林、乙内酰脲和三硝基甲烷中的一种或多种；和/或，

所述醛基猝灭剂选自甘氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一种或多种；和/或，

所述pH缓冲剂选自选自Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐和碳酸盐中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述尿液保存液为包含以下质量百分数的物质的水溶液：0.08％-0.1％的焦碳酸二乙酯、0.4％-0.5％的吐温20、5％-6％的乙二胺四乙酸、4％-5％的甘氨酸、1.3％-1.5％的多聚甲醛和1.3％-1.5％的重氮烷基脲，所述尿液保存液的pH值选自7.5-8。

本发明的第二目的在于提供一种尿液的保存方法，包括如下步骤：将待保存的尿液与所述的尿液保存液混合。

本发明的第三目的在于提供一种尿液保存管，为装有所述的尿液保存液的样品收集管。

尿液成分繁多，影响到尿液检测结果准确性的因素也较复杂，不仅仅涉及游离cfDNA的保存能力，还需要排除其他因素的干扰。尿液离体后其中的大量微生物会快速繁殖，高含量的核酸酶会导致DNA降解，细胞破裂会释放大量基因组DNA，这些多维度的因素相互干扰，导致准确获取尿液中的游离cfDNA信息存在困难，比如血尿患者和糖尿病患者的尿液成分保存非常具有挑战性。本申请发明人还发现尿液pH环境不稳定也是影响尿液检测结果准确性的因素之一。鉴于此，可通过多组学研究提高检测准确性，以解决单维度的检测性能无法满足大部分癌症早筛早诊的性能要求的问题，比如早期肿瘤诊断。本申请的发明人发现，目前相关研究者主要关注于尿液中游离DNA的保护，而较少关注RNA信息，这主要是因为RNA更不稳定，保存难度较大，而尿液离体又往往不能即时检测，使得利用尿液中的RNA信息进行筛查诊断不易实现。

本发明提供的尿液保存液是针对尿液样本的DNA和RNA共保存的试剂，可为尿液多组学等相关研究提供基础。本发明提供的尿液保存液，通过大量研究筛选出了合适的成分组合，并进行各成分含量和体系pH等多种参数的协同控制，使各成分之间协同发挥作用，实现性了DNA和RNA共保存的良好效果。

本发明提供的尿液保存液，包含RNA酶抑制剂、DNA酶抑制剂、非离子型的表面活性剂、细胞固定剂、防腐剂和醛基淬灭剂，并控制合适的体系pH值(如pH7～8)，能够有效避免尿液游离DNA及RNA的降解，避免尿液中微生物的干扰，进一步地，还能有效避免细胞基因组DNA的干扰，可实现尿液复杂环境中游离DNA和RNA的有效共保存，可为尿液样本的多组学研究提供多组学信息保存的支持，为尿液多组学早诊早筛研究提供基础。

本发明提供的尿液保存方法，操作简单，保存期长，保存时间可达7天或更久。尿液离体并采用本发明提供的尿液保存液进行保存后，仍能提供较为准确的游离DNA及RNA信息，核酸物质降解被抑制，且干扰信号少，包括但不限于基因组DNA和微生物干扰被抑制，整体检测解结果仍具有较高灵敏度和较高准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1有无尿液保存液对尿液上清cfDNA保护能力对比图，纵坐标的浓度单位为ng/μL；

图2为本发明实施例1有无尿液保存液对尿沉淀基因组DNA保护能力对比图，纵坐标的浓度单位为ng/μL；

图3为本发明实施例2不同尿液保存液对全尿RNA保护能力对比图；横坐标为循环数(cycle number)，纵坐标delta Rn(ΔRn)表示第n个循环时PCR扩增产物的荧光强度；

图4为本发明实施例3不同尿液保存液对尿液上清cfDNA保护能力对比图，纵坐标的浓度单位为ng/μL。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图、实施方式和实施例对本发明进行更全面的描述。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本发明中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。如果一个技术方案中出现多处“优选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“优选”各自独立。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第一目的”、“第二目的”、“第三目的”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”均是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，该数值区间内可选的数值的分布视为连续，且包括该数值区间的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，相当于直接列举了每一个整数。当提供多个数值范围描述特征或特性时，可以合并这些数值范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之数值范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。该数值区间中的“数值”可以为任意的定量值，比如数字、百分比、比例等。“数值区间”允许广义地包括百分比区间，比例区间，比值区间等定量区间。

本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本发明中，术语“常温”一般指4℃～35℃，较佳地指20℃±5℃。在本发明的一些实施例中，常温是指20℃～30℃。

在本发明的第一方面，提供一种尿液保存液，可作为针对尿液样本的DNA和RNA共保存的试剂，可为尿液多组学等相关研究提供基础。

在本发明的一些实施方式中，待保存的RNA为mRNA。进一步地，该尿液保存液可同时保存尿液样本的DNA和mRNA。

在本发明的一些实施方式中，提供一种尿液保存液，其包含RNA酶抑制剂、DNA酶抑制剂、非离子型的表面活性剂、细胞固定剂、防腐剂和醛基淬灭剂，并控制合适的体系pH值(如pH7～8)，能够有效避免尿液游离DNA及RNA的降解，避免尿液中微生物的干扰，进一步地，还能有效避免细胞基因组DNA的干扰，可实现尿液复杂环境中游离DNA和RNA的有效共保存，可为尿液样本的多组学研究提供多组学信息保存的支持，为尿液多组学早诊早筛研究提供基础。

在本发明的一些实施方式中，提供一种尿液保存液，其为包含以下质量百分数(wt％)的物质的水溶液：0.02％-1％的RNA酶抑制剂、2％-10％的DNA酶抑制剂、0.2％-0.8％的非离子型的表面活性剂、1％-5％的细胞固定剂、1％-5％的防腐剂和1％-5％的醛基猝灭剂。

在其中的一些优选例中，RNA酶抑制剂至少包括焦碳酸二乙酯(DEPC)。

在其中的一些优选例中，DNA酶抑制剂至少包括乙二胺四乙酸(EDTA)。

在其中的一些优选例中，RNA酶抑制剂至少包括焦碳酸二乙酯，DNA酶抑制剂至少包括乙二胺四乙酸。

RNA酶抑制剂能有效抑制尿液中RNA酶的活性，防止尿液中RNA降解，同时又不会导致尿液中脱落细胞的破裂。RNA酶抑制剂在尿液保存液中的质量百分数可以为0.02％-1％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.075％、0.08％、0.085％、0.09％、0.095％、0.1％、0.15％0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。任两种百分数构成的区间的举例如0.02％-0.1％。

在一些实施方式中，RNA酶抑制剂至少包括焦碳酸二乙酯(DEPC)。DEPC的含量可以选自上述任意合适的RNA酶抑制剂的含量。

在一些实施方式中，RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)。DEPC的含量可以选自上述任意合适的RNA酶抑制剂的含量。

在一些实施方式中，焦碳酸二乙酯在尿液保存液中的质量百分数为0.02％-0.1％。在一些实施方式中，焦碳酸二乙酯在所述尿液保存液中的质量百分数为0.05％-0.1％。

在一些实施方式中，RNA酶抑制剂包括焦碳酸二乙酯，且还包括硫酸铵和异硫氰酸胍中的一种或两种，此时既能防止细胞破裂又能抑制RNA降解。其中，硫酸铵在尿液保存液中的浓度可以为0.5％-1％，举例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％等。异硫氰酸胍在尿液保存液中的浓度可以为0.02％-1％，举例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.075％、0.08％、0.085％、0.09％、0.095％、0.1％、0.15％0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。

DNA酶抑制剂能有效地螯合尿液中的二价金属离子从而抑制核酸酶的活性，防止游离DNA的降解。DNA酶抑制剂在尿液保存液中的质量百分数可以为2％-10％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％等。

在一些实施方式中，DNA酶抑制剂至少包括乙二胺四乙酸(EDTA)。EDTA的含量可以选自上述任意合适的DNA酶抑制剂的含量。

在一些实施方式中，DNA酶抑制剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。EDTA的含量可以选自上述任意合适的DNA酶抑制剂的含量。

在一些实施方式中，乙二胺四乙酸在所述尿液保存液中的质量百分数为4％-10％，例如可以为4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％等。在一些实施方式中，乙二胺四乙酸在所述尿液保存液中的质量百分数为6％-10％。

在一些实施方式中，DNA酶抑制剂包括乙二胺四乙酸，还包括二乙基三胺五乙酸和柠檬酸中的一种或两种，此时，既能防止细胞破裂又能抑制DNA降解。其中，二乙基三胺五乙酸在尿液保存液中的浓度可以为4％-10％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％等。柠檬酸在尿液保存液中的浓度可以为1％-5％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。

细胞固定剂可终止内源性和/或外源性酶反应，防止细胞破裂或自溶。在一些实施方式中，细胞固定剂选自多聚甲醛和咪唑烷基脲中的一种或两种。细胞固定剂在尿液保存液中的质量百分数可以为1％-5％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。任两种百分数构成的区间举例如1.5％-5％、1.5％-4.5％等。

在一些实施方式中，多聚甲醛在尿液保存液中的浓度可以为1.3％-1.5％(如1.3％、1.4％、1.5％等)。咪唑烷基脲在尿液保存液中的浓度可以为1.3％-1.5％(如1.3％、1.4％、1.5％等)。

本发明所使用的表面活性剂可以选自非离子型的表面活性剂，此时能够在细胞固定剂的生物环境下增加膜蛋白的稳定性，同时可对RNA酶起到一定的抑制作用。在一些实施方式中，非离子型的表面活性剂选自吐温20和Triton X-100等中的一种或两种。优选地，非离子型的表面活性剂至少包括吐温20。非离子型的表面活性剂在尿液保存液中的质量百分数可以为0.2％-0.8％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％。任两种百分数构成的区间的举例如0.4％～0.6％等。

在一些实施方式中，Triton X-100在尿液保存液中的浓度可以为0.2％-0.8％。

在一些实施方式中，防腐剂在尿液保存液中的质量百分数可以为1％-5％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％。任两种百分数构成的区间的举例如1％～3％等。在一些实施方式中，所使用的防腐剂选自重氮烷基脲、多聚甲醛、福尔马林、乙内酰脲、三硝基甲烷等中的一种或多种。在其中的一些实施例中，防腐剂为重氮烷基脲和多聚甲醛的组合，具有广谱微生物抑制效果，能有效的抑制尿液中细菌和真菌的繁殖。

在一些实施例中，尿液保存液中的重氮烷基脲和多聚甲醛的质量比为(0.8～1.2):1。在其中的一些实施例中，尿液保存液中的重氮烷基脲和多聚甲醛的质量比为1:1。

在一些实施方式中，醛基猝灭剂选自甘氨酸、精氨酸、赖氨酸等中的一种或多种。在一些实施方式中，醛基猝灭剂为甘氨酸。醛基猝灭剂在尿液保存液中的质量百分数可以为1％-5％，例如下述任一种百分数或者任两种百分数构成的区间：1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。

本发明所提供的尿液保存液的pH值可以选自7～8，体系pH值的举例如7、7.5、8等。本申请的发明人通过大量实验发现，上述pH条件有利于同时实现DNA和RNA的良好保存效果。

在一些实施方式中，尿液保存液还包括pH缓冲剂。pH缓冲剂能够将尿液保存液的pH值稳定在合适范围内，如将尿液保存液的pH值稳定在7～8之间。pH缓冲剂可以选自Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐和碳酸盐中的一种或多种。在其中的一些实施例中，pH缓冲剂为Tris-HCl、柠檬酸和柠檬酸三钠的组合，此时通过搭配使用能够有效地将尿液样本的pH稳定在7-8之间，可防止pH波动导致的细胞破裂以及基因组DNA干扰等。在其中的一些实施例中，Tris-HCl、柠檬酸和柠檬酸三钠的质量比为(44％±2％)：(37％±2％)：(67％±2％)。pH缓冲剂的用量以能够将体系pH值稳定在预设范围内为宜。

在一些实施方式中，尿液保存液为包含以下质量百分数的物质的水溶液：0.02％-0.1％的焦碳酸二乙酯、0.2％-0.8％的吐温20、2％-10％的乙二胺四乙酸、1％-5％的甘氨酸、1％-5％的多聚甲醛和1％-5％的重氮烷基脲，进一步地，尿液保存液的pH值选自7-8。更进一步地，采用了Tris-HCl、柠檬酸和柠檬酸三钠的组合将尿液保存液的pH值调至7-8。

在一些实施方式中，尿液保存液为包含以下质量百分数的物质的水溶液：0.08％-0.1％的焦碳酸二乙酯、0.4％-0.5％的吐温20、5％-6％的乙二胺四乙酸、4％-5％的甘氨酸、1.3％-1.5％的多聚甲醛和1.3％-1.5％的重氮烷基脲，进一步地，尿液保存液的pH值选自7.5-8。更进一步地，采用了Tris-HCl、柠檬酸和柠檬酸三钠的组合将尿液保存液的pH值调至7.5-8。

在本发明的第二方面，提供一种尿液的保存方法，该方法使用本发明的第一方面的尿液保存液，操作简单，保存期长，保存时间可达7天或更久。

在一些实施方式中，尿液的保存方法包括如下步骤：将待保存的尿液与本发明的第一方面的尿液保存液混合。混合方法为本领域技术人员所知悉。比如，常温混合后，摇动混匀。

在一些实施方式中，尿液保存液：待保存尿液的用量比可以为(15～25):1，以体积比计。举例如19:1，以体积比计。

在一些实施方式中，采用尿液保存液将尿液的体积稀释为10～20倍，举例如10倍、15倍、20倍等。

在一些实施方式中，尿液保存液：待保存尿液的用量比可以为(15～25):1，以质量比计。举例如19:1，以质量比计。

在一些实施方式中，采用尿液保存液将尿液的质量稀释为10～20倍，举例如10倍、15倍、20倍等。

在一些实施例中，经混合尿液和尿液保存液后，得到混合液中各成分的工作浓度可以为：0.004％的DEPC、0.024％的吐温20、0.291％的乙二胺四乙酸(EDTA)、0.243％的甘氨酸、0.073％的多聚甲醛、0.073％的重氮烷基脲、0.022％的Tris-HCl，0.019％的柠檬酸和0.034％的柠檬酸三钠，浓度波动范围可以为±(0～0.001％)，浓度单位以质量百分数(wt％)计。

经混合尿液和尿液保存液后，得到混合液pH(也即工作pH值)可以选自7-8。

混匀后的混合液可以在室温(如4℃-35℃)条件下保存。

在一些实施例中，保存7天或更久后，仍能提供较为准确的游离DNA及RNA信息，核酸物质降解被抑制，且干扰信号少，包括但不限于基因组DNA和微生物干扰被抑制，整体检测解结果仍具有较高灵敏度和较高准确性。可参见后文的一些具体实施例。

在本发明的第三方面，提供一种尿液保存管，可提供一种预包装的、便于临床操作的尿液样品收集管。

该尿液保存管为装有本发明的第一方面的尿液保存液的样品收集管。

在一些实施方式中，尿液保存管包括容器和装于容器中的尿液保存液，该尿液保存液为本发明的第一方面的尿液保存液或其浓缩液。在其中的一些实施例中，尿液保存液或其浓缩液被密封保存。在一些实施例中，容器的体积为11mL，刻度线为10mL。在一些实施例中，每个尿液保存管中的尿液保存液的体积为0.5mL。

在一些实施例中，拆开包装即可使用，无需额外的称量、配制及稀释。可直接向尿液保存管中加入预设量的尿液样本，经混匀后保存，作为待检样本。

在一些实施例中，拆开包装后，尿液保存液的浓缩液可经稀释后使用。可采用水或本发明的第一方面的缓冲剂的水溶液进行稀释。

在一些实施例中，容器带有刻度，可用于指示物质添加量。

以下为一些具体实施例。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度和/或操作精度导致的可接受的偏差。

以下各例中，DEPC为焦碳酸二乙酯，EDTA为乙二胺四乙酸。

以下各例中，未限定反应温度的步骤在常温下进行，这里的常温指4℃～35℃。

以下各例中，涉及浓度百分数，如未指明单位，则为质量百分比wt％。

实施例1.DNA保存能力

本实施例尿液保存液的配制方法：使用超纯水在通风橱中配制0.1wt％的焦碳酸二乙酯(DEPC)，用该DEPC溶液作为溶媒配制溶液1，溶液1含有以下质量百分数(wt％)的终浓度试剂：0.5％的吐温20，6％的乙二胺四乙酸(EDTA)，5％的甘氨酸，1.5％的多聚甲醛和1.5％的重氮烷基脲，用盐酸和氢氧化钠将溶液的pH调整到8。溶液1中DEPC的浓度经推算约为0.09wt％。使用超纯水配制溶液2、3、4，溶液2、3、4分别含有质量百分数的终浓度试剂：44％的Tris-HCl、37％的柠檬酸和67％的柠檬酸三钠，配制溶液2、3、4时，各自独立地分别用盐酸和/或氢氧化钠将溶液的pH调整到8。将配制的溶液均高温灭菌30分钟，溶液冷却后待用。根据待配制保存液的体积配制保存液，如待配制保存液的体积为V，则取体积分别为0.97V、0.01V、0.01V、0.01V的溶液1、2、3、4混合，用超纯水定容至体积V，测定pH为8。

本例分别采用健康人(样本1)和血尿患者(样本2和样本3)的晨尿，每个样本混匀后分成16份，每份10mL装入无菌离心管内，实施组随机挑取其中的8管按尿液与保存液19：1的体积比例混匀(该操作在尿液离体1小时内完成)，对照组将剩余的8管尿液不做处理，实施组(实施案例)和对照组(对照案例)区别在于对照案例中没有添加保存液，两组标本常温保存。在以下4个时间点两个组各取1管进行全尿核酸提取，各取1管进行尿液上清和尿沉淀细胞的核酸提取，尿液离体当天2小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天，全尿的提取试剂盒为普通市售的血清/血浆循环DNA试剂盒，将离心管上下颠倒8次，取4mL全尿严格按照说明书要求提取。尿上清的提取试剂盒为普通市售的血清/血浆循环DNA试剂盒，将离心管3500rpm离心10分钟，取4mL尿上清严格按照说明书要求提取。尿沉淀细胞提取试剂盒为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，将离心管3500rpm离心10分钟，去除上清后，500μL的PBS重悬沉淀，取500μL重悬液严格按照说明书要求提取。提取后的核酸浓度结果可参见表1，结果对比结果可参见图1和图2。

根据实验结果(可参见表1、图1、图2)，尿液在保存液的保护作用下常温保存7天后，全尿的核酸无明显变化，而无保存液的全尿核酸明显增加，这是因为无保存液的条件下，尿液中的微生物会大量的繁殖，而尿液保存液能在常温条件下抑制微生物的繁殖。尿液在保存液的保护作用下可常温保存至少7天，尿液上清的游离核酸无明显变化，说明游离核酸无明显降解，还说明尿脱落细胞无明显破裂，未释放基因组DNA污染游离核酸。而对照组中监测尿上清cfDNA，发现一个样本核酸持续增加，其中两个样本核酸先增加后减少，很可能是尿脱落细胞破裂导致尿液上清核酸增加，而尿脱落细胞破裂同时会释放核酸酶导致核酸缓慢降解。对照组中监测尿沉淀基因组DNA，发现其中一个样本明显地持续升高，两个样本先升高后下降，结合全尿核酸的结果说明无保存液的尿液在常温条件下很可能存在大量的微生物繁殖，导致沉淀的核酸总量增加，同时细胞破裂释放的核酸酶会导致核酸缓慢降解。可知，未添加尿液保存液时，游离核酸的信息在常温保存条件会发生较大变化。而添加实施例1的保存液后，尿液在常温条件下保存至少7天，尿上清cfDNA和尿沉淀基因组DNA均无明显变化，保存期间无明显的细胞破裂和微生物繁殖。

表1.有无保存液不同保存天数的全尿、尿上清和尿沉淀核酸提取浓度对比

从图2对比结果可以看出，尿液在保存剂的保护作用下常温保存7天后，尿沉淀基因组DNA无明显变化，说明尿脱落细胞无明显的破裂；从对照组的结果可以看出，未添加尿液保存液，尿沉淀核酸上升，可以推断出尿液中存在大量的微生物繁殖导致核酸量增加，同时核酸会被核酸酶逐步降解。尿液在无尿液保存液的条件下，微生物的分子信号、尿上清的人的游离核酸信号、尿沉淀的人基因组信号会相互干扰，导致测试结果不准确。而尿液保存液在常温条件下能对尿液起到非常好的保护作用，既能抑制微生物繁殖，同时能防止细胞破裂和游离核酸的降解，有效维持了游离核酸和脱落细胞的稳定。

实施例2.RNA保存能力

本例采用血尿患者(样本4)的晨尿，每个样本混匀后分成8份，每份10mL装入无核酸酶的离心管内，实施组随机挑取其中的4管按尿液与实施案例1配制的保存液19：1的比例混匀(该操作在尿液离体0.5小时内完成)，对照组将剩余的4管尿液不做处理，实施组(实施案例)和对照组(对照案例)的区别在于对照组中没有添加尿液保存液，两组标本常温保存。在以下4个时间点两个组各取1管进行全尿和尿沉淀细胞RNA提取和RNA的QPCR(实时荧光定量PCR)检测，尿液离体当天1小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天，全尿的提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015，圣湘生物科技股份有限公司)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。尿沉淀细胞提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，将离心管3500rpm离心10分钟，去除上清后，300μL的PBS重悬沉淀，取300μL重悬液严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘生物科技股份有限公司)进行RNA的检测，该试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，可用于对比分析实施组和对比组RNA的保存情况。两个组的人源内标基因扩增CT值可参见表2和图3。其中，CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，CT的数值高低可以反映检测样品浓度高低，CT值越低检测样本核酸浓度越高，CT值越高检测样本中核酸浓度越低；相差1个CT值的样本核酸浓度有两倍差异，相差2个CT值则有四倍差异，以此类推。

根据实验结果(可参见表2)，无尿液保存剂的对照组，常温放置第3天到第7天，RNA的含量明显下降(从CT值高于实施案例组可知)，保存7天后，全尿和尿沉淀的RNA含量均降低10倍以上，说明RNA在无尿液保存剂条件下降解严重。但尿液在保存液的保护作用下常温保存7天后，全尿和尿沉淀RNA含量均无明显变化，说明RNA无明显降解。可见，本申请提供的尿液保存液对尿液中的RNA有非常强的保护作用。

表2.有无保存液的全尿和尿沉淀人源管家基因RNA扩增CT值对比

实施例3.同时保存DNA和RNA的能力

本例分别采用血尿患者(样本5和样本6)的晨尿，每个样本混匀后分成8份，每份10mL装入无菌离心管内，实施组随机挑取其中的4管按尿液与实施例1配制的保存液19：1的比例混匀(该操作在尿液离体1小时内完成)，对比组将剩余的4管尿液按尿液保存管A(对比试剂，商品货号:CW2657)的要求与尿液保存管A的保存液混匀(该操作在尿液离体1小时内完成)，实施组(实施例组)和对比组的区别在于保存液不同，两组标本常温保存。在以下4个时间点两个组各取1管进行尿液上清游离核酸提取，尿液离体当天2小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天。尿上清游离DNA的提取试剂盒为普通市售的血清/血浆循环DNA试剂盒，将离心管3500rpm离心10分钟，取4mL尿上清严格按照说明书要求提取。提取后的游离DNA结果可参见表3，结果对比可参见图4。全尿的提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘)进行RNA的检测，该试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，提取后的游离DNA结果可参见表4。

根据实验结果(可参见图4、表3)，实施例组的保存液较对比试剂具有更稳定的保护效果，0到7天，实施例的游离DNA无明显降解，但对比组存在较小幅度的降解。比较实施例组和对照组，可见，添加了本发明的尿液保存液后，对尿液游离DNA具有更稳定的保护作用。

表3.不同保存液不同保存天数的尿上清游离DNA提取浓度对比

表4.不同保存液不同保存天数的全尿人源管家基因RNA扩增CT值对比

根据实验结果(可参见表4)，实施例组的保存液较对比试剂具有更稳定的保护效果，自0到7天，实施例组的CT值无明显变化，说明RNA含量无明显变化，可见RNA无明显降解，而对比组CT值明显增大，说明RNA含量逐渐减少，可见尿上清中的RNA存在明显的降解。实施例组的尿液保存液较对照组对RNA具有更稳定的保护作用。

实施例4.有无添加RNA酶抑制剂

实施组(实施案例)制备尿液保存液的方法与实施例1中的实施案例一致。对比组(对比案例)与实施案例的保存液配制基本相似，但配方中未添加焦碳酸二乙酯，其余的步骤保持一致。

采用血尿患者(样本7)的晨尿，将样本混匀后分成8份，每份10mL装入无核酸酶的离心管内，对比组随机挑取其中的4管按尿液与对比案例配制的保存液19：1的比例混匀；实施组将剩余的4管按尿液与实施案例配制的保存液19：1的比例混匀(该操作在尿液离体0.5小时内完成)，两组标本常温保存。在以下4个时间点两个组各取1管进行全尿RNA提取和RNA的QPCR检测，尿液离体当天1小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天，全尿的提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘)进行RNA的检测，该试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，可用于对比分析实施组和对比组RNA的保存情况。两个组的人源内标基因扩增CT值可参见表5。

表5.不同保存液不同保存天数的全尿人源管家基因RNA扩增CT值对比

根据实验结果(可参见表5)，实施组(实施案例)的保存液较对比组(对比案例，未添加DEPC)的保存液具有更稳定的保护效果，自0到7天，对比组CT值明显增大，说明RNA含量逐渐减少，可见尿上清中的RNA存在比较明显的降解，而实施组无明显降解。可见，本申请所提供的添加了焦碳酸二乙酯的尿液保存液对RNA有较强的保护作用。

实施例5.不同的RNA酶抑制剂浓度

本实施例与实施案例1的保存液配制基本相似，但配方中焦碳酸二乙酯(RNA酶抑制剂)设置了3种不同浓度梯度，A组中0.01wt％、B组中0.1wt％、C组中1wt％。本例采用血尿患者(样本8)的晨尿，将样本混匀后分成12份，每份10mL装入无核酸酶的离心管内，随机挑取其中的4管按尿液与实施例5-A配制的保存液19：1的比例混匀；随机挑取其中的4管按尿液与实施例5-B配制的保存液19：1的比例混匀；剩余的4管按尿液与实施例5-C配制的保存液19：1的比例混匀，三组标本常温保存。在以下4个时间点三个组各取1管进行全尿RNA提取和RNA的QPCR检测，尿液离体当天1小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天，全尿的提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘)进行RNA的检测，试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，可用于对比分析实施组和对比组RNA的保存情况。两个组的人源内标基因扩增CT值统可参见表6。

表6.不同保存液不同保存天数的全尿人源管家基因RNA扩增CT值比较

根据实验结果，可参见表6，焦碳酸二乙酯浓度为0.1％和1％时的RNA的保护效果较好，CT值无明显变化，说明RNA含量无明显变化，可见尿上清中的RNA无明显降解，考虑到焦碳酸二乙酯成本较高，0.1％更利于节约成本。但焦碳酸二乙酯浓度为0.01％时，CT值明显增大，说明RNA含量逐渐减少，可见尿上清中的RNA存在较明显的RNA降解，保存效果较差。

实施例6.有无添加醛基淬灭剂

实施组(实施案例)制备尿液保存液的方法与实施例1中的实施案例一致。对比组(对比案例)与实施案例的保存液配制基本相似，但配方中未添加醛基淬灭剂，其余的步骤保持一致。

采用血尿患者(样本9)、糖尿病患者(样本10)和健康患者(样本11)的晨尿，每个样本混匀后分成8份，每份10mL装入无核酸酶的离心管内，对比组随机挑取其中的4管按尿液与对比案例配制的保存液19：1的比例混匀；实施组将剩余的4管与实施案例配制的保存尿液与实液19：1的比例混匀(该操作在尿液离体0.5小时内完成)，两组标本常温保存。在以下4个时间点两个组各取1管进行全尿RNA提取和RNA的QPCR检测，尿液离体当天1小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天，全尿的提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘)进行RNA的检测，该试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，可用于对比分析实施组和对比组RNA的保存情况。两个组的人源内标基因扩增CT值可参见表7。

根据实验结果，可参见表7，针对正常人的样本，实施组和对照组无明显差别。但针对血尿样本和糖尿病患者尿液样本，实施组(添加醛基淬灭剂)较对比组(无醛基淬灭剂)的保存液具有更稳定的保护效果，自0到7天，对比组RNA检测的CT值明显增大，说明RNA含量逐渐减少，可见对比组的保存液在血尿样本和糖尿病患者尿液样本中RNA存在比较明显的降解，而实施组RNA检测的CT值无明显变化，说明RNA含量无明显变化，可见实施组RNA无明显降解。可见，对于特殊的样本，特别是血尿样本和糖尿病患者尿液样本，本发明提供的添加了醛基淬灭剂的尿液保存液对RNA有较强的保护作用。

表7.不同保存液不同保存天数的全尿人源管家基因RNA扩增CT值比较

实施例7.考察pH值影响

实施组(实施案例)制备尿液保存液的方法与实施例1中的实施案例一致。对比组(对比案例)与实施案例的保存液配制基本一致，但调整pH时，用盐酸和/或氢氧化钠溶液将溶液1、2、3、4的pH值调整到6，其余的步骤保持一致，对比案例配制得到的尿液保存液的pH值约为6。采用血尿患者(样本12)的晨尿，每个样本混匀后分成8份，每份10mL装入无核酸酶的离心管内，对比组随机挑取其中的4管按尿液与对比案例配制的保存液19：1的比例混匀；对照组将剩余的4管施案例1配制的保存尿液与实液19：1的比例混匀(该操作在尿液离体0.5小时内完成)，两组标本常温保存。在以下4个时间点两个组各取1管进行全尿RNA提取和RNA的QPCR检测，尿液离体当天1小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天，全尿的提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘)进行RNA的检测，该试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，可用于对比分析实施组和对比组RNA的保存情况。两个组的人源内标基因扩增CT值可参见表8。

表8.不同pH值保存液不同保存天数的全尿人源管家基因RNA扩增CT值比较

根据实验结果，可参见表8，保存液pH为8时，RNA的保护效果较好，无明显降解。而保存液pH为6时，RNA检测的CT值明显增大，说明RNA含量逐渐减少，说明存在较明显的RNA降解，保存效果较差。

实施例8.

本实施例尿液保存液的配制方法：使用超纯水在通风橱中配制，根据表9中对应的RNA酶抑制剂的各组分和各浓度分别配制各组溶液作为组各组溶液1的溶媒，各组根据表9中对应的溶液1中的DNA酶抑制剂、非离子型的表面活性剂、细胞固定剂、防腐剂、醛基淬灭剂的各组分和各浓度分别配制溶液1，各自独立用盐酸和/或氢氧化钠将各组溶液的pH调整到表9中对应的各组溶液1的pH值。使用超纯水配制各组的缓冲液溶液2、3、4，根据表9中缓冲液溶液2、3、4中对应的各组分和各浓度配制各组的溶液2、3、4，各自独立用盐酸和/或氢氧化钠将各组缓冲液的pH调整到表9中对应的各组溶液2、3、4的pH值。将配制的所有溶液均高温灭菌30分钟，溶液冷却后待用。各组的保存液按表9中保存液中的溶液1、2、3、4对应的体积配制，各自独立用用水定容值100mL，各组保存液的pH为表9中各组对应的pH。

本例采用血尿患者的混合晨尿(样本13)，样本混匀后分成48份，每份10mL装入无菌离心管内，各实施组(8-1、8-2、8-3、8-4、8-5)和对照组(D8-1)随机挑取其中的8管按尿液与保存液19：1的体积比例混匀(该操作在尿液离体1小时内完成)，各组的区别在于添加不同的保存液，每组标本常温保存。在4个时间点(0天、3天、5天、7天)各组各取1管进行全尿RNA提取和RNA的QPCR检测，各取1管进行尿液上清和尿沉淀细胞的核酸提取，尿液离体当天2小时内、常温保存3天、常温保存5天、常温保存7天。全尿的RNA提取试剂盒为核酸提取或纯化试剂(圣湘S10015)，直接取300μL全尿严格按照说明书要求提取。提取后的洗脱液采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(圣湘)进行RNA的检测，该试剂盒内标是针对人的管家基因GAPDH设定，可以检测人源RNA的含量，可用于对比分析各组人源RNA的保存情况。各组的人源内标基因扩增CT值可参见表10。

尿上清的核酸提取试剂盒为普通市售的DNA提取试剂盒，将离心管3500rpm离心10分钟，取4mL尿上清严格按照说明书要求提取。尿沉淀细胞提取试剂盒为普通市售的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，将离心管3500rpm离心10分钟，去除上清后，500μL的PBS重悬沉淀，取500μL重悬液严格按照说明书要求提取。各组提取后的核酸浓度结果可参见表11。

表9.尿液保存液配制表(百分数浓度“％”的单位为wt％)

表10.不同保存液不同保存天数的全尿人源管家基因RNA扩增CT值比较

从表10可以看出，实施组8-1、8-2、8-3、8-4、8-5在4个时间点检测的CT值均无明显变化，说明RNA含量无明显变化，可见RNA无降解，说明各实施组的保存液均能起到较好的RNA保护作用。而对照组D8-1随着保存时间增加CT值明显升高，说明RNA含量明显降低，可见RNA存在明显降解，对尿液样本RNA的保护作用不佳。

表11.不同保存液不同保存天数的尿上清和尿沉淀核酸提取浓度比较

从表11可以看出，实施组8-1、8-2、8-3、8-4、8-5，无论是尿上清cfDNA提取浓度还是尿沉淀基因组DNA提取浓度，7天内均无明显变化，可见各实施组的保存液对游离DNA防降解和尿沉淀细胞防破裂均能起到较好的保护作用。而对照组D8-1在第0天就出现沉淀基因组DNA提取浓度偏低，尿上清cfDNA提取浓度偏高的现象，这是由于对照组的保存液导致了尿液中的细胞破裂，细胞中的基因组DNA进入尿上清中。对照组D8-1中，无论尿上清cfDNA还是尿沉淀基因组DNA随着保存时间增加，提取浓度出现明显下降，可见DNA存在明显降解，对照组保存液对尿液样本DNA的保护作用不足。

以上各实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。