一种枣树砧木组培苗获得丛生苗的培养基以及枣树砧木组织培养的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种枣树砧木组培苗获得丛生苗的培养基以及枣树砧木组织培养的方法。

背景技术

植物的组织培养是植物遗传工程的基础，也是实用性极强的高新技术。植物的组织培养在植物的品种改良、新种质创制、稀有物种和具有重要经济价值物种的保存及繁殖方面都具有重要的应用前景。

植物的组织培养第一个获得成功的是1934年White用离体的番茄根建立了一个活跃生长的无性系。到现在，植物的组织培养虽然已经走过了近百年的历程，获得组培成功的植物种类也在日益增多，但由于不同物种基因型及遗传背景的复杂性，至今研究者们还不能实现对所有植物的组织培养成功。即使已成功的物种，由于不同类型和不同品种其基因型的差异，其组培的难易和所需的培养基条件也存在较大差异。因此现有的组培技术都是对某个物种的特定类型或品种是适宜的，换一个品种或类型可能就是不适宜的或说不是最佳的。枣树属于多年生木本果树，起源于我国并且到目前我国仍是世界上栽培面积最大，占世界栽培面积的90％以上，其他国家多以庭院零星栽培，少数国家有小规模的商品化种植。枣树是无性繁殖果树，常规嫁接繁殖费时费工，工作效率低。组织培养可快速提供生长整齐一致、无病虫害的优质种苗，是实现无性繁殖作物快速育苗的有效途径。枣树的组织培养研究早在上世纪60年代就已经开始研究并获得了一些品种的组培成功，到现在虽已过去了半个多世纪，但由于枣不同品种间遗传背景的复杂性，仍有一些品种很难组培成功，即使已组培成功的品种，也主要是以茎段切段繁殖和增殖效率很低(增殖倍数小于3)的基部增殖方式进行继代增殖，很难获得增殖倍数大于3的丛生苗增殖，继代增殖效率低，组培成本高，严重阻碍了枣优良砧木品种工厂化试管育苗的进展，妨碍了优良品种在生产上的快速推广，也影响了现代生物技术育种方法在枣品种改良上的应用。因此，研究筛选枣组培苗在继代增殖阶段产生丛生苗，提高微繁效率，是枣优质苗木繁育的需要，也是枣现代生物技术育种加速育种进程的需要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种枣树砧木组培中的继代增殖培养基，用以解决现有技术中抗枣疯病优系、酸枣优系等枣优良砧木品种在组织培养的过程中继代增殖效率低的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于枣树砧木组培的继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，还包含如下浓度的组分：0.1～2.0mg/L BA、0.02～1.0mg/L TDZ、0.05～0.3mg/L IBA、0.1～2.0mg/L D-生物素、0.1～2.0mg/L D-泛酸钙、50～300mg/L抗坏血酸、25～35g/L蔗糖。

作为优选，用于枣树砧木组培的继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，还包含如下浓度的组分：0.5～1.5mg/L BA、0.1～0.8mg/L TDZ、0.1～0.2mg/L IBA、0.5～1.5mg/L D-生物素、0.5～1.5mg/L D-泛酸钙、100～200mg/L抗坏血酸、28～32g/L蔗糖。

本发明还提供了枣树砧木组织培养的方法，具体步骤如下：

1)以枣头枝的茎段为外植体；

2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗；

3)将步骤2)中获得的无菌苗，转接到上述的继代增殖培养基上进行继代增殖培养。

作为优选，步骤3)所述芽启动培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～2mg/L BA、0.1～1.0mg/L IBA、25～35g/L蔗糖；

作为优选，培养温度为23～27℃，培养的光照周期为13～18小时/天。

作为优选，步骤1)所述茎段的长度为1～3cm；

作为优选，步骤3)中所述消毒处理包括依次进行的酒精浸泡和次氯酸钠溶液浸泡；

作为优选，所述酒精浸泡的时间为0.5～1.5min，所述酒精的体积浓度为65％～75％；

作为优选，所述次氯酸钠溶液浸泡的时间为8～10min，所述次氯酸钠溶液的有效氯含量为4～6％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明技术的优点是针对枣抗枣疯病优系组培苗继代增殖困难及增殖效率低的技术问题，通过改良继代增殖培养基组分中的外源植物激素组成及添加维生素类等有机物质，克服了枣抗枣疯病优系组培苗不能产生丛生苗的技术瓶颈，首次获得了枣抗枣疯病优系组培苗高效增殖。本发明所述的方法可用于枣抗枣疯病砧木优系工厂化试管育苗，可为生产用苗快速提供优质苗木，具有很好的实际开发和应用前景。

附图说明

图1为不同的枣树砧木在本发明的继代增殖培养基以及现有技术中其它的继代增殖培养基中的增殖情况。

A～D分别为抗枣疯病枣砧木优系、酸枣砧木优系A、酸枣砧木优系S、酸枣砧木优系W在继代增殖培养基MS+0.1～2.0mg/L BA+0.02～1.0mg/L TDZ+0.05～0.3mg/L IBA+0.1～2.0mg/L D-生物素+0.1～2.0mg/L D-泛酸钙+50～300mg/L抗坏血酸+30g/L蔗糖上产生丛生苗的增殖生长；

E～H分别为抗枣疯病枣砧木优系、酸枣砧木优系A、酸枣砧木优系S、酸枣砧木优系W在继代增殖培养基MS+1～4.0mg/L BA+0.02～1.0mg/L TDZ+0.05～0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖上不能产生丛生苗。

具体实施方式

本发明提供了一种用于枣树砧木组培的继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，还包含如下浓度的组分：0.1～2.0mg/L BA、0.02～1.0mg/L TDZ、0.05～0.3mg/L IBA、0.1～2.0mg/L D-生物素、0.1～2.0mg/L D-泛酸钙、50～300mg/L抗坏血酸、25～35g/L蔗糖。

在本发明中，所述继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，包含0.1～2.0mg/LBA，这个浓度范围是最优的，低于0.1mg/LBA，苗不生长，叶片黄化，脱落；高于0.1mg/LBA，苗叶易玻璃化，叶小而卷，优选的包含0.5～1.5mg/LBA，进一步优选的包含0.8～1.2mg/LBA。

在本发明中，所述继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，包含0.02～1.0mg/L TDZ，优选的包含0.1～0.8mg/L TDZ，进一步优选的包含0.3～0.6mg/L TDZ。TDZ的作用是增加试管苗基部增殖芽数，实现丛生苗的增殖。

在本发明中，所述继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，包含0.1～2.0mg/LD-生物素，优选的包含0.5～1.5mg/L D-生物素，进一步优选的包含0.8～1.2mg/L D-生物素。

在本发明中，所述继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，包含0.1～2.0mg/LD-泛酸钙，优选的包含0.5～1.5mg/L D-泛酸钙，进一步优选的包含0.8～1.2mg/L D-泛酸钙。D-泛酸钙的作用是调节试管苗生长过程的生理代谢，促进细胞分裂。

在本发明中，所述继代增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，包含50～300mg/L抗坏血酸，优选的包含100～200mg/L抗坏血酸，进一步优选的包含120～180mg/L抗坏血酸。抗坏血酸的作用是一是参与植物细胞的新陈代谢，延缓衰老，二是防止枣组培苗的褐化。

在本发明中，MS培养基组成如表1。

表1 MS基本培养基组成

本发明还提供了一种枣树砧木组织培养的方法，具体步骤如下：

1)以枣头枝的茎段为外植体；

2)将所述茎段消毒处理后，接种到芽启动培养基上培养25～30天获得无菌苗；

3)将步骤2)中获得的无菌苗，转接到上述的继代增殖培养基上进行继代增殖培养。

在本发明中，以枣头枝的茎段为外植体。在本发明中，所述枣头枝的茎段优选为新生的枣头枝，所述枣头枝优选的为剪掉全部叶片后的枣头枝；所述枣头枝的茎段为1-3cm的长度；

在本发明中，在对茎段外植消毒处理前，需要所述对茎段外植体进行洗衣粉水刷洗和自来水冲洗，优选的，所述自来水冲洗的时间为30min以上。

在本发明中，茎段外植体的消毒需要在无菌环境中进行，优选的，所述无菌环境是超净工作台上的无菌烧杯内。

在本发明中，所述消毒处理包括依次进行的酒精浸泡和次氯酸钠溶液浸泡；所述酒精浸泡的时间为0.5～1.5min，优选为0.8～1.2min；所述酒精的体积浓度为65％～75％；所述次氯酸钠溶液浸泡的时间优选为8～10min，进一步优选为8min，所述次氯酸钠的有效氯含量为4％～6％，优选为5％；所述氯酸钠溶液浸泡过程中，还包括摇动烧杯的步骤，优选的，摇动烧杯的次数为3～5次。

在本发明中，外植体消毒后，优选的加无菌进行水洗，优选的水洗次数为5～7次。

在本发明中，将茎段接种到装有芽启动培养基的试管中进行培养，作为优选，所述芽启动培养基以MS为基础培养基，还包括以下浓度的组分：0.5～2mg/L BA、0.1～1.0mg/LIBA、25～35g/L蔗糖；作为优选，培养温度为23～27℃，培养的光照周期为13～18小时/天。

在本发明中，所述茎段接种到装有芽启动培养基后，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

本发明在获得所述无菌苗后，将所述无菌苗转接到上述的继代增殖培养基上进行继代增殖培养；作为优选，培养温度为23～27℃，培养的光照周期为13～18小时/天。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、酸枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复，此步的目的是由田间大树上的有菌苗转化为试管内的离体无菌苗，是获得无菌试管苗的第一步。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加1mg/L BA、0.05mg/L TDZ、0.2mg/L IBA、2mg/L D-生物素、2mg/L D-泛酸钙、50mg/L抗坏血酸、30g/L蔗糖的继代培养基上进行继代增殖。

实施例2

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、酸枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加2mg/L BA、0.02mg/L TDZ、0.3mg/L IBA、1mg/L D-生物素、1mg/L D-泛酸钙、300mg/L抗坏血酸、25g/L蔗糖的继代培养基上进行继代增殖。

实施例3

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、酸枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加0.1mg/L BA、1.0mg/L TDZ、0.05mg/L IBA、0.5mg/L D-生物素、0.5mg/L D-泛酸钙、100mg/L抗坏血酸、25g/L蔗糖的继代增殖培养基上进行继代增殖。

实施例4

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、酸枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加0.5mg/L BA、0.5mg/L TDZ、0.1mg/L IBA、0.1mg/L D-生物素、0.1mg/L D-泛酸钙、200mg/L抗坏血酸、35g/L蔗糖的继代增殖培养基上进行继代增殖。

实施例5

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加2mg/L BA、0.5mg/L TDZ、0.1mg/L IBA、1mg/L D-生物素、1mg/L D-泛酸钙、300mg/L抗坏血酸、30g/L蔗糖的继代增殖培养基上进行继代增殖。

对比例1

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、酸枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加2mg/L BA+0.05mg/L TDZ+0.05mg/L IBA+35g/L蔗糖的继代增殖培养基上进行继代增殖。

对比例2

1.无菌组培苗的获得。分别从抗枣疯病枣树、酸枣优系A、酸枣优系S、酸枣优系W砧木上剪取新生长的枣头枝，剪掉叶片，把枣头枝切成1-3cm的茎段(根据节间的长段进行切段)。每个优系取50个茎段，不设重复。茎段外植体经过洗衣粉水刷洗，而后用自来水流水冲洗30min以上，把茎段放入超净工作台上的无菌烧杯内，加入70％酒精杀菌1min，倒出酒精，加入有效氯为5％的次氯酸钠溶液杀菌8min，中间摇动3－5次，使外植体充分接触杀菌液。倒出次氯酸钠，加无菌水洗5－7次。取出外植体，用无菌吸水纸吸去外植体表面的多余水分，把茎段接种到装有芽启动培养基MS+2mg/LBA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖的试管内，置光照周期为16小时/天的光培养条件下培养，培养2周后腋芽开始萌发，4周后获得伸长生长的绿色无菌苗。

2.无菌组培苗的继代增殖。启动培养基上获得的组培苗，转移到以MS为基础培养基，并添加1mg/L BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖的继代增殖培养基上进行继代增殖。

对比例3

将实施例1中的增殖继代培养基的D-生物素这一组分删除，其它步骤和条件与实施例1相同。

对比例4

将实施例1中的增殖继代培养基的D-泛酸钙这一组分删除，其它步骤和条件与实施例1相同。

对比例5

将实施例1中的增殖继代培养基的抗坏血酸这一组分删除，其它步骤和条件与实施例1相同。

对比例6

将实施例1中的增殖继代培养基的D-生物素这一组分的浓度设置为3.0，其它步骤和条件与实施例1相同。

对比例7

将实施例1中的增殖继代培养基的D-泛酸钙这一组分的浓度设置为5.0，其它步骤和条件与实施例1相同。

对比例8

将实施例1中的增殖继代培养基的抗坏血酸这一组分的浓度设置为500，其它步骤和条件与实施例1相同。

增殖结果：

对单株苗增殖芽苗数进行统计，取平均值，结果如表2所示。

表2培养基组成对枣不同优系组培苗增殖效率的影响

由上表可知，使用本发明提供的继代增殖培养基，抗枣疯病优系、酸枣优系的增殖系数有了很大程度的提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。