血浆外泌体生物标志物在胃癌新辅助化疗敏感人群筛查或疗效预测中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种胃癌新辅助疗法相关的生物标志物及其应用。

背景技术

全球约42％的胃癌发生在我国，其中约71％为进展期胃癌(AGC)。近年来，AGC的治疗模式逐渐从单一手术转变为以手术为主的多学科综合治疗。多项研究表明，对多数分期较晚的AGC，围手术期治疗模式相较于标准根治术联合术后辅助化疗的模式，能进一步改善患者生存。

新辅助化疗(NACT)是实施手术前所做的全身化疗，目的是使肿瘤缩小、降低肿瘤分期、为术后提供药敏结果及清除未检测到的微小转移，以利于后续的手术等治疗，可显著改善进展期胃癌患者的生存。然而，超过一半的胃癌患者术后病理癌灶无明显的肿瘤退缩，提示该部分患者无法从NACT获益。因此，探索NACT疗效预测、甄别出对NACT敏感的患者对于临床实践十分重要。

目前，临床上常用TNM分期和TRG分级判断新辅助治疗人群和治疗的反应，然而，TNM标准无法识别治疗的敏感人群；TRG分级依靠术后病理，无法进行新辅助治疗前及过程中的疗效评估。近期研究发现，肿瘤的分子分型与胃癌患者化疗疗效呈一定的相关性，如TCGA、ACRG，其中TCGA分型中MSI-H分型的肿瘤对化疗疗效较差；肿瘤突变负荷(TMB)也具有一定的提示作用。然而，运用这些分子分型指导治疗，与临床实际患者的治疗是否受益仍有待验证；并且，多次内镜活检获得足够的样本进行分子谱分析不仅对患者损伤大，成本高，在临床中也难以实现。

此外，既往研究多依据患者生存来筛选标志物，患者生存受许多因素影响，不能直接反应治疗引起的肿瘤病理变化。通过评估肿瘤病理反应来评估治疗效果更加直接和可靠，而目前相关的生物标志物较少，因此，迫切需要开发精准度更高、更为可靠的可以筛选胃癌新辅助化疗敏感人群、预测胃癌新辅助化疗疗效或筛选胃癌治疗药物的外泌体生物标志物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种能够快速、准确筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效的生物标志物，及其组合物、试剂、试剂盒和应用。本发明提供的技术方案无需体内活检，仅需少量血液即可实现无创、实时检测，成本低，使用方便；具有高AUC值、高灵敏度、高准确度和高稳定性；通过评估肿瘤病理反应来评估治疗效果更加直接可靠；能够有效筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效或筛选治疗胃癌药物。

具体的，本发明提供一种筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效或筛选治疗胃癌药物的生物标志物，所述生物标记物包括以下基因中的至少一种：let-7i-5p，miR-1307-3p、miR-181a-5p、miR-1843、LZIC、SRSF6、lncFTH1-211和lncPTMA-209。

进一步的，所述生物标记物为外泌体生物标记物；

更进一步的，所述生物标志物为血浆外泌体生物标志物。

另一方面，本发明还提供一种本发明生物标志物的用途，所述生物标志物用于制备筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群的产品中的应用或制备对胃癌患者新辅助化疗疗效预测的产品中的应用或制备筛选胃癌治疗药物的产品中的应用，所述生物标记物包括以下基因中的至少一种：let-7i-5p，miR-1307-3p、miR-181a-5p、miR-1843、LZIC、SRSF6、lncFTH1-211和lncPTMA-209。

进一步的，所述生物标记物包括其中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种；优选的，所述生物标记物包括其中的两种、三种或四种。

进一步的，所述生物标志物至少包括let-7i-5p；优选的，所述生物标志物至少包括let-7i-5p和LZIC、let-7i-5p和miR-1307-3p、let-7i-5p和lncPTMA209、或let-7i-5p+lncFTH1-211。

更进一步的，所述生物标志物为：let-7i-5p+lncFTH1-211、let-7i-5p+LZIC、let-7i-5p+lncPTMA209、let-7i-5p+miR-1307-3p+lncFTH1-211、miR-1843+let-7i-5p+LZIC、let-7i-5p+miR-1307-3p+LZIC、miR-1843+let-7i-5p+lncPTMA209、miR-181a-5p+let-7i-5p+LZIC、miR-181a-5p+let-7i-5p+lncPTMA209、miR-1843+let-7i-5p+miR-1307-3p+LZIC或miR-181a-5p+let-7i-5p+miR-1307-3p+LZIC。

进一步的，所述生物标记物为外泌体生物标记物；更进一步的，所述生物标志物为血浆外泌体生物标志物。

进一步的，所述新辅助化疗是指氟尿嘧啶类抗肿瘤药物联合铂类抗肿瘤药物的化疗；优选的，所述氟尿嘧啶类为5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、优福定、卡莫氟或替吉奥，所述铂类为顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂或奥沙利铂；进一步优选的，所述新辅助化疗为奥沙利铂-替吉奥方案或奥沙利铂-卡培他滨方案。

优选的，所述产品中包含奥沙利铂和替吉奥，或卡培他滨和卡培他滨。

进一步的，胃癌是指进展期胃癌。

进一步的，所述产品包括用于检测生物标志物的表达水平的试剂；优选的，所述试剂为包括荧光定量PCR试剂；进一步任选的，包括检测引物和/或探针。

进一步的，所述产品包含外泌体提取试剂；优选的，所述产品包含血浆外泌体提取试剂；更优选的，所述产品包含血浆外泌体RNA提取试剂。

进一步的，所述产品是试剂、试剂盒或基因芯片。

另一方面，本发明还提供一种生物标记物的组合物，所述生物标记物的组合物包括以下基因中两种或多种：let-7i-5p，miR-1307-3p、miR-181a-5p、miR-1843、LZIC、SRSF6、lncFTH1-211和lncPTMA-209。

进一步的，生物标记物的组合物包括两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种；优选的，所述生物标记物包括两种、三种或四种。

进一步的，至少包括let-7i-5p和LZIC、let-7i-5p和miR-1307-3p、let-7i-5p和lncPTMA209或let-7i-5p和lncFTH1-211。

更进一步的，生物标记物的组合物为：let-7i-5p+lncFTH1-211、let-7i-5p+LZIC、let-7i-5p+lncPTMA209、let-7i-5p+miR-1307-3p+lncFTH1-211、miR-1843+let-7i-5p+LZIC、let-7i-5p+miR-1307-3p+LZIC、miR-1843+let-7i-5p+lncPTMA209、miR-181a-5p+let-7i-5p+LZIC、miR-181a-5p+let-7i-5p+lncPTMA209、miR-1843+let-7i-5p+miR-1307-3p+LZIC或miR-181a-5p+let-7i-5p+miR-1307-3p+LZIC。

进一步的，所述生物标志物用于筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效或筛选治疗胃癌的药物。

进一步的，所述胃癌为进展期胃癌。

进一步的，所述生物标记物为外泌体生物标记物。

更进一步的，所述生物标志物为血浆外泌体生物标志物。

另一方面，本发明还提供一种试剂，所述试剂用于检测生物样本中本发明生物标志物及其组合物的表达水平。

进一步的，所述试剂包括荧光定量PCR检测试剂；优选的，所述检测试剂包括检测引物和/或探针。

进一步的，所述试剂还包括外泌体提取试剂；优选的，包含血浆外泌体提取试剂；进一步优选的，包含血浆外泌体RNA提取试剂。

进一步的，所述试剂用于筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效或筛选胃癌治疗药物。

另一方面，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的检测试剂。

进一步的，所述试剂盒用于筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效或筛选胃癌治疗药物。

另一方面，本发明还提供一种基因芯片，所述基因芯片包括用于检测本发明生物标志物或生物标志物的组合物的表达水平的探针。

进一步的，所述基因芯片用于筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群、预测胃癌患者新辅助化疗疗效或筛选胃癌治疗药物。

另一方面，本发明还提供上述生物标志物、生物标志物的组合物、检测试剂、检测试剂盒或基因芯片在制备筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群的产品、预测胃癌患者新辅助化疗疗效产品或筛选治疗胃癌药物产品中的应用。

进一步的，所述胃癌为进展期胃癌。

进一步的，所述新辅助化疗是指氟尿嘧啶类抗肿瘤药物联合铂类抗肿瘤药物的化疗；优选的，所述氟尿嘧啶类为5-氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、优福定、卡莫氟或替吉奥，所述铂类为顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂或奥沙利铂。

更进一步的，所述新辅助化疗是指奥沙利铂-替吉奥方案或奥沙利铂-卡培他滨方案。

进一步的，所述生物标记物为外泌体生物标记物；更进一步的，所述生物标志物为血浆外泌体生物标志物。

进一步的，所述产品中还包括外泌体提取试剂，优选的，包含血浆外泌体提取试剂，进一步优选的，包含血浆外泌体RNA提取试剂。

进一步的，前述各方面中所述引物和/或探针序列选自下表：

另一方面，本发明还提供筛选胃癌患者新辅助化疗敏感人群的方法，提取待测人群血浆外泌体RNA，测定本发明生物标志物或其组合物的表达水平，通过分析表达水平，筛选对于新辅助化疗的敏感人群。

另一方面，本发明还提供一种对胃癌患者进行新辅助化疗疗效预测的方法，提取待测胃癌患者血浆外泌体RNA，测定生物样本中本发明生物标志物或其组合物的表达水平，通过分析表达水平，对其治疗效果进行预测。

另一方面，本发明还提供一种胃癌治疗药物的筛选方法，将待筛选药物加入胃癌细胞中，培养后，测定本发明的生物标志物或其组合物的表达量，比较药物加入前后胃癌细胞中生物标志物或其组合物的表达水平，能够使表达量改变的药物即为潜在的治疗胃癌的药物。

相对于现有技术，本发明至少获得如下有益的技术效果：

1.本发明首次发现血浆外泌体生物标记物let-7i-5p，miR-1307-3p、miR-181a-5p、miR-1843、LZIC、SRSF6、lncFTH1-211和lncPTMA-209为胃癌患者对新辅助化疗响应的关键分子，具有高AUC值、高灵敏度、高准确度和高稳定性，可以有效筛选胃癌新辅助化疗敏感人群、预测胃癌新辅助治疗的疗效或筛选治疗胃癌的药物。

2.本发明通过液体活检的方式进行，可以实现无创、实时监测，成本低、使用方便、稳定性好。每次仅需1毫升血浆，对患者损伤小，避免了通过胃镜进行多次组织活检以获取足够肿瘤组织进行分子分型鉴定造成患者身体损伤的风险，并且可以实现伴随治疗的多次采样和评估，极大的降低了检测成本，使用方便。

3.本发明所提供的生物标志物为外泌体生物标志物，相比于血浆中的RNA和蛋白质分子，受益于外泌体膜结构的保护，分子表达水平更加稳定，具有更高的灵敏性和特异性，具有重要临床应用价值。

4.利用本发明的技术方案，可在治疗开始之前，仅通过少量血液样本即可实现胃癌新辅助化疗敏感人群的筛选、预测胃癌患者对新辅助化疗的疗效，极大推动胃癌患者优化治疗策略的实现。

5.本发明通过评估肿瘤病理反应来评估治疗效果，相对既往依据患者生存筛选标志物而言，更加直接、可靠和有效。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1：本发明技术方案流程图；

图2：外泌体鉴定结果(Western Blot、投射电镜、纳米示踪技术)；

图3：外泌体RNA的TPM值进行差异分析；

图4：图A-C为两组差异标志物的交集；

图5：两分子模型的训练集、验证集AUC图；

图6：三分子模型训练集、验证集AUC图；

图7：四分子模型训练集、验证集AUC图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。本发明的整体方法参见图1。

实施例1新辅助化疗疗效相关的外泌体RNA的筛选

1.纳入对象

我们随机选择了10例健康人志愿者和20例进展期胃癌(AGC)患者作为纳入对象。健康人志愿者来自北京大学第一医院，胃癌患者来自北京大学肿瘤医院胃肠肿瘤中心一病区。两组男性均占90％，男女比例为9:1；平均年龄为57岁，年龄范围为43-73岁。20名AGC患者均接受了SOX(奥沙利铂-替吉奥)或XELOX(奥沙利铂-卡培他滨)方案的新辅助化疗(这两种方案为中国临床肿瘤学会(CSCO)指南(2021版)推荐方案)，化疗方案为：奥沙利铂(130mg/m

以上患者疗效根据下述判断方法和标准区分：手术后依据切除标本的病理情况由2名副主任医师或以上职称的病理医师进行疗效判断，原发癌灶退缩明显，无癌细胞或仅有散在的癌细胞为疗效好；癌灶退缩不明显，无肿瘤细胞坏死或仅有小部分癌细胞坏死为疗效差。

2.血浆收集：

在患者接受术前新辅助化疗前，早上8-10点，空腹状态下收集患者外周血2.0mL，4℃、3000rpm条件下离心10分钟，提取1.0mL血浆，保存于-80℃冰箱。健康者在签署知情同意之后，采用相同的方法进行血浆收集。

3.外泌体提取：

血浆解冻后，首先通过0.22um的滤器(EMD Millipore,Billerica,MA)进行过滤，过滤后的血浆加入到10.0mLPBS冲洗后的SEC排阻柱(Echobiotech,China)上，加入10.0mLPBS,每0.5mL为一馏分，收集第4-8馏分，然后使用100kDa的超滤器(Merck,Germany)浓缩至50uL，利用Western blot、透射电子显微镜以及纳米示踪技术进行外泌体检测(图2)，通过BCA试剂盒(Pierce Biotechnology,Rockford,CA)对提取的外泌体进行定量分析。

4.外泌体RNA提取：

使用miRNeasy血浆试剂盒(Qiagen,cat.No.217004)对提取外泌体的总RNA。

5.外泌体mRNA，miRNA及lncRNA的测序

我们对上述对象所获取的血浆来源外泌体总RNA准备进行测序。基于SMARTerStranded Total RNA-Seq Kit V2(Takara Bio USA,Inc.)试剂盒检测构建外泌体RNA表达文库并根据RNA独特的分子结构(UMI)进行定量。在Illumina Hiseq平台生成模板和对应的reads。通过生物信息学方法计算每个RNAs对应的TPM值(图3)。

6.外泌体mRNA，miRNA及lncRNA的差异分析

根据外泌体RNA的TPM值进行差异分析，一般外泌体排到细胞外后，很难确定细胞来源。因此，我们首先使用Mann-Whitney U test方法分析了健康人与胃癌患者的外泌体RNA表达差异，甄别与胃癌相关的外泌体RNA。之后，我们进一步分析疗效好与疗效差患者的差异表达外泌体RNA，为了排出可能由个体差异产生的干扰，我们取两次分析的交集作为胃癌新辅助化疗相关的外泌体RNA进行后续的分析(图4)。

7.新辅助化疗疗效相关的外泌体RNA生物标记物筛选

通过分析外泌体mRNA、miRNA和lncRNA甄别新辅助化疗疗效好的胃癌患者的P值、差异倍数(FC)和受试者工作曲线(ROC)下面积(AUC)，选择P小于0.05,AUC大于0.80及差异倍数小于0.67或大于1.50的外泌体RNA，共筛选出31个外泌体RNA(表1)。

表1:曲线下面积AUC超过0.8的差异表达外泌体RNA.

实施例2.新辅助化疗疗效相关的外泌体RNA生物标记物的验证

为进一步验证外泌体RNA的预测效力，我们综合筛选出差异倍数较高的18种外泌体RNA(具体为：9个外泌体miRNA(miR-27a-3p、miR-335-5p、miR-454-3p、miR-152-3p、miR-181a-5p、miR-1843、let-7i-5p、miR-130a-3p和miR-1307-3p)、5个外泌体mRNA(LZIC、KMT2E、DAPP1、DAB2和SRSF6)和4个lncRNA(lncPTMA-209、lncRMRP-202、lncRPS24-210和lncFTH1-211))，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)在新的独立的43名进展期胃癌患者队列中进行了验证。新的43名患者同样为进展期胃癌患者并接受了SOX或XELOX方案的新辅助化疗和D2胃癌切除术，其中19名患者疗效好，24名患者疗效差。其中分析对象的治疗方法、疗效标准、血浆收集方法、外泌体、外泌体RNA的提取方法与实施例1相同。

通过PrimeScript

表2 RNA的探针和引物序列

综合外泌体RNA在训练集和验证集的AUC、表达趋势一致性、统计学差异和差异倍数，筛选出8个预测新辅助化疗疗效效果较佳外泌体RNA(见表3)，其中包括4个外泌体miRNA(let-7i-5p，miR-1307-3p、miR-181a-5p和miR-1843)、2个外泌体mRNA(LZIC和SRSF6)和2个外泌体lncRNA(lncFTH1-211和lncPTMA-209)，这些外泌体RNA验证数据与表1中展示的候选测序组的表达趋势一致，且其在疗效好与疗效坏患者之间具有统计学意义的差异。

表3:新辅助化疗疗效相关单一外泌体RNA的验证结果.

另外，miR-335-5p，miR-454-3p,lncRMRP-202和lncRPS24-210表达量在验证集疗效好与疗效差的患者间存在差异(P＜0.05)，但趋势与测序组相反，综合两组数据后无统计学差异；其他6个外泌体RNA的表达水平在验证集疗效好与疗效差的患者间未表现出明显的差异。

综上，let-7i-5p、miR-1307-3p、miR-181a-5p、miR-1843、LZIC、SRSF6、lncFTH1-211和lncPTMA-209为与胃癌新辅助化疗疗效相关的外泌体RNA分子(表3)，其单分子AUC分布于0.723-0.812，区分效力高，AUC在训练集和验证集均较高，稳定性强，可用于临床胃癌新辅助化疗敏感人群的筛查和疗效预测。

为了进一步探索更好的评估方法，我们通过Z-score方法对8个外泌体RNAs(包括4个外泌体miRNA：let-7i-5p，miR-1307-3p、miR-181a-5p和miR-1843；2个外泌体mRNA：LZIC和SRSF6；以及2个外泌体lncRNA：lncFTH1-211和lncPTMA-209)在测序组和验证组患者的表达进行标准化，然后通过已有数据进行多指标模型的构建。

运用逻辑回归的方法，我们首先将上述8个外泌体分别构建了两分子模型组、三分子模型组和四分子模型组，发现在三组模型中，评效在训练集和验证集AUC均大于0.80的两分子模型有3个，三分子模型有6个，四分子模型有2个(表4、图5-7)，并且，它们在训练集中AUC均大于0.90，显示其特异性、灵敏度和稳定性均较高，这些模型均可有效的筛选出潜在的新辅助化疗敏感的胃癌患者、预测新辅助化疗的疗效。并且通过对比可见，二分子模型、三分子模型和四分子模型相对单分子模型而言AUC均得到进一步提高。

表4训练集和验证集AUC在0.8以上的模型

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。