KDM1A的表达联合复发/转移状态在食管鳞癌根治术患者中的预后评估应用

技术领域

本发明属于疾病预后领域，具体涉及KDM1A的表达联合复发/转移状态在食管鳞癌根治术患者中的预后评估应用。

背景技术

食管癌是消化道肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一，可分为食管腺癌和食管鳞癌。

准确预测或评估食管癌患者的预后对于临床进一步的治疗和随访具有重要意义。然而，目前除了国际TNM分期外还没有一种简便有效的方法可以更加准确地预测食管癌患者的预后。TNM分期预测患者的预后比较繁琐，需要准确地评价肿瘤的浸润深度、转移淋巴结的个数、肿瘤有无远处转移等；另外，尽管TNM在国内外多种肿瘤中都是临床常用标志物，但对整个人群而言，仍存在精准度差的问题。

目前，根据中国临床肿瘤学会(CSCO)指南可知，对于根治术后发生复发/转移的食管鳞癌患者，目前尚无有效的治疗方案。由此可见，晚期复发 /转移食管鳞癌患者的预后诊断标志物是我国食管鳞癌患者5年生存率进一步改进的主要障碍。如果能够发现一些与食管磷癌患者生存期相关的分子标志物，则能够对不同食管磷癌患者采取不同的治疗方式，采取更为主动的治疗方式，以助于提升其总生存期。

因此，本领域亟需寻找一种能够准确预测食管鳞癌患者预后的新型方案。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供KDM1A的表达联合复发/转移状态在食管鳞癌根治术患者中的预后评估应用，并提供对食管鳞癌根治术患者进行预后评估的方法，用于更加准确地判断食管鳞癌根治术患者的预后情况，以便给予更加及时、合理的术后个体化治疗。

本发明首次提供了KDM1A作为分子标志物在食管鳞癌临床亚分组预后评估中的应用，所述临床亚分组的分组依据为食管鳞癌患者根治术后复发/ 转移的状态。

本发明另一方面还提供了一种食管鳞癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包含能够检测样本中KDM1A的蛋白表达或mRNA表达水平的试剂。

一些实施例中，所述试剂盒还包含能够辅助检测患者根治术后复发/转移状态的试剂。

优选地，所述试剂盒包括KDM1A蛋白抗体。

本发明另一方面还提供了前面任一项所述的试剂盒在食管鳞癌预后评估中的应用。

优选地，待评估群体为完成根治术且术前无辅助化疗史的食管鳞癌患者。

本发明另一方面还提供了一种采用前面任一项所述的试剂盒对食管鳞癌进行预后评估的方法，所述方法包括以下步骤：

S1，检测待测样本中KDM1A的蛋白表达水平或mRNA表达水平；

S2，根据步骤S1的检测结果对食管鳞癌进行初步预后分型：当KDM1A 表达水平高时，进一步结合术后复发/转移状态进行预后评估；当KDM1A表达水平低时，无法通过术后复发/转移的状态，对KDM1A低表达患者进行预后评估；

S3，定期随访并诊断KDM1A高表达受试者的术后复发/转移状态，并依据术后复发/转移的状态进行预后评估：当术后发生复发/转移时，受试者具有不良预后，而当术后未发生复发/转移时，受试者具有较好预后。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明首次提出基于术后复发/转移状态联合KDM1A的表达水平来判断受试者的预后情况。为评估食管鳞癌根治术患者术后的生存时间提供了一条全新的途径，对于食管鳞癌的预后判断及个体化治疗具有重要意义。

(2)通过实施例可知，本发明指出：当术后发生复发/转移时，相较于 KDM1A低表达患者，KDM1A高患者具有更差的预后。也就是说，KDM1A 可以进一步细分术后发生复发/转移的食管鳞癌根治术患者的预后，并且提示 KDM1A高表达的术后发生复发/转移的人群可能对KDM1A靶向小分子抑制剂治疗更佳敏感。

附图说明

图1表示本发明纳入研究的食管鳞癌根治术患者总人群预后总生存时间。

图2表示KDM1A表达与食管鳞癌根治术患者预后的研究，其中，

A表示KDM1A在癌旁正常组织(N)、食管鳞癌组织(T)和淋巴结转移淋巴结组织(LN_T)中的表达对比；

B表示食管鳞癌组织中KDM1A表达与食管鳞癌根治术患者预后的关系。

图3表示术后复发/转移是食管鳞癌患者的临床预后诊断指标，其中，

A表示复发/转移状态与食管鳞癌根治术患者预后的关系；

B表示复发/转移临床特征亚组预后的Cox回归分析结果。

图4表示KDM1A联合术后复发/转移状态细分预测食管鳞癌患者预后，其中，

A-B表示KDM1A表达水平联合术后复发/转移状态与食管鳞癌根治术患者预后的关系；

B表示KDM1A表达水平联合术后复发/转移状态细分食管鳞癌亚组预后的Cox回归分析结果；

D表示KDM1A在术后复发/转移食管癌鳞癌患者中的预后诊断应用方案。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

LSD1又称为KDM1A、AOF2或BHC110，属于FAD依赖型胺氧化酶家族成员，主要由3个部分组成：N末端的SWIRM结构域，中间的Tower结构域和C末端的胺氧化酶结构域(AOL)。其主要功能是对组蛋白和非组蛋白的去甲基化修饰调控，主要定位于细胞核内，调控基因转录的激活和抑制，被誉为细胞深处的基因“开关”。本发明申请人通过收集行根治术且术前无辅助化疗史的食管鳞癌患者的临床检测数据，包括术前COPD诊断、早期淋巴结转移状态、术后复发/转移状态等，探究KDM1A联合临床特征在食管鳞癌中的预后意义，最终本发明首次提供了KDM1A作为分子标志物在食管鳞癌临床亚分组预后评估中的应用，所述临床亚分组的分组依据为食管鳞癌患者根治术后复发/转移的状态。

本发明另一方面还提供了一种食管鳞癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包含能够检测样本中KDM1A的蛋白表达或mRNA表达水平的试剂。

一些实施例中，所述试剂盒还包含能够辅助检测患者根治术后复发/转移状态的试剂。例如：MRI造影剂、PET-CT示踪剂、骨扫描显像剂中的任意一种或两种以上的组合

优选地，所述试剂盒包括KDM1A蛋白抗体。

本发明另一方面还提供了前面任一项所述的试剂盒在食管鳞癌预后评估中的应用。

优选地，待评估群体为完成根治术且术前无辅助化疗史的食管鳞癌患者。

本发明另一方面还提供了一种采用前面任一项所述的试剂，或前面所述的试剂盒对食管鳞癌进行预后评估的方法，所述方法包括以下步骤：

S1，检测待测样本中KDM1A的蛋白表达或mRNA表达水平；

S2，根据步骤S1的检测结果对食管鳞癌进行初步预后分型：当KDM1A 表达水平高时，进一步结合术后复发/转移状态进行预后评估；当KDM1A表达水平低时，无论术后是否发生复发/转移，预后无统计学差异，换言之，当 KDM1A表达水平低时，无法通过术后复发/转移的状态，对KDM1A低表达患者进行预后评估；

S3，定期检测KDM1A高表达受试者的术后复发/转移状态，并依据术后复发/转移的状态进行预后评估：当术后发生复发/转移时，受试者具有不良预后，而当术后未发生复发/转移时，受试者具有较好预后。

下面结合附图和实施例详细讲解本发明标志物联合临床特征的预后应用价值，首先对本发明实施例中涉及的技术用语进行解释：

根治术：食道癌根治术，是对食道癌进行手术切除的全称，包括肿瘤切除、肿瘤上下端足够长度的食道、受累组织器官的切除、胃切除和周围软组织、组淋巴结清扫、消化道重建等，以及术前中后的围术期处理的全过程。

HR：hazard ratio，风险比，指一组研究对象发生某特定事件的瞬时风险与另一组研究对象发生某特定事件的瞬时风险之比。

95％CI：95％confidence interval，95％置信区间，指按事先给定的可信度0.95来估计包含未知总体参数的一个区间范围。

5年生存率：肿瘤患者存活时间超过5年的概率。

AJCC8分级：the American Joint Committee on Cancer 8th，即第8版美国癌症联合委员会指南定义的TNM分级。

早期有/无淋巴结转移：指患者根治术中清扫的淋巴结鉴定为阳性/阴性；阳性指淋巴结中鉴定出含有食管鳞癌细胞，阴性则指淋巴结中不含有食管鳞癌细胞。

术后复发/转移：指患者根治术后常规医疗过程中，食管位置再次出现肿瘤或者身体其它部位出现的肿瘤并被临床病理医生证实为转移性的食管癌。

预后总生存时间：指患者根治术后至死亡出现前的总生存时间。

预后无疾病进展生存时间：指患者根治术后至复发/转移等出现前的生存时间。

本申请具体研究过程如下：

实施例中涉及的研究对象、诊断标准及实验方法：

1、研究对象

2013-2017年在胸外科行食管鳞癌根治术且术前未接受放疗或化疗的食管鳞癌患者中根据纳入和排除标准最终纳入91例患者。其中，纳入和排除标准如下所示：

纳入标准：

(1)术前无放化疗史；

(2)接受ESCC根治术的患者；

(3)术后按照CSCO食管癌诊疗指南常规辅助治疗和随访的患者；

(4)原发性ESCC；

(5)FFPE样本肿瘤细胞>15％。

排除标准：

(1)非鳞癌的食管癌患者；

(2)术前接受放化疗辅助治疗食管鳞癌患者；

(3)其它转移至食管的肿瘤；

(4)非根治手术患者，如ESD食管鳞癌患者；

(5)非疾病相关死亡，如车祸。

从医院信息系统HIS系统中提取患者的临床信息，并在2021年9月完成最近一次术后患者的随访。如表1所示，本发明研究者中，男性(Male) 患者约为87.9％，AJCC8的II级和III级患者分别为49.5％和34.1％，肿瘤组织直径(Tumor diameter)>2cm的患者占72.5％，有吸烟史(Tobacco history) 的患者占17.6％，有饮酒史(Alcohol history)的患者占19.8％，肿瘤发生于胸中段(Tumor_position/Middle)患者占68.1％，淋巴结转移阳性患者占 52.7％，术前高血压(Preoperative hypertension)阳性患者占63.7％，术前COPD(Preoperative COPD)阳性比例为6.6％，术前有心血管疾病(Preoperative coronaryheart disease)的患者占9.9％，采用Sweet术式的患者占47.3％，根治术后患者接受辅助放化疗(Adjuvant chemoradiotherapy)的比例为64.8％，术后复发/转移(R/M status)比例为31.9％。纳入研究的食管鳞癌总人群的5 年生存率为50％(图1)。

表1 研究对象临床基线特征

2、诊断标准

食管鳞癌诊断标准：参照CSCO(2018版)食管癌诊疗指南；

术前COPD诊断标准：慢性阻塞性肺部疾病(Chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)，支器官扩张及后1s用力呼气量FEV1 (post-bronchodilator forcedexpiratory volume in 1second)/强迫肺活量FVC (forced vital capacity)比值小于70％时，即诊断为COPD阳性；

术前糖尿病诊断标准：空腹血糖≥7.0mM或者餐后2小时血糖水平≥11.1mM或者糖化血红蛋白水平≥6.5％，即诊断为糖尿病阳；

术前高血压诊断标准：根据欧洲心脏病学会制定的高血压标准，患者在至少3个场合收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg，诊断为高血压阳；

术前心血管疾病诊断标准：患者有心绞痛或者劳力性呼吸困难的临床症状；心电图阳性提示患者心肌缺血；患者存在多种冠状动脉危险因素，如高血压，糖尿病，高血脂，同时患者当前吸烟，并存在中风；冠状动脉计算机断层扫描血管造影检查根据心血管疾病的存在和严重程度将患者进一步分为无心血管疾病(CAD)(未检测到斑块)，非阻塞性CAD(1-49％)、中度阻塞性CAD(50-69％)和严重狭窄(≥70％)，中度及严重狭窄即诊断为心血管疾病阳性。

3、免疫组化染色及评分标准

基于Roche/Ventana的半自动IHC检测方法：参照BENCHMARK ULTRA (仪器型号)简易适用手册运行IHC，首先在徕卡Leica病理切片机上将TMA 蜡块切片(3-5mm)平铺于Ventana专用防脱载玻片上，随后打开仪器依次填充散装瓶、清空废液瓶，创建标签，安装试剂盘，将上述切片置于切片托盘上，运行仪器，进行FFPE样本前处理，然后取出切片滴加预实验确定稀释比例的特定一抗，再将切片放入试剂盘，启动后续染色，结束后取出封片的玻片于徕卡Leica显微镜下由专业的病理诊断医生判断染色强度和肿瘤细胞染色百分率(％)，综合评分定义为IRScore。具体评分标准如表2所示。

表2 IHC的评分标准

实施例1KDM1A表达水平不能作为ESCC总人群预后总生存时间的诊断标记物

本发明课题组收集了60例癌旁正常组织(N)、91例食管鳞癌组织(T)、 33例淋巴结转移淋巴结组织(LN_T)纳入IHC方法检测分析KDM1A的表达。经单因素ANOVA统计分析KDM1A的IHC染色分数(IRScore)发现， KDM1A在癌旁正常组织、食管鳞癌组织和淋巴结转移淋巴结组织中表达无显著差异(图2的A)。

用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验进行根治术食管鳞癌组织中 KDM1A表达的生存分析，结果如图2的B所示，KDM1A高表达(KDM1A_IRScore

进一步进行根治术食管鳞癌组织中KDM1A的表达与食管癌患者临床特征的相关性分析，结果发现：如表3所示，与已有报道不一致，我们术前未接受放化疗的食管癌根治术样本中KDM1A的表达与淋巴结是否转移、 AJCC8分级、肿瘤大小(Tumor size)、高血压(HBP)、术前COPD、术前心血管疾病、术前糖尿病、吸烟史、饮酒史、手术方式等均无相关性。

以上结果表明，单独依据KDM1A的表达水平，并不能预测ESCC总体人群的5年总生存率。因此，KDM1A不能作为ESCC总人群的总生存时间预后标志物。

表3 食管鳞癌组织中KDM1A的表达与患者临床特征的相关性分析

实施例2KDM1A不是术前未接受放化疗食管鳞癌根治术患者术后复发/ 转移的独立预后危险因子

本申请评估了临床接受根治术的食管鳞癌患者复发/转移临床特征亚组的相关性因子以及5年生存率独立预后危险因子。根据患者行根治性手术后有无发生复发/转移，将研究者分为复发/转移(R/M

随后对两组患者进行总生存时间预后的单因素和多因素Cox回归分析，结果如图3的B图所示，术中清扫淋巴结的阴阳性(LM

进一步进行食管鳞癌复发/转移发生与否与临床特征的相关性分析，结果发现：如表4所示，ESCC患者根治术后是否发生复发/转移与患者术后是否接受辅助化疗和术前COPD诊断密切相关，术后接受辅助化疗的患者更容易发生复发/转移(p＝0.014)，而术前诊断为COPD的患者更容易发生复发/转移(p＝0.012)。

表4 术后复发/转移状态与患者临床特征的相关性分析

实施例3 KDM1A联合复发/转移状态细分预测食管鳞癌根治术患者的预后

基于本发明实施例1和2的研究，本发明申请人对KDM1A的表达水平与患者根治术后复发/转移状态的联合预后诊断价值进行了分析和评估，以期 KDM1A的表达能在ESCC临床亚分组的预后中发挥作用。

结果如图4的A图和B图所示，在KDM1A高表达的食管鳞癌根治术患者中，患者术后发生复发/转移的5年总生存率显著较未发生复发/转移的患者5年总生存率低，分别为8％和75％(p＝0.0001)；而在KDM1A低表达的食管鳞癌根治术患者中，患者术后发生和未发生复发/转移的5年总生存率无显著统计学差异(p>0.05)。换个分析角度，在食管鳞癌患者术后发生复发/转移的人群中，KDM1A高表达患者的5年总生存率显著较KDM1A低表达患者的5年总生存率低，分别为8％和25％(p＝0.0195)，但是术后未发生复发/转移的食管鳞癌患者组织中KDM1A表达高的患者预后5年总生存率与 KDM1A低表达的患者预后5年总生存率无显著统计学差异(p>0.05)。

上述结果表明，KDM1A可以进一步细分术后发生复发/转移的食管鳞癌根治术患者的预后，并且提示KDM1A高表达的术后发生复发/转移的人群可能对KDM1A靶向小分子抑制剂治疗更佳敏感(图4的D)。目前进入临床研究的KDM1A靶向药主要有TCP、ORY-1001、GSK-2879552、IMG-7289、INCB059872、CC-90011、ORY-2001等，其中进入临床I/II期研究的INCB059872(NCT02959437)主要针对晚期的实体肿瘤。因此，我们的研究提示KDM1A有望成为该药治疗晚期复发/转移食管鳞癌患者的“伴随诊断”标记物。

随后进行总生存时间预后的单因素和多因素Cox回归分析，结果如图4 的C图所示，RAD51在术后食管癌组织中的表达是KDM1A和术后复发/转移状态细分食管鳞癌患者预后总生存率的独立预后危险因子(p＝0.008，危险因子为0.384，95％CI为0.189 to0.781)，表明高表达RAD51亚分组人群较低表达RAD51亚分组人群预后生存差的风险率减少约61.6％。

进一步进行此亚分组与临床特征的相关性分析，结果发现：如表5所示， AJCC8分级(p＝0.036)、术前COPD诊断(p＝0.008)以及淋巴结转移状态 (p＝0.028)在上述亚分组中的分布存在显著统计学差异。

表5 KDM1A和复发/转移状态细分食管鳞癌患者预后组与患者临床特征相关性分析

综上所述，本发明提出基于术后复发/转移状态联合KDM1A表达水平的检测，可以对食管鳞癌根治术患者的预后进行预测：当KDM1A表达水平高时，进一步结合术后复发/转移状态进行预后评估；当KDM1A表达水平低时，无法通过术后复发/转移的状态，对KDM1A低表达患者进行预后评估。本发明指出，KDM1A可以进一步细分术后发生复发/转移的食管鳞癌根治术患者的预后，并且提示KDM1A高表达的术后发生复发/转移的人群可能对KDM1A靶向小分子抑制剂治疗更佳敏感。本发明为评估食管鳞癌根治术后的生存时间提供了一条全新的途径，对于食管鳞癌的预后判断及个体化治疗具有重要意义。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。