MDSCs在再生障碍性贫血诊断和/或分型中的应用

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及MDSCs在再生障碍性贫血诊断和/或分型中的应用。

背景技术

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是指由化学、物理、生物因素或不明原因引起的骨髓造血功能衰竭，以骨髓造血细胞增生减低和外周血全血细胞减少为特征，骨髓无异常细胞浸润和网状纤维增多，临床表现以贫血、出血和感染为主。再生障碍性贫血可分为先天性再生障碍性贫血和获得性再生障碍性贫血两大类，其中绝大多数为获得性再生障碍性贫血。按外周血细胞计数和骨髓形态学，AA可分为非重型再生障碍性贫血(Non-severeaplastic anemia，NSAA)、重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia，SAA)和极重型再生障碍性贫血(Very severe aplastic anemia，VSAA)。SAA起病急、进展快速、病情重，主要有贫血、感染、出血症状。病初贫血常不明显，但随着病程发展，呈进行性进展，几乎均有出血倾向，可有严重的内脏出血和败血症。VSAA是属于SAA当中另一个比较严重的病变，发生AA的时候，如果是患者出现了外周血三系细胞减少，达到一定的程度，就可以诊断为SAA。如果中性分叶核粒细胞进一步的减少，低于0.2×10

目前AA的临床诊断标准主要包括外周血常规检查、多部位骨髓穿刺涂片分析、骨髓活检、体外造血祖细胞培养、流式细胞术分析计数CD34

髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是一种不成熟的髓系来源抑制性细胞，通过不同机制抑制T、B和NK细胞介导的免疫反应，包括活性氧和一氧化氮的产生增加、精氨酸酶-1以及前列腺素E2(PGE2)等的表达上调。最早报道MDSCs在肿瘤条件下积累，促进肿瘤细胞免疫“逃逸”。随着研究深入，MDSCs在脓毒症/感染、自身免疫疾病、肥胖、衰老、妊娠和移植等情况下发挥着有害或有益的双向调控作用。目前暂无MDSCs与AA之间的研究和报道。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供MDSCs在再生障碍性贫血诊断和/或分型中的应用。本发明首次发现，MDSCs在AA患者外周血中的含量显著下降，并且与疾病的严重程度显著相关，可作为AA的诊断和分型标志物，具有很好的特异性、灵敏度和准确性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

本发明提供了人MDSCs在制备检测再生障碍性贫血的试剂中的应用。

本发明所述人MDSCs的的流式细胞术分析标记为HLA-DR

本发明还提供了检测人MDSCs含量的试剂在制备辅助诊断再生障碍性贫血的试剂盒中的应用。

本发明还提供了人MDSCs在制备再生障碍性贫血分型的试剂中的应用。

本发明还提供了检测人MDSCs含量的试剂在制备再生障碍性贫血分型试剂盒中的应用。

在其中一些实施例中，所述分型为鉴别非重型再生障碍性贫血、重型再生障碍性贫血和极重型再生障碍性贫血。

本发明还提供了一种辅助诊断再生障碍性贫血和/或再生障碍性贫血分型试剂盒，所述试剂盒包含检测人MDSCs含量的试剂。

在其中一些实施例中，所述试剂为检测人MDSCs流式细胞术分析标记的抗体。

在其中一些实施例中，所述抗体包括修饰有不同荧光基团的以下抗体：人抗HLA-DR抗体、人抗CD11b抗体和人抗CD33抗体。

在其中一些实施例中，所述试剂盒的检测样本为人外周血。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括淋巴细胞分离液、红细胞裂解液和PBS缓冲液

本发明通过研究首次发现MDSCs可作为AA的诊断和分型诊断标志物：与健康志愿者相比，AA患者外周血中MDSCs的含量明显下降，提示MDSCs可作为AA的诊断标志物。进一步地，与NSAA和SAA患者相比，VSAA患者外周血中MDSCs的含量显著下降，提示MDSCs可作为AA的分型标志物。

进一步对MDSCs的诊断性能进行分析(ROC曲线分析)，结果表明，MDSCs在用于诊断AA时，AUC为0.8110，灵敏度为68.97％，特异性为92％；用于诊断NSAA时，AUC为0.7273；用于诊断SAA时，AUC为0.7368；用于诊断VSAA时，AUC为0.9825，灵敏度为100％，特异性为89.47％。MDSCs在用于鉴别NSAA与VSAA分型时，AUC为0.8939，灵敏度为83.33％，特异性为100％；在用于SAA与VSAA分型时，AUC为0.8611，灵敏度为83.33％，特异性为83.33％。

本发明提供了一种AA的诊断和分型诊断标志物MDSCs，可简单、高效地对AA进行诊断和分型，具有无创、快速和易于推广等优点。

附图说明

图1为健康志愿者、NSAA患者、SAA患者和VSAA患者外周血中MDSCs含量的流式细胞术检测结果图。

图2为MDSCs用于AA诊断和分型时的ROC曲线分析图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“和/或”是描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

实施例1

一、病例资料

患者纳入标准如下：

1、AA

(1)血常规检查：

全血细胞(包括网织红细胞)减少，淋巴细胞比例增高。至少符合以下三项中两项：HGB<100g/L；PLT<50×10

(2)骨髓穿刺：

多部位(不同平面)骨髓增生减低或重度减低；小粒空虚，非造血细胞(淋巴细胞、网状细胞、浆细胞、肥大细胞等)比例增高；巨核细胞明显减少或缺如；红系、粒系细胞均明显减少。

(3)骨髓活检(髂骨)：

全切片增生减低，造血组织减少，脂肪组织和(或)非造血细胞增多，网硬蛋白不增加，无异常细胞。

(4)除外检查：

除外全血细胞减少和骨髓增生减低的其他疾病。

2、NSAA

本实施例中，将中性粒计数＞0.5×10

3、SAA

符合AA的诊断标准外，0.2×10

4、VSAA

符合AA的诊断标准外，中性粒计数<0.2×10

在与患者签署知情同意书的前提下采血，于清晨空腹静脉EDTA抗凝收集患者外周血。本实施例共纳入11例NSAA患者，6例SAA患者，6例VSAA患者。同时收集健康人样本31例作为对照，本实施例研究方案已经获得申请人单位伦理委员会通过。纳入研究的患者临床资料如表1所示。

表1患者临床资料

二、实验方法

1、患者和健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)分离

(1)向收集到的外周血样本中加入血液3倍体积的PBS溶液，混合均匀，获得稀释后的血液样本；

(2)将与稀释后的血液样本等体积的淋巴细胞分离液加入离心管中，然后用吸管将稀释后的血液样本沿着离心管的管壁缓慢地加至淋巴细胞分离液的上层，于18℃下600g(升5，降0)条件下离心25min；

(3)离心后可看到白膜层，小心地将中间白膜层吸出放于干净的离心管中，加入10ml预冷的PBS溶液，混匀；室温2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(4)像细胞沉淀中加入3ml红细胞裂解液(ACK)，室温裂解5min后，加入10ml预冷的PBS进行终止裂解；然后室温2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(5)用PBS重悬细胞沉淀，计数备用。

2、流式细胞术染色

(1)每个样本取1million的PBMC单细胞悬液加入流式管中，然后加入5ml PBS混匀，2000rpm/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(2)取用于分析人MDSCs的流式抗体：人抗HLA-DR-BV421抗体和人抗CD11b-B510抗体、人抗CD33-PE抗体，按1:200的比例使用PBS缓冲液对抗体进行稀释得到抗体稀释液(上述3种抗体同时加入同一离心管中进行稀释，得到抗体稀释液)；

(3)分别取100μl抗体稀释液加入每个样本对应的流式管中，将流式管置于涡旋振荡器上振荡，充分混匀，然后于4℃冰箱避光染色30min；

(4)向流式管中加入4ml预冷的PBS缓冲液，然后于2000rpm/min离心5min，弃上清；加入300μl预冷PBS重悬细胞，然后使用流式分析仪(BD Canto II，USA)进行上机检测，获取数据，并用FlowJo10软件进行分析。

3、统计学分析

利用GraphPad 9.2.0计算各组数据中位数和计算P值，以P＜0.05视为差异具有统计学意义。

三、实验结果

流式检测结果如图1所示：与健康志愿者组相比，NSAA、SAA和VSAA组患者外周血中MDSCs的含量明显下降；与NSAA和SAA组患者相比，VSAA组患者外周血中MDSCs的含量显著下降。结果提示MDSCs可作为AA的诊断标志物，并且可以分型AA的类型。

为此，本发明进一步利用ROC曲线来分析MDSCs对AA的诊断和分型性能，结果表明，MDSCs在用于诊断AA时，AUC为0.8110，灵敏度为68.97％，特异性为92％；用于诊断NSAA时，AUC为0.7273；用于诊断SAA时，AUC为0.7368；用于诊断VSAA时，AUC为0.9825，灵敏度为100％，特异性为89.47％。MDSCs在用于鉴别NSAA与VSAA分型时，AUC为0.8939，灵敏度为83.33％，特异性为100％；在用于SAA与VSAA分型时，AUC为0.8611，灵敏度为83.33％，特异性为83.33％。

上述结果表明，MDSCs可作为AA的特异性诊断和分型标志物，是一个AA相关的高特异性免疫指标。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。