硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物，包含其的乙酰肝素酶响应性纳米粒，其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物，包含其的乙酰肝素酶响应性纳米粒，其制备方法及用途。

背景技术

乳腺癌位居女性癌症发病率首位，化疗仍是乳腺癌治疗的经典临床选择。然而，传统剂型的细胞毒性化疗药物对所有快速分裂的细胞均具有非选择性的毒性，导致全身用药治疗效率低和产生严重的毒副作用，极大地限制了化疗的临床应用。

骨化三醇(Calcitriol，CTL)是生物活性最强的维生素D代谢物，具有多种生物活性，例如通过与维生素D受体(VDR)结合抗肿瘤细胞增殖、促凋亡、促分化和抑制肿瘤转移等。CTL与化疗药物的联合使用可增强抗肿瘤效果，并能对抗紫杉烷类化疗药物引起的转移。然而在临床上，有效剂量的游离维生素D会引起高钙血症。

因此CTL需要合适的载体，促进其在肿瘤细胞中的积累并减少在正常组织中的分布。

发明内容

本发明将CTL与硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)共价偶联得到了一种硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物(HS-CTL)，其可以作为CTL的前药，促进CTL在肿瘤细胞中的积累并减少在正常组织中的分布。

研究表明，通过将HS与多西他赛(DTX)共价偶联得到的硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物(HS-DTX)对乳腺癌细胞具有较强毒性，而对非癌乳腺上皮细胞毒性很低，在荷瘤小鼠体内显著降低了DTX的毒副作用。

本发明经研究发现，HS-DTX和HS-CTL可以在水性介质中自组装成纳米粒。初步研究表明，所得纳米粒可以显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和划痕愈合，并显著抑制乳腺癌小鼠模型的肿瘤生长。

因此，本发明的一个目的是提供一种硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物。

本发明的另一个目的是提供上述硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物用于制备药物的用途。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物以及硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物。

本发明的再一个目的是提供包含上述硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物和硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物的乙酰肝素酶响应性纳米粒。

本发明的又一个目的是提供上述乙酰肝素酶响应性纳米粒的制备方法。

本发明的还一个目的是提供上述乙酰肝素酶响应性纳米粒用于制备药物的用途。

本发明的还一个目的是提供一种药物组合物，其包含上述乙酰肝素酶响应性纳米粒。

一个方面，本发明提供了一种硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物(HS-CTL)，其中，骨化三醇共价结合至硫酸乙酰肝素。

特别地，本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的重均分子量可以为5000至20000，优选为10000至20000，分子量分布为2至4，优选为2至3，其中分子量分布是通过用重均分子量除以数均分子量所得到的值。

特别地，本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物中，基于硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的总重，骨化三醇的含量为5wt％-15wt％，优选为8wt％-15wt％。

硫酸乙酰肝素(HS)是一种细胞外基质成分，可由所有细胞类型产生。它是可与核心蛋白共价连接形成蛋白多糖的糖胺聚糖。它的结构非常多样，因为它在合成过程中经历了大量的硫酸化和差向异构化过程，因此没有单一的HS结构。

本发明中，硫酸乙酰肝素可以为市售硫酸乙酰肝素或者由市售的硫酸乙酰肝素盐得到。例如，可以将市售的硫酸乙酰肝素钠经酸化(例如经阳离子树脂柱处理)得到硫酸乙酰肝素。

一般而言，硫酸乙酰肝素可以用下式I表示，但是不限于此；

这里的n为正整数，表示单体单元重复的数量，与聚合物的分子量相关。

骨化三醇可以用下式II表示：

在实施方式中，所述HS-CTL可以具有如下的结构：

其中，HS表示硫酸乙酰肝素，CTL表示骨化三醇，m为正整数，表示连接至硫酸乙酰肝素链上的骨化三醇的个数，其中m优选为2-5。在实施方式中，所述HS-CTL可以如下得到：将硫酸乙酰肝素与丁二酸酐经酯化反应得到侧链带有羧基的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素，然后骨化三醇可以通过其上的羟基中的任何一个与上述丁二酸酐化硫酸乙酰肝素的羧基发生酯化反应。

在本发明提出的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的基础上，本领域技术人员可以选择本领域中适合的有机反应将硫酸乙酰肝素与骨化三醇共价偶联而得到本发明硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物。因此，本发明硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法不限于在本文中公开的合成路线。

特别地，本发明提供了一种硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将硫酸乙酰肝素与丁二酸酐经酯化反应得到丁二酸酐化硫酸乙酰肝素，合成反应式如下：

(2)将丁二酸酐化硫酸乙酰肝素与骨化三醇经酯化反应得到硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物，合成反应式如下：

更特别地，本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法包括以下步骤：

步骤A：三丁胺化硫酸乙酰肝素的合成

将硫酸乙酰肝素水溶液用三丁胺调pH至6-7，干燥后即得三丁胺化硫酸乙酰肝素；

步骤B：丁二酸酐化硫酸乙酰肝素的合成

取步骤A中制得的三丁胺化硫酸乙酰肝素和丁二酸酐经酯化反应获得丁二酸酐化硫酸乙酰肝素；

步骤C：硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的合成

取步骤B中制得的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素和骨化三醇经酯化反应获得硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物。

优选地，步骤B可以在有机试剂中进行，所述有机溶剂可以为无水二甲基甲酰胺。优选地，步骤B可以在4-二甲氨基吡啶存在下进行。优选地，步骤B的反应时间可以为18～24小时。优选地，步骤B还可以包括纯化步骤。纯化可以采用透析方法，例如可以将反应溶液加入截留分子量为3500Da的透析袋，在水中透析24～36小时，每3～4小时更换一次水。

优选地，步骤C可以在有机试剂中进行，所述有机试剂可以为无水二甲基甲酰胺。优选地，步骤C可以在4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺存在下进行。优选地，步骤C的反应时间可以为18～24小时。优选地，步骤C可以包括纯化步骤。优选地，纯化可以采用透析方法，例如可以将反应溶液加入截留分子量为3500Da的透析袋，在水中透析36～48小时，每3～4小时更换一次水。

另一方面，本发明提供根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物或根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法制备得到的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物用于制备药物的用途。在一个实施方式中，所述药物可以用于治疗癌症，例如乳腺癌。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物或根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法制备得到的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物。

研究表明，HS与多西他赛(DTX)的硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物(HS-DTX)对乳腺癌细胞具有较强毒性，而对非癌乳腺上皮细胞毒性很低，在荷瘤小鼠体内显著降低了DTX的毒副作用。本发明将HS-DTX和HS-CTL联用以改善DTX与CTL的联用效果。

因此，另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物或根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法制备得到的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物以及硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物。

本发明中，所述硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物是指通过与丁二酸酐反应，HS具有的部分羟基转化为羧基，随后与DTX的2-位羟基反应形成酯键连接。

硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物可以参考现有技术文献(例如，Lang T,Ran W,Dong X,Zheng Z,Liu Y,Yin Q,Li Y.Tumor cells-selective bionic nanodeviceexploiting heparanase combats metastatic breast cancer.Adv Funct Mater 2018；28:1707289.)中记载的方法制备。

或者硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物可以参考如上所述的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法制备。

特别地，硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物可以如下制备：

步骤A：三丁胺化硫酸乙酰肝素的合成

将硫酸乙酰肝素水溶液用三丁胺调pH至6-7，干燥后即得三丁胺化硫酸乙酰肝素；

步骤B：丁二酸酐化硫酸乙酰肝素的合成

取步骤A中制得的三丁胺化硫酸乙酰肝素和丁二酸酐经酯化反应获得丁二酸酐化硫酸乙酰肝素；

步骤C’：取步骤B中制得的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素和多西他赛经酯化反应获得硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物。

优选地，步骤B可以在有机试剂中进行，所述有机溶剂可以为无水二甲基甲酰胺。优选地，步骤B可以在4-二甲氨基吡啶存在下进行。优选地，步骤B的反应时间可以为18～24小时。优选地，步骤B还可以包括纯化步骤。纯化可以采用透析方法，例如可以将反应溶液加入截留分子量为3500Da的透析袋，在水中透析24～36小时，每3～4小时更换一次水。

优选地，步骤C’可以在有机试剂中进行，所述有机试剂可以为无水二甲基甲酰胺。优选地，步骤C’可以在4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺存在下进行。优选地，步骤C’的反应时间可以为18～24小时。优选地，步骤C’可以包括纯化步骤。纯化可以采用透析方法，例如可以将反应溶液加入截留分子量为3500Da的透析袋，在水中透析36～48小时，每3～4小时更换一次水。

进一步的研究发现，本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物和硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物可以在水性介质中自组装成纳米粒。在给药后，在肿瘤中，HS被Hpa降解，游离的DTX和CTL被释放，协同杀死肿瘤细胞和抑制转移，改善乳腺癌的治疗效果。

因此，另一方面，本发明提供了一种乙酰肝素酶响应性纳米粒，其特征在于，所述纳米粒由根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物(HS-CTL)或根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法制备得到的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物在溶剂(例如水)中与硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物(HS-DTX)自组装成混合胶束而形成。

特别地，所述乙酰肝素酶响应性纳米粒的平均粒径可以为200nm至400nm，优选为200nm至300nm，粒径分布可以为0.1至0.5，优选为0.1至0.3。

又一方面，本发明提供了上述乙酰肝素酶响应性纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

取根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物或根据本发明的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物的制备方法制备得到的硫酸乙酰肝素-骨化三醇偶联物和硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物，溶解在溶剂(例如，去离子水)中，将溶液过滤，即得乙酰肝素酶响应性纳米粒HDC。

优选地，上述制备方法中，所述过滤方法为将溶液经0.22微米的水系针头滤器过滤2次。

还一个方面，本发明提供了所述乙酰肝素酶响应性纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的用途，特别是用于治疗乳腺癌的药物。

又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述乙酰肝素酶响应性纳米粒。所述药物组合物可以用于治疗乳腺癌。

附图说明

图1为实施例2中骨化三醇的核磁共振氢谱图。

图2为实施例2合成的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素的核磁共振氢谱图。

图3为实施例2合成的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素的凝胶排阻色谱图。

图4为实施例3合成的HS-CTL的核磁共振氢谱图。

图5为实施例3合成的HS-CTL的凝胶排阻色谱图。

图6为实施例4合成的HS-DTX的核磁共振氢谱图。

图7为实施例4合成的HS-DTX的凝胶排阻色谱图。

图8为实施例6中HDC纳米粒的粒径分布图。

图9为实施例6中HDC纳米粒的透射电镜图。

图10为实施例7中HDC纳米粒对肿瘤细胞的增殖抑制作用图。

图11为实施例8中HDC纳米粒对肿瘤细胞的迁移抑制作用图(***p<0.001)。

图12为实施例9中HDC纳米粒对肿瘤细胞的侵袭抑制作用图(***p<0.001)。

图13为实施例10中HDC纳米粒对肿瘤细胞的划痕愈合抑制作用图(***p<0.001)。

图14为实施例11中4T1肿瘤组织照片。

图15为实施例11中4T1肿瘤体积变化曲线。

图16为实施例11中4T1肿瘤抑制率(**p<0.01)。

图17为实施例11中小鼠体重变化曲线。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例限定。

试剂和仪器：硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)购自南京罗迈美生物科技有限公司；多西他赛(Docetaxel,DTX)、再生纤维素透析袋(MWCO 3.5kDa)、PBS缓冲液(pH 7.4)、Tris-HCl溶液(pH 7.4)、氨苄青霉素、硫酸链霉素双抗溶液购自大连美仑生物科技有限公司；丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶、无水二甲基甲酰胺、二环己基碳二亚胺购自上海百灵威科技有限公司；乙酰肝素酶(Hpa)购自美国Thermo Fisher公司；0.2％醋酸铀染液、电镜用碳支持膜购自北京中镜科仪有限公司；RMPI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％Trypsin-EDTA、台盼蓝染液购自美国Life Technology公司；骨化三醇购自南京罗迈美生物科技有限公司；其它试剂如无特别说明外均购自国药集团化学试剂有限公司，各溶剂均为分析纯，未经处理直接用于实验。

磁力加热搅拌器(MS-H-PRO，国药集团，中国上海)；旋转蒸发仪(R-300,Buchi,Switzerland)；电子天平(Quintix 224-1,Sartorius,Germany)；核磁共振谱仪(500MHz,Bruker,USA)；高效液相色谱仪(e2695,Waters,USA)；紫外分光光度计(MULTISKAN GO,Thermo Fisher,USA)；冷冻干燥机(LABCONCO,USA)；纯水仪(MILL I-Q,Millipore,USA)；透射电镜(TEM,Tecnai F20,FEI,USA)；台式离心机(Centrifuge 5702,Eppendorf,Germany)；水套式CO

小鼠乳腺癌细胞株4T1购自中国科学院上海细胞库。

SPF级Balb/c小鼠(18-22g，雌性)购自中国科学院上海实验动物中心。在25℃、12h明-暗交替的环境下饲养，动物自由饮食。所有动物实验操作均严格遵循中国科学院上海药物研究所的实验动物管理和使用委员会(IACUC)的相关要求。

实施例1.三丁胺化硫酸乙酰肝素的合成

将732阳离子交换树脂注入层析柱中压平。依次加入450mL 1M HCl溶液、450mL 1MNaOH溶液、200mL水、300mL 1M HCl溶液和170mL水，用pH试纸测得流出液pH＝6。称取硫酸乙酰肝素(钠盐形式)1g，加入100mL水溶解，加入层析柱中，收集流出液于250mL烧瓶中，加入2mL三丁胺，测其pH值为6-7，旋转蒸发后即得三丁胺化硫酸乙酰肝素。

实施例2.丁二酸酐化硫酸乙酰肝素的合成

取1g实施例1中制得的三丁胺化硫酸乙酰肝素，加入12mL无水二甲基甲酰胺超声溶解，转移至50mL烧瓶中。称取4-二甲氨基吡啶1.38mg，丁二酸酐11.16mg，各加入1mL无水二甲基甲酰胺溶解，先将4-二甲氨基吡啶溶液加入烧瓶中，再滴加丁二酸酐溶液至烧瓶中，室温搅拌24h。反应结束后，将反应液转移至3500Da透析袋中，纯水中透析24h。透析结束后，冻干得到产物丁二酸酐化硫酸乙酰肝素。骨化三醇和所得产物采用核磁共振氢谱表征，结果如图1、2所示。所得产物利用凝胶排阻色谱法测定分子量及其分布，结果如图3和下表所示，丁二酸酐化硫酸乙酰肝素重均分子量为11796，分子量分布(PDI)为1.77。

实施例3.HS-CTL的合成

取1g实施例2中制得的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素，加入15mL无水二甲基甲酰胺溶解，转移至50mL烧瓶中。称取二环己基碳二亚胺71.69mg，4-二甲氨基吡啶8.38mg，CTL100mg，分别用700μL无水二甲基甲酰胺溶解。在400rpm搅拌下，先加入4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺溶液，搅拌1min后，再逐滴滴加CTL于烧瓶中，室温搅拌24h。反应结束后，将反应液转移至3500Da透析袋中，纯水中透析48h。透析结束后，冻干48h，得到产物HS-CTL。所得产物采用核磁共振氢谱表征，结果如图4所示，核磁谱图中显示出HS-CTL包含HS及CTL两部分的特征峰，其中属于CTL的特征峰为：ppm 6.00及6.20；属于HS的特征峰为：ppm 3.60-4.0、4.10-4.80及4.80-5.40，表明CTL与HS连接成功。所得产物利用凝胶排阻色谱法测定分子量及其分布，结果如图5和下表所示，HS-CTL重均分子量为12993，分子量分布(PDI)为2.35，进而计算得出HS-CTL中CTL含量为9.21％。

实施例4.HS-DTX的合成

取1g实施例2中制得的丁二酸酐化硫酸乙酰肝素，加入15mL无水二甲基甲酰胺溶解，转移至50mL烧瓶中。称取二环己基碳二亚胺71.69mg，4-二甲氨基吡啶8.38mg，DTX163.9mg，分别用700μL无水二甲基甲酰胺溶解。在400rpm搅拌下，先加入4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺溶液，搅拌1min后，再逐滴滴加DTX于烧瓶中，室温搅拌24h。反应结束后，将反应液转移至3500Da透析袋中，纯水中透析48h。透析结束后，冻干48h，得到产物HS-DTX。所得产物采用核磁共振氢谱表征，结果如图6所示。所得产物利用凝胶排阻色谱法测定分子量及其分布，结果如图7和下表所示，HS-DTX重均分子量为13426，分子量分布(PDI)为1.94，进而计算得出HS-DTX中DTX含量为12.14％。

实施例5.纳米粒的制备

称取实施例4中制得的HS-DTX 20mg加入5mL水，超声溶解后用注射器吸取，过2次0.22μm聚醚砜滤膜，即得HS-DTX纳米粒。

称取实施例3中制得的HS-CTL 2.5mg和称取实施例4中制得的HS-DTX 20mg加入5mL水，超声溶解后用注射器吸取，过2次0.22μm聚醚砜滤膜，即得HDC纳米粒。

实施例6.HDC纳米粒的粒径及形态

取实施例5中制得的HDC纳米粒利用光散射粒度仪检测纳米粒的平均粒径和表面电位，结果如图8所示，HDC纳米粒平均粒径为254.57±8.18nm，粒径分布(PDI)为0.271，表面电位为-18.53±1.5mV。

取实施例5中制得的HDC纳米粒7μL滴加到透射电镜专用碳支持膜上，90s后用滤纸吸干。滴加7μL醋酸铀染液到碳支撑膜上，90s后用滤纸吸干染液。碳支撑膜晾干30min后，透射电镜拍摄，结果如图9所示，HDC纳米粒为粒径规整的球形纳米粒，形态圆整均一。

实施例7.HDC纳米粒的细胞毒性

4T1细胞消化计数后，调整细胞密度为5×10

将实施例5中制得的HDC纳米粒稀释后加入96孔板中，使DTX终浓度为18.62μg/mL、3.72μg/mL、1.862μg/mL、0.372μg/mL、0.1862μg/mL，CTL终浓度为1.35μg/mL、0.27μg/mL、0.135μg/mL、0.027μg/mL、0.0135μg/mL，同时设置生理盐水组，加药后将96孔板放回培养箱继续培养24h。

24h后将96孔板取出，弃去96孔板中培养基，每孔加入100μL CCK8工作液，放入培养箱中孵育1-4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

根据以下公式计算细胞存活率(Cell Viability)：

As：待测组孔吸光度Ac：不加药对照组孔吸光度Ab：空白溶剂孔吸光度

细胞存活率如图10所示，HDC纳米粒显著抑制4T1细胞增殖，并且抑制能力随着HDC纳米粒浓度的增加而增强。

实施例8.HDC纳米粒抑制细胞迁移

4T1细胞消化计数后，用不完全培养基调整细胞密度为7.5×10

细胞培养4h后，每组细胞中加入制剂分别为生理盐水、游离DTX+CTL、HS-DTX和HDC，使DTX终浓度为0.28μg/mL，CTL终浓度为0.02μg/mL，加药后将24孔板放回培养箱继续培养24h。

24h后将24孔板取出，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)将小室清洗1次，用棉签擦去小室上层的细胞，用95％乙醇固定小室20min。乙醇固定后，用PBS将小室清洗1次，在小室加入结晶紫染液，染色50min。结晶紫染色后，用PBS将小室清洗多次，用滤纸吸干多余的水分，显微镜下对小室进行拍照。

结果如图11所示，HDC纳米粒与HS-DTX纳米粒相比可以显著抑制细胞迁移，细胞迁移率为15.99％，效果与游离药组相当。

实施例9.HDC纳米粒抑制细胞侵袭

将24孔板适配的Transwell小室放入24孔板中，取Matrigel基质胶120μL稀释20倍，在每个小室中加入100μL稀释后的基质胶，24孔板放入培养箱中固定24h，以促进基质胶凝固。固定24h后取出24孔板，小心将基质胶上方的液体弃去。4T1细胞消化计数后，用不完全培养基调整细胞密度为10

细胞培养4h后，每组细胞中加入制剂分别为Saline、游离DTX+CTL、HS-DTX和HDC，使DTX终浓度为0.28μg/mL，CTL终浓度为0.02μg/mL，加药后将24孔板放回培养箱继续培养24h。

24h后将24孔板取出，弃去培养基，用PBS将小室清洗1次，用棉签擦去小室上层的细胞，用95％乙醇固定小室20min。乙醇固定后，用PBS将小室清洗1次，在小室中加入结晶紫染液，染色50min。结晶紫染色后，用PBS将小室清洗多次，用滤纸吸干多余的水分，显微镜下对小室进行拍照。

结果如图12所示，HDC纳米粒与HS-DTX纳米粒相比可以显著抑制细胞侵袭，细胞侵袭率为10.02％，效果与游离药组相当。

实施例10.HDC纳米粒抑制细胞划痕愈合

4T1细胞消化计数后，调整细胞密度为2×10

结果如图13所示，HDC纳米粒与HS-DTX纳米粒相比可以显著抑制细胞划痕愈合，细胞划痕愈合比例为8.84％，效果与游离药组相当。

实施例11.HDC纳米粒抑制乳腺癌生长

4T1细胞消化计数后，调整细胞密度为10

根据以下公式计算肿瘤体积：

在第1次给药后的第21天，CO

各组制剂抑制肿瘤生长情况如图14、15、16所示，游离DTX和游离CTL抑制肿瘤生长效果差，其TIR分别为11.19％和15.85％；游离DTX+CTL在一定程度上可以抑制肿瘤生长，其TIR为30.89％；与游离药组相比HS-DTX纳米粒抗肿瘤生长效果略有提升，其TIR为41.64％；HDC纳米粒显示出良好的抗肿瘤增殖能力，其TIR为67.8％。

体重可以反应小鼠健康情况，给药后小鼠体重变化情况如图17所示，游离CTL、游离DTX+CTL和游离DTX组小鼠体重显著下降。而HS-DTX和HDC制剂在多次给药后小鼠体重无明显下降，并且小鼠状态良好，初步证明HS-DTX和HDC制剂没有对小鼠造成显著毒性。