假结核耶尔森氏菌效应蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物化学、分子生物学和基因工程等技术领域，涉及两种假结核耶尔森氏菌效应蛋白治疗肠道耐药致病细菌感染的应用，具体地说，涉及来源于假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis，yptb)的效应蛋白Tce1和Tce2通过pWB980载体(一种枯草芽孢杆菌表达载体)在枯草芽孢杆菌中异源表达，产生的治疗肠道耐药致病细菌感染效果在相关药物制备过程中的应用。

背景技术

20世纪40年代，青霉素作为第一种应用于临床的抗生素，成功解决了临床上金黄色葡萄球菌感染这一难题。此后随着人们对抗生素类药物的探索研究和开发制备不断深入，新的抗生素类药物不断进入市场并在临床上得到广泛应用。然而，正当人们为感染性疾病得到控制而欢欣鼓舞时，细菌的耐药性却带来了现实的和潜在的危机，对人类健康提出了又一次严峻的挑战。1961年，英国首次报道了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，时至今日越来越多的细菌出现耐药性，其耐药水平也越来越高。由多重耐药菌造成的医院感染不但难以治疗，而且因为其传播途径广泛，容易造成院内暴发流行，导致巨大的经济损失。

细菌耐药性的产生是细菌基因突变积累的结果。抗生素类药物的压力起到筛选耐药优势菌的作用，是细菌耐药性产生的源动力。一种抗生素类药物的使用可造成对其他药物耐药性的共选择，一种细菌可通过多种机制对多种抗生素类药物产生耐药性。毫无疑问，细菌耐药性问题已经成为当前科研的主要热点课题。细菌耐药性问题的解决途径主要有3个：限制抗生素的滥用，制备新型抗生素和制备疫苗来对付细菌感染性疾病。但是至今还没有足够的疫苗问世，抗生素的限制也存在一定的现实困难，因此，开发具有新化学结构、新作用机制、新作用靶标的药物是克服细菌耐药性的有效途径。目前已有报道从细菌中分离纯化出的具有核酸酶、几丁质酶等活性的蛋白质具有潜在的类抗生素的抗致病菌功能，但是还未见报道有来源于假结核耶尔森氏菌的抗耐药致病菌蛋白及其编码基因在辅助治疗肠道致病菌感染等方面的应用。

沙门氏菌(salmonella)是一种常见的食源性致病菌，且感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便能污染食品，使人发生食物中毒。据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。国内肉类沙门氏菌的检出率在1.1％-39.5％，蛋及其制品沙门氏菌的检出率为3.9％-43.7％，所引起的鼠伤寒病的病例报告有逐年增加的趋势。沙门氏菌感染的典型症状包括发热、恶心、呕吐、腹泻及腹部绞痛等症状，婴儿、老年人、免疫功能低下的患者则可能因沙门氏菌进入血液而出现严重且危及生命的菌血症，少数还会并发脑膜炎或骨髓炎。由沙门氏菌引起的食品中毒平均致死率为4.1％。作为世界卫生组织公布的十二种最危险的细菌之一，由于抗生素的滥用，“超级细菌”沙门氏菌已对大多数常用抗生素具有耐药性，虽然我们暂时有新抗生素可以用于治疗，但这无疑是一种潜在的巨大风险。

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染等疾病，对抗生素及磺胺类药物等极易产生耐药性。引起肠道感染的某些大肠杆菌菌群可以通过污染的手指或食物等经口摄入而致病，主要引起腹泻，重者可导致脱水和血压下降，如流行性婴儿腹泻、旅游者腹泻等。大肠杆菌病急性病例一般1～2天死亡，亚急性1周左右死亡。动物的大肠杆菌病可以发生在多种家畜、家禽、养殖经济动物以及其他陆生动物和某些水产动物，其中猪和鸡最为易感，且危害十分严重。目前对于大肠杆菌的治疗可分为两种方式，首先可以口服抗生素类药物，比如青霉素、头孢、氧氟沙星等；其次及时恢复肠道菌群平衡也很重要，所以可适当服用一些具有调节肠胃功能的益生菌类药物，比如思连康、乳酸菌素片等。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，其生长速度快，对营养要求较低，能够高效分泌许多蛋白质及代谢产物，且不会产生毒素，是一种无致病性的安全微生物，在医药卫生食品等方面用途广泛。枯草芽孢杆菌是动物饲料中常添加的益生菌种，它以芽孢的形式添加于动物饲料中，在进入动物肠道后能够迅速复苏和繁殖，发挥其益生特性，包括改善动物肠道菌群、增强动物机体免疫力以及提供多种动物所需的酶类等，具有显著的益生作用。

发明内容

本发明的目的在于提供两种假结核耶尔森氏菌效应蛋白及制备治疗肠道耐药致病细菌感染药物的应用。

假结核耶尔森氏菌效应蛋白，包括：

Tce1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或某一个位点氨基酸的突变；

和/或Tce2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或某一个位点氨基酸的突变。

可选的，在Tce1中，除氨基酸序列中第8位的S不能突变为A，且第16位的A不能突变为E外，其他位点的氨基酸可以替换为其他氨基酸。

可选的，在Tce2中，除氨基酸序列中第17位的E不能突变为A外，其他位点的氨基酸可以替换为其他氨基酸。

可选的，该效应蛋白是由假结核耶尔森氏菌通过Ⅵ型分泌系统T6SS分泌的，属于DNA水解酶类毒素蛋白，可以通过靶细胞外膜上的特异受体蛋白进入靶细胞，以非接触依赖的方式发挥毒性作用。

本发明任一所述的假结核耶尔森氏菌效应蛋白用于制备治疗肠道耐药致病细菌感染药物的应用。

可选的，所述的肠道耐药致病细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌和/或克雷伯氏菌。

一种枯草芽孢杆菌表达载体，枯草芽孢杆菌载体为pWB980，用于表达本发明任一所述的假结核耶尔森氏菌效应蛋白。

可选的，其上插入SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

或者SEQ ID NO:4所示所示的核苷酸序列。

所述的枯草芽孢杆菌表达载体用于制备治疗肠道耐药致病细菌感染药物的应用。

可选的，所述的肠道耐药致病细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌和/或克雷伯氏菌。

本发明的优点：

Tce1、Tce2效应蛋白具有更安全、更广谱的杀菌活性，能够有效对肠道耐药致病细菌产生杀菌效果，且避免了抗生素滥用的结果。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是tce1基因和tce2基因PCR扩增结果；

图2是pET28a载体和pWB980载体双酶切结果；

图3是pET28a-tce1、pET28a-tce2和pWB980-tce1、pWB980-tce2重组载体菌落PCR鉴定结果；

图4是His

图5是Tce1蛋白和Tce2蛋白的体外DNA酶活验证结果；

图6是Tce1蛋白和Tce2蛋白的进入细菌验证结果；

图7是携带pWB980-tce1重组载体和pWB980-tce2重组载体的枯草芽孢杆菌BS168在小鼠体内的作用结果；

图8是pWB980-tce1重组载体的基因谱图；

图9是pWB980-tce2重组载体的基因谱图。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明的技术方案做具体说明。

大肠杆菌是常见的致病菌，大肠杆菌感染后会引起多个系统的疾病。最常见的是引起消化系统疾病，如急性胃肠炎、慢性肠炎等疾病，大肠杆菌感染肠道后常出现发热、恶心、呕吐、胃区不适、腹痛、腹胀、腹泻等肠功能紊乱、消化不良。另外，大肠杆菌会引起泌尿系统的感染，如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎等疾病，还会引起胆囊炎、阑尾炎、腹膜炎等疾病。女性感染大肠杆菌会引起妇科方面的炎症，如盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎等。另外，小儿或体质较差的老年人，以及皮肤外伤的创面，如果受到大肠杆菌感染，可能引起菌血症、败血症等非常严重的疾病。

沙门氏菌(Salmonella enteriditis)广泛存在于自然界中，是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科的一种，可以引起家禽家畜及人类的感染。常见的可以引起食物中毒、伤寒、副伤寒、败血症，沙门氏菌感染如果得不到有效治疗可出现败血症，患者表现为高烧，寒战，头痛，恶心等。

Tce1和Tce2是假结核耶尔森氏菌通过Ⅵ型分泌系统(T6SS)分泌的两种效应蛋白，具有DNA酶活，可以通过靶细胞外膜上的特异受体蛋白进入靶细胞，以非接触依赖的方式发挥毒性作用。故本发明构建了两种枯草芽孢杆菌重组表达载体，通过枯草芽孢杆菌这一益生菌在动物肠道内表达并分泌Tce1和Tce2，对肠道内的耐药致病细菌产生毒性作用，从而达到治疗肠道耐药致病细菌感染的效果。本发明所涉及的作用菌株可用于辅助治疗肠道耐药致病细菌感染等方面。

其具体技术方案为：

两种假结核耶尔森氏菌效应蛋白，Tce1是由

“MSGELDRSSASEWAFAIIDDDHIRVSDQVVWKVLQCLGGADLPITDREYLYEKEDFNCWLNEIDSHE”的氨基酸序列组成的蛋白质；

Tce2是由

“MKPLDQNITYGQARGYEQFYIDEFGTKTGVRGDDISPMNRGNKINSYDSNSTTRDPIRQQYFDDAYDSKKSGTSSKGGGGC”的氨基酸序列组成的蛋白质。

在Tce1中，其氨基酸序列中第8位的S(丝氨酸)突变为A(丙氨酸)并且同时第16位的A(丙氨酸)突变为E(谷氨酸)，会影响Tce1的DNA水解酶功能及其治疗肠道耐药致病细菌感染的应用；在Tce2中，其氨基酸序列中第17位的E(谷氨酸)突变为A(丙氨酸)，会影响Tce2的DNA水解酶功能及其治疗肠道耐药致病细菌感染的应用。对所示氨基酸序列通过替换、缺失或插入一个或几个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质皆属于本发明(实验验证见体外DNA酶活验证实验及图5)。

两种假结核耶尔森氏菌效应蛋白治疗肠道耐药致病细菌感染的应用，这两种效应蛋白是由假结核耶尔森氏菌通过Ⅵ型分泌系统(T6SS)分泌的，属于DNA水解酶类毒素蛋白，可以通过靶细胞外膜上的特异受体蛋白进入靶细胞，以非接触依赖的方式发挥毒性作用。

本发明通过基因工程的手段，将两种效应蛋白在枯草芽孢杆菌中表达，所用载体为pWB980(一种枯草芽孢杆菌表达载体)，外源基因的核苷酸序列为

“

“

对所示核苷酸序列通过替换、缺失或插入一个或几个核苷酸所获得的核苷酸序列皆属于本发明的内容。

本发明所述的两种假结核耶尔森氏菌效应蛋白在辅助治疗肠道耐药致病细菌感染药物制备过程中的应用。

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

基因扩增：通过设计上游和下游引物从野生型假结核耶尔森氏菌基因组DNA中PCR扩增效应蛋白Tce1和Tce2的基因tce1和tce2，引物序列如下：

正向引物tce1-F-BamHⅠ：

反向引物tce1-R-SalⅠ：

正向引物tce2-F-BamHⅠ：

反向引物tce2-R-SalⅠ：

PCR反应总体系参照表1：

表1 PCR反应总体系

按照如下程序进行PCR反应：

PCR反应结束之后，对所得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％浓度的琼脂糖凝胶，加入loading buffer后点样进行电泳，电泳结束后将凝胶取出，核酸染料染色后，使用凝胶成像分析系统拍照保存，结果见说明书附图1，第一泳道为DNA Marker(M)，二、三泳道为扩增的tce1基因片段(tce1)，四、五泳道为扩增的tce2基因片段(tce2)，二者的条带大小均正确，说明成功获得tce1和tce2基因片段。

然后参考DNA胶回收试剂盒的说明书操作，具体如下：

(1)在胶块上切下单一的目的DNA条带(尽可能去除掉无关部分)，简单将其切碎后装入2mL离心管；

(2)向离心管内加入等倍体积的PC溶液，混合均匀后将离心管置于55℃水浴10min，期间随时轻柔上下颠倒离心管，最终使凝胶完全溶解；

(3)往套有收集管的吸附柱CB2内加入500μL的BL平衡液，12000rpm离心1min之后，倒去收集管内的平衡液；

(4)把完全融化了的凝胶溶液转至吸附柱内，置于冰上冰浴2min，12000rpm离心1min后，再把收集管内的溶液倒回吸附柱，置于冰上冰浴2min，12000rpm离心1min后，倒去收集管内的废液；

(5)往吸附柱内加入600μL的PW漂洗液，12000rpm离心1min后，倒去收集管中的漂洗液；

(6)重复一次上步操作后，12000rpm离心2min，扔掉收集管，把吸附柱置于通风处室温晾干，直至吸附柱闻不到酒精味；

(7)使用移液器往吸附膜的中间位置温和滴入40μL预热好的ddH

胶回收后的基因片段分别与pET28a和pWB980载体进行双酶切，根据设计引物时选择的相同酶切位点，使用对应的限制性内切酶和buffer，放在37℃的培养箱内进行双酶切，双酶切反应体系参照表2。

表2双酶切反应体系

双酶切反应结束之后，基因片段直接加入PC溶液进行回收，载体则应经过琼脂糖凝胶电泳检测再进行切胶回收，结果见说明书附图2，a图第一泳道为DNA Marker(M)，二、三泳道为经双酶切的pET28a载体(pET28a)；b图第一泳道为DNA Marker(M)，二、三泳道为经双酶切的pWB980载体(pWB980)，二者的条带大小均正确，说明成功获得经双酶切的pET28a和pWB980载体。

双酶切回收后的基因片段与载体连接，连接反应体系参照表3。

表3连接反应体系

配制完成之后混合均匀，放在连接仪内16℃下过夜连接。

连接产物转化大肠杆菌TG1，具体如下：

(1)从新鲜的大肠杆菌TG1培养皿上选取生长良好的TG1单克隆，接种于3mL的LB液体培养基内，于37℃、220rpm下振荡培养，直至生长稳定期；

(2)将菌液按照1％的浓度转接到300mL的LB液体培养基内，于37℃、220rpm下振荡培养，直到OD

(3)把锥形瓶放在冰上冰浴30min，使用100mL灭菌离心管进行收菌，于4℃下4000rpm离心8min后，弃掉离心管内的上清液；

(4)向每个离心管内加入7.5mL的TFBⅠ溶液，置于冰上反复吹打重悬菌体，然后置于冰上冰浴90min；

(5)于4℃下4000rpm离心5min后，倒去离心管中的上清液；

(6)往离心管内加入20mL的TFBⅡ溶液，放在冰上轻柔吹吸重悬菌体，然后将离心管放在冰上冰浴15min；

(7)按照每管100μL将菌液分装至1.5mL灭菌离心管内，即为制备好的大肠杆菌TG1感受态，置于-80℃存放；

(8)拿一管大肠杆菌TG1感受态放在冰上，等待其解冻后，向TG1感受态内加入全部连接产物并混合均匀，将离心管置于冰上放置30min；

(9)将离心管置于42℃水浴90s，然后迅速放在冰上冰浴3min；

(10)向离心管中加入1mL的LB液体培养基，于37℃、220rpm下摇晃复苏1h；

(11)复苏良好后，4500rpm离心3min，倒去离心管内大部分上清液，剩下100μL左右重悬菌体，涂布Km抗性的LB固体平板，放在37℃培养箱内培养。

进行菌落PCR验证，具体如下：

(1)随机挑选10个单菌落，编号1-10；

(2)按照表4中的体系加样进行菌落PCR，同时设置阳性对照；

表4菌落PCR反应总体系

(3)参考前文设置PCR程序；

(4)PCR程序结束后，用1％的琼脂糖凝胶、120V的电压对所得产物进行电泳检测，结果见说明书附图3，a图第一泳道为DNA Marker(M)，2-8泳道为tce1连接产物转化大肠杆菌TG1所得的7个单菌落(tce1)，第九泳道为阳性对照(+)；b图第一泳道为DNA Marker(M)，2-7泳道为tce2连接产物转化大肠杆菌TG1所得的6个单菌落(tce2)，第八泳道为阳性对照(+)，二者的条带大小均正确且与阳性对照一致，说明pET28a-tce1和pET28a-tce2基本构建成功；

(5)挑选其中验证正确的单菌落，接种于加入Km抗生素的5mL液体LB培养基中，在37℃下培养过夜；

(6)参照天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒的说明书提取质粒：把试管内的菌液转到2mL离心管内进行收菌，12000rpm离心1min后，尽量弃去离心管内的上清；

(7)往剩下菌体沉淀的离心管内加入250μL P1溶液，通过涡旋仪充分重悬菌体沉淀；

(8)往离心管内加入250μL P2溶液，来回颠倒离心管，温和混合均匀，使菌体彻底裂解；

(9)向离心管中加入350μL P3溶液，迅速上下翻转离心管，温和混合均匀，12000rpm离心10min；

(10)往套有收集管的吸附柱CP3内加入500μL的BL平衡液，12000rpm离心1min后，倒去收集管内的平衡液；

(11)把离心管内上清转至吸附柱中(尽量不要吸出沉淀)，置于冰上冰浴2min，12000rpm离心1min后，再把收集管内的溶液倒入吸附柱，置于冰上冰浴2min，12000rpm离心1min后，倒去收集管中的废液；

(12)向吸附柱内加入500μL的PD去蛋白液，12000rpm离心1min，倒去收集管内的去蛋白液；

(13)往吸附柱内加入600μL的PW漂洗液，12000rpm离心1min后，倒去收集管内的漂洗液；

(14)重复一次上步操作后，12000rpm离心2min，扔掉收集管，把吸附柱置于通风处室温晾干，直至吸附柱闻不到酒精味；

(15)使用移液器往吸附膜的中间位置温和滴入50μL预热好的ddH

(16)取部分所提的质粒送给公司进行测序，将测序所得结果在NCBI上进行比对，结果一致，说明pET28a-tce1和pET28a-tce2构建成功。

蛋白纯化：将正确的质粒转化大肠杆菌BL21，方法参考前文，进行蛋白纯化，具体如下：

(1)将正确的pET28a-tce1和pET28a-tce2分别接种在6mL的Km抗性LB液体培养基内，于37℃、220rpm下振荡培养，直至生长稳定期；

(2)将菌液以1％的浓度转接至600mL的Km抗性LB液体培养基中，于37℃、220rpm下振荡培养，直至OD

(3)8000rpm离心3min后，倒去离心瓶中的上清液；

(4)将菌体转至100mL的灭菌离心管中，使用ddH

(5)按照10g/mL向离心管中加入1×PBS Binding buffer重悬菌体，按照要求先后使用低温高压细胞破碎仪和超声细胞破碎仪破碎菌体，配平离心后，收集上清；

(6)将柱材灌装填充在层析柱内做成亲和柱，进行洗柱平衡后，向亲和柱中加入蛋白上清，亲和2～3次；

(7)向亲和柱中加入1×PBS Washing buffer漂洗掉杂蛋白，使用考马斯亮蓝检测漂洗液中的杂蛋白，直至考马斯亮蓝不再变色；

(8)向亲和柱中加入1×PBS Elution buffer，用于洗脱目的蛋白，使用考马斯亮蓝检测洗脱液中的目的蛋白，将蛋白收集至1.5mL预冷的离心管中；

(9)将蛋白转至预先处理过的透析袋中夹紧，放入透析液内，于4℃下过夜透析；

(10)将透析过的蛋白吸出，进行SDS-PAGE检测，结果见说明书附图4，a图第一泳道为蛋白Marker(M)，二、三泳道为经分离纯化得到的Tce1蛋白(Tce1)；b图第一泳道为蛋白Marker(M)，第二泳道为胞内对照，第三、四泳道为经分离纯化得到的Tce2蛋白(Tce2)，二者的条带大小均正确，说明Tce1和Tce2蛋白纯化成功，分装至离心管内，置于-80℃存放。

体外DNA酶活验证：

(1)配体系：

表5 DNA水解反应体系

(2)将反应体系置于37℃恒温培养箱45min；

(3)将样品按照十分之一加入10×loading buffer后，全部点于琼脂糖凝胶胶孔中，100V电压跑DNA凝胶电泳后，用紫外成像仪观看结果，结果见说明书附图5，a图第一泳道为DNA Marker(M)，第二泳道为阴性对照(-)，第三泳道为阳性对照(+)，第四泳道为野生型Tce1蛋白实验组(WT)，五、六泳道为S8A&A16E点突的Tce1蛋白实验组(S8A&A16E)；b图第一泳道为阴性对照(-)，第二泳道为阳性对照(+)，3-5泳道为不同浓度野生型Tce2蛋白实验组(WT)，6-8泳道为不同浓度E17A点突的Tce2蛋白实验组(E17A)，可见与阴性对照相比，WT实验组无论是λ-DNA还是pUC19质粒均出现了明显的降解，并且随着野生型蛋白的增加，降解效果愈发明显，说明野生型Tce1和Tce2蛋白具有DNA酶活性，而S8A&A16E点突的Tce1蛋白和E17A点突的Tce2蛋白则不具有DNA酶活性。

蛋白进入细菌验证：

(1)将马来酰亚胺荧光分子(AF488)用二甲基亚砜(DMSO)溶解至终浓度为10mM，分装在PCR小管中，-20℃避光保存；

(2)37℃、220rpm下振荡培养细菌，直至OD

(3)取50μL菌液置于EP管内，向其中加入420μL Z buffer(40mM磷酸二氢钠、100mM磷酸氢二钠、1mM硫酸镁、10mM氯化钾、0.54％(V/V)β-巯基乙醇)，20μL氯仿，10μL SDS(0.1％)，利用涡旋仪充分混匀后，30℃静止30min，保证细菌被充分裂解；

(4)向重悬后的菌液中分别加入Tce1-AF488和Tce2-AF488，避光孵育30min，使用M9溶液洗菌3次，完全洗去多余没有结合的荧光分子，避免因为染料的干预对实验造成假阳性；

(5)制样后将样品置于高速转盘式激光共聚焦下，使用100倍油镜对细菌的外膜结合情况进行观看，荧光通道选用FITC，结果见说明书附图6，可见在WT(野生型)菌株中，能够明显看到绿色荧光，说明Tce1和Tce2蛋白能够进入细菌细胞。

构建枯草芽孢杆菌重组表达载体：

将tce1基因片段和tce2基因片段分别与pWB980载体连接，方法参考前文。

连接产物转化枯草芽孢杆菌BS168，具体如下：

(1)挑取枯草芽孢杆菌BS168的单菌落，于5mL液体LB培养基中37℃培养过夜；

(2)取100μL培养过夜的菌液转接入5mL液体GM培养基中，以37℃、220rpm培养至OD

(3)在4℃下将全部菌液以5000rpm离心3min收菌，用1mL左右预冷的ETM电转缓冲液重悬菌体，以5000rpm离心8min洗涤3次；

(4)洗涤结束后，补加300μL的ETM电转缓冲液，悬浮分装至100μL/管；

(5)在制备好的枯草芽孢杆菌BS168电击转化感受态细胞中加入全部连接产物或pWB980质粒，冰浴5min，转移至预冷的电转杯中；

(6)将电转杯放入电转仪中，进行电转(1.8kV-2.0kV)；

(7)电转结束后将菌液吸出，加入1mL RM液体培养基，以37℃、200rpm培养复苏3h；

(8)以4500rpm离心3min收集菌体，弃去部分上清液，留约100μL重悬菌体，涂布Km抗性的LB固体培养基，37℃下过夜培养。

进行菌落PCR验证，方法参考前文。

小鼠体内作用：检测携带pWB980-tce1重组载体和pWB980-tce2重组载体的枯草芽孢杆菌BS168在小鼠体内的作用结果，具体如下：

(1)将正确的带有pWB980空载体的枯草芽孢杆菌BS168(以下简称为pWB980组)和带有pWB980-tce1重组载体的枯草芽孢杆菌BS168(以下简称为pWB980-tce1组，图8)、带有pWB980-tce2重组载体的枯草芽孢杆菌BS168(以下简称为pWB980-tce2组，图9)分别接种于加入Km抗生素的5mL液体LB培养基中，在37℃下培养过夜；

(2)取1mL培养过夜的菌液转接入50mL液体LB培养基中，以37℃、220rpm培养至OD

(3)将全部菌液以5000rpm离心3min收菌，用15mL左右的PBS缓冲液重悬菌体，以5000rpm离心3min洗涤3次；

(4)洗涤结束后，补加4mL的PBS缓冲液，重悬菌体；

(5)将PBS缓冲液组、pWB980组、pWB980-tce1组和pWB980-tce2组分别通过灌胃的方式将对应的菌液投递至预先感染某种耐药致病菌的小鼠(BALB/c，六周龄雌性鼠)体内；

(6)24h及48h后，取小鼠盲肠研磨涂板，对耐药致病菌进行计数，结果见说明书附图7，可见PBS缓冲液组和pWB980组中的大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌的CFU基本一致，而在表达Tce1和Tce2蛋白的pWB980-tce1组和pWB980-tce2组，大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌的CFU显著下降，证明利用枯草芽孢杆菌表达Tce1和Tce2蛋白能够有效治疗大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌的感染。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的相关人员在本发明介绍的技术范围内，对技术方案进行的简单变化或等效替代均落入本发明的保护范围内。

核苷酸序列表电子文件

<110>西北农林科技大学

<120>假结核耶尔森氏菌效应蛋白及其应用

<160>4

<210> 1

<211>67

<212>PRT

<213>Tce1氨基酸序列

<400> 1

MSGELDRSSASEWAFAIIDDDHIRVSDQVVWKVLQCLGGADLPITDREYLYEKEDFNCWLNEIDSHE 67

<210>2

<211>204

<212>DNA

<213>Tce1核苷酸序列

<400>2

ATGTCAGGGGAACTTGACCGCTCAAGCGCCTCTGAATGGGCGTTTGCAAT 50

AATTGATGATGATCACATTCGAGTAAGCGATCAGGTTGTTTGGAAAGTAC 100

TTCAATGCTTGGGGGGAGCAGATTTACCGATAACTGACAGGGAGTATTTA 150

TATGAAAAAGAAGACTTTAATTGCTGGCTCAACGAAATTGACTCACATGAGTAA 204

<210> 3

<211>81

<212>PRT

<213>Tce2氨基酸序列

<400> 3

MKPLDQNITYGQARGYEQFYIDEFGTKTGVRGDDISPMNRGNKINSYDSNSTTRDPIRQQYFDDAYDSKKSGTSSKGGGGC 81

<210>4

<211>246

<212>DNA

<213>Tce2核苷酸序列

<400>4

ATGAAACCGTTAGATCAGAATATTACATATGGTCAAGCTCGTGGCTATGA 50

GCAGTTTTATATTGATGAGTTTGGAACCAAAACTGGGGTGAGGGGAGATG 100

ATATATCACCAATGAATCGAGGAAATAAAATAAACTCCTACGATAGTAAT 150

AGTACAACTCGTGATCCAATAAGACAGCAATATTTTGATGATGCTTATGA 200

TAGTAAGAAAAGTGGTACGAGCTCAAAAGGTGGCGGAGGATGTTAA 246