一种基于碳量子点的比率计荧光探针的乐果快速检测方法

技术领域

本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种基于碳量子点的比率计荧光探针的乐果快速检测方法。

背景技术

乐果是一种中等毒性的内吸性有机磷杀虫、杀螨剂。凭借其易使用、药效持久及易降解等特点被广泛使用于防治多种作物上的刺吸式口器害虫，如蚜虫、叶蝉、粉虱、潜叶性害虫及某些蚧类害虫，对保证粮食安全生产，推动农业经济发展做出了巨大贡献。但是长期大量或不规范使用乐果，不仅严重破坏了生态系统，还对人类的健康造成了巨大威胁。因此，发展快速灵敏的乐果农药残留检测新技术和新方法，加强对农产品、环境样品农药残留的监测，对于保证食品安全及保护生态环境均具有重要的理论和现实意义。

由于色谱法自带分离功能且具有高检测通量方面优势显著，特别是色谱技术耦合现代化的检测器，是目前检测乐果的主流技术。然而色谱技术不仅仪器昂贵、检测费时，而且对操作人员的要求比较高，无法实现即时检测，而即时检测手段在紧急事件的处理中显得尤为重要。而现有的基于生物技术构建的快速检测方法，则需要进口试剂盒，存在原材料获取困难等问题，虽然大多数快速检测方法的经济成本低，但是研究耗时长，并且大部分快速检测方法只能实现定性或者半定量检测，短时间内无法得到推广使用。因此，依然需要开发一种简单、快捷、廉价、灵敏的方法应用于农产品中农药的检测。

荧光检测技术能够迅速、高灵敏地对目标检测物作出响应，且操作简单，价格低廉，尤其是近年来随着纳米技术的快速发展，荧光检测技术已经受到了越来越多学者的关注。目前在乐果等有机磷农药的荧光检测中，多是利用有机磷农药对胆碱酶、络氨酸酶等的抑制作用来构建荧光传感器，如CN107607507A公开了一种有机磷农药残留的荧光检测方法，该方法基于脲酶抑制体系，利用聚合物量子点作为荧光探针，检测果蔬中的有机磷农药。然而，生物特异性酶价格昂贵，保存与使用的条件苛刻，在实际使用中容易失活而导致假阳性信号。CN110412005A公开了一种基于适配体调控碳点荧光的乐果农药检测方法，该方法应用的碳点作为信号分子，纳米银作为淬灭剂，并结合适配体技术，可在溴丙磷、啶虫脒等众多干扰物质中特异性地检测出乐果。但是该方法检测体系复杂，以及用到的适配体为生物活性物质，容易失活，价格较高，使得检测成本高。

比率计荧光探针因其具有高灵敏度、操作简单、对目标物的响应时间短等优势，且该法同时关注两个不同荧光团的信号变化，对两个信号进行归一化处理或者以它们的比值作为输出信号，相当于引入了一个内标，因此可以在一定程度上消除仪器噪音和环境的干扰，提高方法的准确度，在农药残留的检测中备受关注。由于比率计荧光探针需要同时关注两个以上的荧光信号变化，因此，常规的做法是同时引入两个不同的荧光团，这样的策略是可行的，但是引入不同的荧光团无疑增加的实验的操作，且引入的不同荧光团可能会相互拮抗，影响彼此的荧光效果。因此，针对单一荧光团的比率计荧光探针将更具优势。尽管基于单一具有双发射性质的荧光团构建比率传感器也有报道，但已报道的荧光传感器几乎都集中在发射光谱上，基于激发光谱的荧光传感器很少报道，更不用说基于激发光谱的比率式荧光传感器了。

对目标物有机磷农药乐果实现快速、灵敏、准确地检测是现代农药残留分析的发展方向。针对上述存在的问题，本发明提供一种基于单一荧光团的免酶标比率计荧光探针应用于有机磷农药乐果的快速检测。其无需酶标、操作简单、绿色环保、响应快捷且选择性好、重现性好、灵敏度高，为其他有机磷农药新型检测技术的发展提供了新的参考。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种基于碳量子点的比率计荧光探针的乐果快速检测方法，该方法可快速、灵敏、准确地检测出果蔬样品中乐果的浓度，无需酶标、无需外加荧光团、操作简单、绿色环保、响应快捷且选择性好、重现性好、灵敏度高。

本发明通过以下技术方案实现：

一种基于碳量子点的比率计荧光探针的乐果快速检测方法，以荧光碳量子点作为唯一的荧光团，根据激发峰强度比值与乐果的浓度之间的线性关系，建立标准曲线，实现对乐果快速检测；具体步骤如下：

(1)荧光碳量子点的合成：以木糖为碳源，碳酸氢铵为氮源，以水热法合成荧光碳量子点，将木糖和碳酸氢铵混合溶于去离子水中，室温下超声搅均匀，然后转移至四氟乙烯高压反应釜中进行反应，反应完成后冷却至室温，经过滤和透析，得到荧光碳量子点，并在低温环境下避光保存备用；

(2)标准曲线的建立：取15支干净的比色管，在每支比色管中加入30μL步骤(1)制备的荧光碳量子点和一定量的表面活性剂，然后在上述15支比色管中分别加入0、10、20、30、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900μL的1μg/mL的乐果溶液，定容，摇匀；固定发射波长为400～430nm，用荧光分光光度计扫描荧光激发光谱并记录其对应的荧光强度；以加入乐果前后330nm和238nm处荧光激发强度比值的差值[(I

(3)果蔬样品预处理：取果蔬样品进行榨汁，加入乙腈，充分搅拌后进行过滤，收集滤液，在滤液中加入氯化钠，剧烈震荡，在室温下静置，使水和乙腈分离，得到乙腈混合溶液；取乙腈混合溶液进行加热，并蒸发至近干，加入甲醇进行洗涤，收集洗涤液，经过滤，得到果蔬样品预处理液，在低温环境冷藏备用；

(4)果蔬样品中乐果含量的测定：取步骤(1)制备的荧光碳量子点，加入月桂酸和步骤(3)制备的果蔬样品预处理液，固定发射波长为400～430nm，用荧光分光光度计扫描荧光激发光谱并记录其对应的荧光强度；计算330nm和238nm处荧光激发强度比值的差值[(I

作为技术方案的优选，所述荧光团为具有双激发特征的荧光碳量子点，当固定发射波长为400～430nm时，荧光碳量子点在220～240nm和320～330nm各有一个激发峰。

作为技术方案的优选，所述荧光团对乐果的响应在1min内完成，且在60min内保持稳定。

作为技术方案的优选，所述荧光碳量子点呈现出良好的单分散性和球形，粒径为1.4～2.6nm，平均尺寸为2nm。

作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述乐果的浓度范围为2～100ng/mL和100～180ng/mL时，对应的线性回归方程分别为[(I

作为技术方案的优选，步骤(2)中，所述表面活性剂为聚乙烯醇、十二烷基苯磺酸钠、月桂酸、聚乙二醇中的一种或多种，浓度为0.1g/L，用量为0～300μL。

作为技术方案的优选，步骤(1)中，所述木糖和碳酸氢铵的质量分别为0.05～0.3g、0.5～2.5g。

作为技术方案的优选，步骤(1)中，所述反应为于160～210℃环境下反应3～16h。

作为技术方案的优选，步骤(1)中，所述过滤和透析为将反应后的溶液用0.22μm的滤膜进行过滤，收集滤液后用1000Da透析袋将上清液用水透析20～24h。

作为技术方案的优选，步骤(3)中，所述过滤为将洗涤液用0.22μm的滤膜进行过滤。

作为技术方案的优选，步骤(3)中，所述样品为火龙果、香蕉、苹果、梨、萝卜、白菜等水果和蔬菜样品。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

1、本发明利用碳量子点的双激发特性构建乐果的快速检测比率计荧光探针，可快速、灵敏、准确地检测出果蔬样品中乐果的浓度，无需酶标、无需外加荧光团、操作简单、绿色环保、响应快捷且选择性好、重现性好、灵敏度高，检测成本低，为其他类型农药的比率计荧光探针构建提供了新的策略。

2、本发明的基于碳量子点的比率计荧光探针对乐果显示出良好的选择性，常见的阴阳离子SO

3、本发明所提供的乐果的快速检测比率计荧光探针对乐果显示出快速的响应，可在1min内稳定，且稳定时间可保持在1h以上，反应效率快，稳定时间长，在乐果的快速检测中具有显著优势，这种即时检测方法在紧急事件的处理上具有很好的应用前景。

4、本发明的荧光碳量子点以木糖为碳源，碳酸氢铵为氮源，经简单的一步水热法制成，合成方法简单、绿色环保、稳定性好、荧光效率高，所用的木糖原料广泛存在于植物中，特别是在农产品的废弃部分中如玉米的穗轴、秸秆等含量很多，资源丰富，成本低廉。

附图说明

图1为荧光碳量子点的透射电子显微镜图(TEM)。

图2为荧光碳量子点粒径分布图。

图3为荧光碳量子点的激发及发射光谱图。

图4为乐果农药的检测原理示意图。

图5为荧光碳量子点238nm和330nm处荧光激发光谱对不同浓度乐果的荧光响应图。

图6为检测乐果农药的标准曲线图。

图7为荧光探针对乐果及其他干扰物质的荧光响应图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。

实施例1双激发型荧光碳量子点的制备

采用一步水热法合成碳量子点溶液，将0.2g木糖和1.5g碳酸氢铵溶于10mL去离子水中，室温下超声搅拌均匀，然后转移至100mL的四氟乙烯高压反应釜中，于180℃的烘箱中反应4h。反应完成后待反应釜冷却至室温，用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液后用透析袋(1000Da)将上清液用水透析24h，得到双激发型荧光碳量子点，将制备好的荧光碳量子点溶液于4℃环境下保存备用。

对实施例1所得碳量子点进行透射电子显微镜表征，如图1所示，图1为荧光碳量子点的透射电子显微镜图，由图1可见，本发明的氮掺杂型荧光碳量子点呈现出良好的单分散性和球形。图2为统计100个碳量子点的粒径，得出N-CQDs粒径分布图，得出其主要分布在1.4～2.6nm范围内，平均尺寸为2nm。

图3为荧光碳量子点的激发及发射光谱图，由图3可知，当固定发射波长420nm时，本发明的双激发型型荧光碳量子点在235nm和327nm左右出现两个激发峰，分别对应于sp

实施例2乐果农药的比率型荧光探针构建

取15支干净的比色管，将30μL实施例1所制得的荧光碳量子点，150μL月桂酸与0、10、20、30、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900μL的乐果标准溶液(1μg/mL)分别加入到一系列的比色管中，用pH为6的水溶液定容至5mL，摇匀。固定发射波长400～430nm，用岛津RF5301 PC型荧光光度计在220～400nm范围内扫描激发光谱，记录238nm和330nm左右的荧光强度I

图4是乐果农药的检测原理示意图。图5为荧光碳量子点238nm和330nm处荧光激发光谱对不同浓度乐果的荧光响应图。根据图4和图5，以木聚糖和碳酸氢铵为原料采用一步水热法制备了荧光碳量子点。所制备荧光碳量子点在具有双激发特性，即在固定发射波长400～430nm时，两个激发峰分别位于238nm和330nm。加入乐果后，238nm处的激发峰在1min内被有效猝灭，而330nm处的激发峰则变化不大。乐果加入前后330nm处的激发峰强度与238nm处激发峰强度的比值的差值[(I

图6为检测乐果农药的标准曲线图，由图6可知，所建立的比率计荧光探针检测乐果的浓度范围为2～100ng/mL和100～180ng/mL，对应的线性回归方程分别为[(I

实施例3乐果快速检测比率计荧光探针响应时间及稳定性考察

取1支干净的比色管，在比色管中加入30μL实施例1所制得的荧光碳量子点，150μL的0.1g/L月桂酸和200μL的1μg/mL乐果标准溶液，定容5mL，摇匀。固定激发波长400～430nm，在0、0.5、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60min内用岛津RF5301 PC型荧光光度计扫描碳量子点的激发光谱，计算(I

实验结果表明，乐果与碳量子点在1min内基本反应完成，且在60min内基本保持稳定。表明，本发明提供的乐果比率计荧光探针反应效率快，稳定时间长，在乐果的快速检测中具有显著优势。

实施例4乐果快速检测比率计荧光探针选择性的考察

为验证本发明所构建的比率型荧光探针的选择性，本实施例考察常见的阴阳离子和其农药对其的影响。取21支干净的比色管，比色管中分别加入30μL实施例1所制得的荧光碳量子点，150μL的0.1g/L月桂酸，控制乐果的最终浓度为40ng/mL，再分别加入100倍的Ca

图7为荧光探针对乐果及其他干扰物质的荧光响应图。其中，A～U分别表示A:乐果(40ng/mL),B:Ca

由此可知，存在的一些常见的离子以和其他的农药，对乐果的检测影响很小，本发明的基于双激发碳量子点的乐果快速检测比率计荧光探针在无特异性酶标记的情况下依然对乐果显示出良好的选择性。

实施例5火龙果中乐果含量的检测

(1)火龙果样品预处理：称取10g火龙果放入均质机中，并加入20mL的乙腈，在榨汁机充分搅拌2min后用滤纸进行过滤，收集约16～20mL滤液装到50mL离心管中，并加入2.4g左右的氯化钠，盖上塞子，剧烈震荡2min，在室温下静置0.5h，使水和乙腈分离。用移液枪移取10mL的乙腈溶液至100mL的烧杯中，将烧杯放置在80℃的水浴锅中加热，并往烧杯缓缓通入空气流，在蒸发掉大部分液体后，加入2mL的甲醇，并将液体其转移至10mL的离心管中，再用3mL左右的甲醇冲洗三次烧杯，将洗涤液收集至离心管中，最后定容至5mL，并充分摇匀，于4℃冷藏备用。如定容后的溶液比较浑浊，可用0.2μm的滤膜进行过滤。

(2)火龙果样品中乐果含量的检测：乐果的加标浓度分别以0、4、20、100ng/mL加入火龙果样品中，经过对样品提取、净化后，用100μL制得的火龙果样品溶液进行检测，实验过程参照实施例2进行，每个样品的加标进行了3个平行实验，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

结果显示，在火龙果中未检测出乐果残留。在3次平行实验中，加标水平4,20,100ng/mL的平均回收率分别为102.24％、93.15％和92.55％，RSD分别为3.62、2.20和2.28。可见，所建立的比率计荧光探针在乐果的检测中不仅可以免酶标、方便、迅捷，还具有良好的准确度和精密度，在农产品和环境样品中乐果残留的检测中都显示出广泛的应用场景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。