一种基于扫描电镜定量比较农学试验处理间土壤团聚体特征的方法

技术领域

本发明涉及土壤学微形态技术领域，尤其涉及一种基于扫描电镜定量比较农学试验处理间土壤团聚体特征的方法。

背景技术

土壤团聚体是表征土壤结构的基本单元和重要参数，在一定程度上能反映农田生产力水平，体现农田质量。科学评价土壤团聚体特征对农艺技术措施的响应及其机制，对于采取科学的土壤管理实践，改善土壤健康状况具有重要的理论意义。

相对于传统光学显微镜下的土壤学研究方法，电子显微镜的分辨率(约0.2nm)远高于光学显微镜，已成为获得土壤团聚体信息的便捷工具。电子显微镜主要包括扫描电镜和透射电镜。学者们通过镜下观察，可获取土壤团聚体的孔隙类型及组成、团聚体形貌特征等信息，有助于进一步佐证已有的团聚体形成理论，甚至构建新的团聚体模型。

电子显微镜的放大倍数较小，但可呈现团聚体的三维立体结构，受到许多研究者的青睐。相关研究已在农业生产、土地利用及生态修复等方面取得大量成果。这些研究都已证实从土壤微形态角度揭示自然因素或人为因素造成土壤结构变化的相关机理。但是，由于微形态研究技术涉及到的专业领域有限，基于扫描电镜的土壤微型态研究仍停留在定性研究阶段，在农学试验中不同处理之间无法进行定量比较，因此扫描电镜在土壤学领域应用十分薄弱。此外，传统方法中采用树脂、戊二醛与多聚甲醛等固定土壤团聚体，这种方法较复杂，且会对团聚体特征的准确性产生一定的影响，无法得到完整的单个团聚体的形态特征。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于扫描电镜定量比较农学试验处理间土壤团聚体特征的方法。本发明提供的方法能够采用扫描电镜对农学试验处理间土壤团聚体进行定量分析，且能在土壤团聚体高度分离的情况下，定性观测完整单个土壤团聚体的微观结构特征。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于扫描电镜定量比较农学试验处理间土壤团聚体特征的方法，包括以下步骤：

(1)将不同处理组的土壤分别风干后过筛，得到不同处理组的待测土壤样品；对不同处理组的待测土壤样品分别进行取样，并将所取的土壤样品粘在双面胶带上单层平铺固定，双面胶带的另一面粘在扫描电镜样品台上，采用离子溅射仪对双面胶带表面的土壤样品进行镀金；

(2)采用扫描电镜对镀金后的土壤样品进行观测，每个处理组的土壤样品拍摄一张包含该处理组所有土壤颗粒的全局图像；然后放大标尺，分别对每个处理组的土壤样品所占区域的不同部位进行观测并拍照，得到各个处理组土壤样品不同部位的图像；

(3)参照各个处理组的全局图像，采用修图软件将各个处理组土壤样品不同部位的图像进行拼接，得到各个处理组的拼接图像；

(4)采用Nano Measurer软件对所述各个处理组的拼接图像进行定量分析，统计每个处理组中土壤团聚体的数量和粒径。

优选的，所述步骤(1)中，风干后还包括：将风干后的土壤按裂纹扳开，然后再进行过筛；所述过筛用筛网的孔径为2～3mm，过筛后，取筛下物为待测土壤样品。

优选的，所述步骤(1)中，取样用工具为取样针；每个处理组的待测土壤样品的取样量为0.0100g～0.0500g。

优选的，所述步骤(2)中，全局图像的标尺为50μm～100μm；各个处理组土壤样品不同部位的图像的标尺为200μm～1000μm。

优选的，所述步骤(2)中，对每个处理组的土壤样品所占区域的不同部位进行观测时，还包括记录观测到的单个团聚体的结构特征，将不同处理组的土壤样品中的团聚体进行定性比较。

优选的，所述步骤(3)中，修图软件为Photoshop软件，拼接时，使用软件中的套索共聚去除重复部分和杂点。

优选的，所述步骤(4)中，定量分析的方法具体包括：在Nano Measurer软件中依次打开各个处理组的拼接图像，将Nano Measurer软件中的标尺设置为和拼接图像中的比例尺相同，在软件中目测出土壤团聚体的数量，并在各个土壤团聚体的最大直径上划线，然后查看统计报告并输出统计结果。

优选的，得到每个处理组中土壤团聚体的数量和粒径后，还包括将所得数据进行方差分析，比较不同处理组之间的差异。

优选的，所述方差分析用软件包括SPSS软件或SAS软件。

有益效果：

(1)传统方法测试土壤团聚体的微观形态时，是采用树脂将土壤颗粒包裹，之后打磨出一个镜面进行观察，仅能观察出土壤团聚体之间孔隙情况，但是无法得到完整的单个团聚体的形态特征；本发明采用的方法无需采用树脂包裹土壤颗粒，无需复杂的前处理，直接将风干过筛后的土壤样品固定在双面胶带上进行观测，土壤颗粒在微观视野中呈现高度分离，能清晰的观察到土壤团聚体的微观结构特征。

(2)本发明提供的方法先拍摄土壤样品的全局图像，然后放大标尺拍摄土壤样品不同部位的图像，再以全局图像为参照，将不同部位的图像进行拼接，之后根据拼接图像，采用Nano Measurer软件对不同处理组之间团聚体数量和粒径等特征进行定量分析。传统的扫描电镜法研究土壤微型态仍停留在定性研究阶段，本发明提供的方法能够实现对不同处理间的团聚体的定量分析，弥补了应用扫描电镜量化团聚体特征方法的缺失，促进了扫描电镜法在土壤学领域的应用，本发明提供的方法可以科学评价土壤团聚体特征对农艺技术措施的响应及其机制，为采取科学的土壤管理实践、改善土壤健康状况提供重要的理论依据。

(3)本发明采用Nano Measurer软件对拼接图像进行定量分析，Nano Measurer软件可识别的土粒最小直径为0.01μm，而传统宏的观筛分法无法对粒径<0.25mm的土壤团聚体进行细化分析，本发明的方法弥补了传统宏观筛分法的不足，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中土壤颗粒在200μm标尺下的局部图像；

图2为实施例1中利用Photoshop软件对局部图像进行拼接时的示意图；

图3为实施例1中采用Nano Measurer软件量化土壤团聚体数量和粒径的示意图；

图4为实施例1中农学试验不同处理间团聚体数量的定量比较结果；

图5为实施例1中农学试验不同处理间团聚体粒径的定量比较结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于扫描电镜定量比较农学试验处理间土壤团聚体特征的方法，包括以下步骤：

(1)将不同处理组的土壤分别风干后过筛，得到不同处理组的待测土壤样品；对不同处理组的待测土壤样品分别进行取样，并将所取的土壤样品粘在双面胶带上单层平铺固定，双面胶带的另一面粘在扫描电镜样品台上，采用离子溅射仪对双面胶带表面的土壤样品进行镀金；

(2)采用扫描电镜对镀金后的土壤样品进行观测，每个处理组的土壤样品拍摄一张包含该处理组所有土壤颗粒的全局图像；然后放大标尺，分别对每个处理组的土壤样品所占区域的不同部位进行观测并拍照，得到各个处理组土壤样品不同部位的图像；

(3)参照各个处理组的全局图像，采用修图软件将各个处理组土壤样品不同部位的图像进行拼接，得到各个处理组的拼接图像；

(4)采用Nano Measurer软件对所述各个处理组的拼接图像进行定量分析，统计每个处理组中土壤团聚体的数量和粒径。

本发明将不同处理组的土壤分别风干后过筛，得到不同处理组的待测土壤样品；对不同处理组的待测土壤样品分别进行取样，并将所取的土壤样品粘在双面胶带上单层平铺固定，双面胶带的另一面粘在扫描电镜样品台上，采用离子溅射仪对双面胶带表面的土壤样品进行镀金。在本发明中，所述风干优选为自然风干，风干后，优选将所得风干后的土壤按裂纹扳开，然后再进行过筛；所述过筛用筛网的粒径优选为2～3mm，过筛后，取筛下物为待测土壤样品。本发明通过风干和过筛，得到混合均匀且高度分离的土壤颗粒。

在本发明中，所述取样用工具优选为取样针，在本发明的具体实施例中，优选先将双面胶带置于万分之一天平上，然后采用取样针粘取待测土壤样品，轻轻转动使土壤样品全部粘在胶带上单层铺平固定，保证团粒结构不受损伤，之后读取天平读数。在本发明中，每个处理组的待测土壤样品的取样量优选为0.0100g～0.0500g，在本发明的具体实施例中，因在农学试验中各个处理之间需进行相互比较，因此首先必须确保上机观测的土壤样品质量是相等定量的。

取样完成后，将固定有土壤样品的双面胶带粘在扫描电镜样品台上，采用离子溅射仪对双面胶带表面的土壤样品进行镀金。在本发明中，所述镀金的时间优选为5秒，效果不好可重复镀金。本发明对所述镀金的具体操作方法没有要求，采用扫描电镜仪自带的离子溅射仪，按照本领域技术人员熟知的方法进行镀金即可。

镀金完成后，本发明采用扫描电镜对镀金后的土壤样品进行观测，每个处理组的土壤样品拍摄一张包含该处理组所有土壤颗粒的全局图像；然后放大标尺，分别对每个处理组的土壤样品所占区域的不同部位进行观测并拍照，得到各个处理组土壤样品不同部位的图像。在本发明中，所述全局图像的标尺优选为50～100μm；所述各个处理组土壤样品不同部位的图像的标尺优选为200～1000μm。本发明先拍摄全局图片，用于在后续的拼接过程中作为参照。在本发明的具体实施例中，放大标尺后，土壤样品在微观视野中呈现高度分离，每个土壤样品只能显示部分区域，因此在拍照时，逐渐移动扫描电镜的滚动球，对每个土壤样品所占区域的不同部位进行拍照，保存图片，确保区域内的每个部位都拍到。

在本发明中，对每个土壤样品所占区域的进行不同部位进行拍照时，还包括记录观测到的单个团聚体的结构特征，将不同处理组的土壤样品中的团聚体进行定性比较。

得到各个处理组土壤样品不同部位的图像后，参照各个处理组的全局图像，采用修图软件将各个处理组土壤样品不同部位的图像进行拼接，得到各个处理组的拼接图像。在本发明中，所述修图软件优选为Photoshop软件，具体的，在拼接时，优选先在Photoshop软件中展开画布，导入相同处理组土壤样品不同部位的电镜图像，利用套索工具和画笔工具去除重复部分和杂点，调整到适宜的亮度和清晰度后，参照该处理组的全局图像进行拼接，拼接完整后导出保存。

得到各个处理组的拼接图像后，本发明采用Nano Measurer软件对所述各个处理组的拼接图像进行定量分析，统计每个处理组中土壤团聚体的数量和粒径。在本发明中，所述定量分析的方法具体包括：在Nano Measurer软件中依次打开各个处理组的拼接图像，将Nano Measurer软件中的标尺设置为和拼接图像中的比例尺相同，在软件中目测出土壤团聚体的数量，并在各个土壤团聚体的最大直径上划线，然后查看统计报告并输出统计结果；所述统计结果中包括团聚体的数量和粒径。在本发明中，设置Nano Measurer软件中的标尺的具体操作方法为：在拼接图像的比例尺下方划线，然后选择设置中的标尺选项，标尺实际长度一栏填写该电镜图像中比例尺显示的实际长度，标尺单位也与比例尺保持一致。在发明中，所述Nano Measurer软件可识别的土粒最小直径为0.01μm，软件识别精度满足方法需求。本发明在统计土壤团聚体时采用人眼识别后软件统计的方法，在本发明中，所述团聚体的具体的人眼识别判定标准为：土壤颗粒表面粗糙，附着有黏粒、腐殖质等物质，并与周边土粒存在一定连接关系，结构体孔隙发达、大小孔隙并存且分配合理的颗粒组团，满足上述标准可判定为团聚体。

在本发明中，得到每个处理组中土壤团聚体的数量和粒径后，还包括将所得数据进行方差分析，比较不同处理组之间的差异；所述方差分析用软件优选包括SPSS软件或SAS软件；在本发明的具体实施例中，优选先整理出Nano Measurer软件统计的每个处理组中土壤团聚体的数量和各个级别粒径的团聚体所占土粒总数的比例，然后将数据导入SPSS或SAS软件，定义变量后，进行方差分析，比较不同处理间的差异。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例采用的扫描电镜型号为Hitachi-S3400N,Japan，SE分辨率为3.0nm(30kV)，BSE分辨率为4.0nm(30kV)，放大倍数为5～300000倍，成像富有立体感。

农学试验设计：2020年在河西走廊荒漠绿洲灌溉区，7月春小麦收获后复种豆科绿肥，10月绿肥开花期设置不同还田方式，还田深度均为30cm。翌年4月春播前每个小区取30cm垂直剖面土壤，从上部开始，每10cm作为一个层次，取土壤原状土，每个小区随机取5个点，自然风干后，按土壤裂纹扳开，轻轻摇动过2mm筛，将高度分离的土壤颗粒混合均匀，准备制作扫描电镜土壤样品。试验设置5个处理，每个处理3个重复，小区面积54m

表1试验处理及代码

将双面胶带放置于万分之一天平上，用取样针粘取上述过筛后的土壤样品，轻轻转动使其全部粘在胶带上单层铺平固定，每个处理的每个生物学重复均称取0.0100g土壤样品，确保每个处理样品质量是相等定量的，之后将双面胶带的另一面粘在扫描电镜样品台上，固定后采用离子溅射仪(VD-MSP-1S,Japan)镀金。

使用扫描电镜对镀金后的土壤样品进行观察，先在50μm标尺下拍摄各组土壤样品的全局照片，然后将土壤样品放大到200μm标尺下扫描观测并拍照。土壤颗粒在微观视野中呈现高度分离，每个土壤样品只显示部分区域，因此在拍照时，逐渐移动扫描电镜的滚动球，对每一个土壤样品所占区域内的不同部位进行观测并拍照，保存图片，观测过程中、记录单个团聚体的微观结构特征。土壤颗粒特征在200μm标尺下的局部图像如图1所示。

参照50μm下的全局照片，采用Adobe Photoshop CS6软件对每个处理的土壤样品的所有局部图像进行拼接，用软件中套索工具去除重复的部分和杂点，确保完整性和清晰度，得到拼接图像；图2为利用Photoshop软件对局部图像进行拼接时的示意图；

将拼接好的图像依次导入Nano Measurer1.2软件中，在比例尺的下方划线,然后选择设置中的标尺选项，标尺实际长度一栏填写该电镜图像中比例尺显示的实际长度,标尺单位也与比例尺保持一致(标尺单位为μm，标尺为200)，在软件中目测出土粒最大直径后，在土壤颗粒的最大直径上依次划线，然后查看统计报告(主要包含团聚体数量和粒径)并输出统计结果。图3为采用Nano Measurer软件量化土壤团聚体数量和粒径的示意图。

将Nano Measurer软件统计的数据进行整理，所述数据包括每个农学处理条件下3个生物学重复的团聚体数量和各个级别粒径组成所占土粒总数的比例；由于传统方法中对<0.25mm粒径团聚体细化分析的不足，其次因学术界没有建立适用于扫描电镜的团聚体分类标准，为便于分析，本研究团聚体粒级量化分级参考传统筛分法中美国制(USDA)土壤粒级分类标准，分为<0.05mm、0.05～0.1mm、0.1～0.25mm和0.25～0.5mm 4个级别。整理后的数据见图4～图5，其中图4为农学试验不同处理间团聚体数量的定量比较结果，图5为农学试验不同处理间团聚体粒径的定量比较结果。

将上述整理的数据导入SPSS 19.0软件，定义变量后，进行单因素(one-wayANOVA)方差分析、Duncan法进行多重比较(α＝0.05)，比较不同处理间的差异。

通过上述分析过程得到以下结果：

1)单个团聚体形态特征：通过扫描电镜观察发现，CT处理中，土壤颗粒大多为粒径在0.05～0.1mm之间以单粒为基础的极细砂粒，多数呈椭圆形、形状规则，表面光滑、团聚体数量较少，NTG处理中以单粒存在的土壤颗粒粒径小于CT，主要为极细砂粒(0.05～0.1mm)和粉、黏粒(<0.05mm)构成粒径较大的土壤团聚体，团聚体表面凹凸不平，粗糙多孔，附着有大量粉粒和黏粒。

2)团聚体数量：如图4所示，绿肥全量还田较根茬还田有效促进了非团聚体向团聚体转化。0～10cm土层，绿肥全量还田(TG、NTG)条件下团聚体数量较CT提高33.1％、52.3％，根茬还田(NT、T)较CT提高10.7％、13.2％。10～20cm土层，绿肥全量还田(TG、NTG)条件下，团聚体数量较CT提高57.4％、22.6％，T较CT提高24.9％。20～30cm土层，绿肥全量还田(TG、NTG)条件下，团聚体数量较CT提高32.1％、51.1％，根茬还田(NT、T)较CT提高18.4％％、6.1％。以上结果表明，与不复种绿肥翻耕休闲相比，绿肥全量还田条件下，绿肥地表覆盖免耕或全量翻压均可提高玉米农田0～30cm土壤团聚体数量，且效果优于根茬还田。

3)团聚体粒径组成：如图5所示，CT条件下，农田团聚体粒径主要集中在0.05～0.1mm之间，<0.25mm，为小团聚体。绿肥还田处理主要提高了0.1～0.25mm粒径团聚体数量。0～10cm土层，绿肥全量还田(NTG、TG)和CT、相比，0.1～0.25mm粒径团聚体分别增加了33.3％、30.8％；NT与CT相比，0.1～0.25mm粒径团聚体提高了50.0％；10～20cm土层，绿肥全量还田(NTG、TG)下，0.1～0.25mm团聚体数量较CT分别提高32.1％、41.7％，T较CT提高42.9％；20～30cm土层，NTG在0.1～0.5mm团聚体数量较CT提高33.3％，TG较CT无显著差异，NT较CT提高13.3％。综上表明，在荒漠绿洲农业区，与传统不复种绿肥相比，绿肥全量翻压或地表覆盖免耕能够有效提高农田0～30cm土层土壤中0.1～0.25mm粒径较大团聚体的数量。

综上所述，本发明将扫描电镜技术(SEM)和Nano Measurer软件、Photoshop软件相结合，在土壤团聚体高度分离的情况下，直接定性观测原状土壤团聚体微观结构特征，在农学试验中，可定量比较分析不同处理之间团聚体数量和粒径等特征。此外，本方法可补充传统筛分法对<0.25mm粒径小团聚体细化分析的不足，具有广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。